Introduction
منذ ذلك الحين تم تطويره في منتصف عام 1990 SOD1-G93A نموذج الفأر وراثيا النموذج الحيواني الأكثر استخداما على نطاق واسع من التصلب الوحشي الضموري (ALS) 1. تم تصميم هذا النموذج الماوس المعدلة وراثيا وراثيا لبإفراط عن شكل متحولة من البشر النحاس / الزنك الفائق 1 (SOD1) الجين إيواء الجلايسين ALS المصاحب لطفرة ألانين في الأحماض الأمينية 93 (G93A). طفرة G93A هي واحدة من العديد من الطفرات في الجين SOD1 أن الماكياج بشكل جماعي ما يقرب من خمس حالات ALS العائلية 2.
أصبح نموذج SOD1-G93A العمود الفقري للبحوث تطوير الأدوية ALS لأنه بالإضافة إلى الارتباط الجيني واضح لALS، فإنه يلخص العديد من الميزات المرضية من ALS في البشر مثل المحرك فقدان الخلايا العصبية، وضعف العضلات التدريجي وضمور، مع نهائي الشلل والموت 3. رغم ذلك، كما هو الحال مع النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا في كثير من الأحيان، هناك ثنائية الأصيلتقلب استثارة المرتبطة الفئران SOD1-G93A. سكوت وآخرون. عقدت العزم على أن هناك حاجة إلى أفواج من 24 على الأقل الفئران متوازن بين الجنسين المطابقة القمامة في التصاميم دراسة نجاعة الأدوية من أجل التغلب على الضوضاء التي أنشأتها التغير البيولوجي 4. عدد كبير من الحيوانات المطلوبة في هذه الدراسات في تركيبة مع تطور المرض عدوانية وضرورة المتابعة اليومية يحظر استخدام تقنيات تستغرق وقتا طويلا وربما المجهدة متقنة لقياس قوة العصبية والعضلية وظيفة (على سبيل المثال، الكهربائي، قوة قبضة، rotorod ، وما إلى ذلك). بدلا من ذلك، يسلط الضوء على الحاجة إلى المجراة الفحص أداة تقييم موثوق وظيفة العصبية والعضلية الفئران SOD1-G93A بطريقة سريعة.
في ALS TDI وضع بروتوكول يسمح لتقييم موثوق من وظيفة العصبية والعضلية الفئران SOD1-G93A في أقل من 30 ثانية في الماوس في المتوسط. هذا encompa بروتوكولSSES التقييم اليومي وظيفة hindlimb باستخدام نظام بسيط للجهاز العصبي التهديف (NeuroScore) الذي يوصف في هذا التقرير في الصحافة والفيديو. وتركز NeuroScore على وظيفة hindlimb بسبب العجز hindlimb هي أقرب ذكرت إشارة عصبية من المرض في الفئران SOD1-G93A 5،6. وعلاوة على ذلك، فإن البروتوكول التي وضعتها ALS TDI يقدم تقييما غير متحيز للظهور شلل جزئي (شلل خفيف أو الجزئي) والتقدم وشدة الشلل وأنها حساسة بما فيه الكفاية لتحديد التغيرات الناجمة عن المخدرات في تطور المرض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وتجرى جميع التجارب وفقا للبروتوكولات التي وصفها المعاهد الوطنية للصحة الدليل للرعاية واستخدام الحيوانات وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان المؤسسي واستخدام ALS TDI و(IACUC).
1. الحيوانات، والإسكان، وتصميم الدراسة
ملاحظة: وقد اشتق الماوس مستعمرة SOD1-G93A من نسخة عالية B6SJLTgN (SOD1G93A) 1Gur سلالة تنتج في الأصل من قبل غرني 7 آخرون. ويجري حاليا الحفاظ على مستعمرة طريق عبور المعدلة وراثيا الذكور C57BL / 6-SJL مع من النوع البري الإناث C57BL / 6-SJL F1. يتم إنشاؤها الحيوانات F1 عن طريق عبور الذكور مع الإناث SJL B6. يتم شحن الفئران لأسبوعيا TDI ALS في 35-45 يوما من العمر.
- السماح الفئران واحدة على الأقل في الأسبوع ليتأقلم إلى منشأة الحيوان (12 ساعة ضوء / دورة الظلام عند درجة حرارة من 18-23 درجة مئوية، والرطوبة 40-60٪) قبل تعيين لدراسة.
- بيت الذكور SOD1-G93A هيئة التصنيع العسكريالبريد الماوس واحد في القفص، منذ كان يضم مجموعة من الذكور تميل للقتال. الفئران منزل الإناث SOD1-G93A ما يصل الى اثنين في القفص. توفير تخصيب البيئي، في شكل أكواخ بلاستيكية. توفير الغذاء والمياه الإعلانية بالمال وبالشهرة أيضا، إلا أن الفئران هي جزء من دراسة تتطلب إدارة المخدرات في مياه الشرب / الغذاء. في هذه الحالات، التموينية وسجل الغذاء والماء.
- بدء دراسة فعالية الدواء اليوم حوالي سن 50 سنة، وتشمل 64 يقابل القمامة المتوازن بين الجنسين الفئران (32 في الجماعة). أخيرا، تأكد من أن يتمكن الباحثون الذين يجرون الدراسات وأعمى لظروف تجريبية.
ملاحظة: من المستحسن أن تبدأ دراسة لفعالية الدواء نموذجية في اليوم سن 50 ولكن على أساس النوع من التدخل العلاجي أنه قد يكون من الأفضل أن تبدأ الدراسة في وقت سابق أو في وقت لاحق.
ملاحظة: الدراسة هو مدعوم من 32 الفئران في فوج للكشف عن آثار المخدرات على أساس نوع الجنس. إذا ليس هناك حاجة لإجراء مقارنات على أساس نوع الجنس، وينبغي أن 24 الفئران في فوج تكفي للكشف عن آثار المخدرات عموما.
2. وزن الجسم
- وزن الجسم قياسية لجميع الفئران في دراسات يوميا مع دقة عشر من الغرام. ملاحظة: وزن الجسم هو مؤشر حساس من تطور المرض وبأي توعك التي قد تنتج عن العلاج من تعاطي المخدرات المزمن.
- وزن الجسم الماوس تختلف إلى حد كبير خلال يوم واحد، كانت أعلى في الصباح، وبالتالي تسجل لهم في نفس الوقت تقريبا كل يوم.
3. العصبية نظام تسجيل النقاط (NeuroScore)
- أداء تقييم عشرات العصبية (NS) لكل فأر يوميا من خلال مراقبة الماوس وفقا للشروط الثلاثة التالية بالتتابع: أ) يتم تعليق الماوس بواسطة ذيله، ب) يسمح الماوس على المشي، وبعد ظهور شلل جزئي ج) يتم وضع الماوس على جانبها.
- لاختبار الذيل تعليق، مع الاستمرار على الماوس ما يقرب من 1.5 "من قاعدة الذيل على الجزء العلوي من سلك القفص وطنهم لمدة 1-2 ثانية، بعيدا عن حوض الطعام، في حين التوليدerving وhindlimbs. كرر الاختبار تعليق 3 مرات وتسجيل نتائج أكثر اتساقا.
- لاختبار المشي، ضع الماوس على سطح نظيف أن يوفر بعض الجر وعلى مسافة قريبة من 25 سم (على سبيل المثال، مسجلة منشفة ورقية لأسفل لمنع الانزلاق). السماح للماوس على المشي ما مجموعه 75 سم (طول 3X من منشفة ورقية) مع مراعاة مشية لها.
- ل"لا ارادي المقوم" اختبار، ضع الماوس على الجانب الأيسر أو الأيمن وباستخدام توقف ساعة قياس الوقت الذي يستغرقه لتصحيح نفسها دون مساعدة من كلا الجانبين. ملاحظة: تجربة واحدة فقط من هذا الاختبار هو مطلوب.
- تحديد NS كل hindlimb (اليمين أو اليسار) بشكل مستقل على مقياس من 0 إلى 4. ملاحظة: على سبيل المثال على درجة من 0، 1 يشير إلى أن hindlimb اليسار NS هو 0، بينما الصحيح hindlimb NS هو 1.
- تعيين عشرات العصبية (0-4) المقابلة ليلي مجموعة من الملاحظات (ملخص المنصوص عليها في الجدول رقم 1):
- تعيين NS 0 (قبل ظهور الأعراض) إذا لوحظ ما يلي: عندما يتم تعليق الماوس من ذيله، ويعرض hindlimb على تباعد العادي أي تمدد بشكل كامل بعيدا عن خط الوسط الأفقي ويبقى في هذا المنصب لمدة 2 ثانية أو لفترة أطول. عندما يسمح للماوس على المشي، لوحظ مشية طبيعية.
- تعيين NS 1 (الأعراض الأولى) إذا لوحظ ما يلي: عندما يتم تعليق الماوس من ذيله، ويعرض hindlimb وتباعد غير طبيعي، أي وانهارت أو جزئيا انهار نحو خط الوسط الجانبي أو فترتعد خلال الذيل تعليق أو يتم سحب ذلك / شبك. عندما يسمح للماوس على المشي، لوحظ مشية عادية أو بطيئة قليلا.
- تعيين NS 2 (بداية ظهور شلل جزئي) إذا لوحظ ما يلي: عندما يتم تعليق الماوس من ذيله، وhindlimb هو انهار جزئيا أو كليا، عدم تمديد بكثير. (قد يكون لا يزال هناك حركة المفاصل). عندما يسمح للماوس على المشي، يتم استخدام hindlimb ليذكره إلى الأمامايون إلا أن أصابع حليقة أسفل مرتين على الأقل خلال 90 سم مشيا على الأقدام أو أي جزء من القدم وسحب على طول أسفل القفص / الجدول. عندما يتم وضع الماوس على جانبها الأيسر والأيمن، وأنها قادرة على تصحيح نفسها في غضون 10 ثانية من كلا الجانبين.
- تعيين NS 3 (الشلل) إذا لوحظ ما يلي: عندما يتم تعليق الماوس من ذيله، وهناك شلل جامدة في hindlimb أو الحد الأدنى من حركة المفاصل. عندما يسمح للماوس على السير إلى الأمام هناك حركة لكن لا يتم استخدام hindlimb للحركة إلى الأمام. عندما يتم وضع الماوس على جانبها الأيسر والأيمن، وأنها قادرة على تصحيح نفسها في غضون 10 ثانية من كلا الجانبين. ملاحظة: نادرا، بعد ظهور شلل، قد يبدو البول الرطوبة على hindlimbs. تركت دون علاج رطوبة البول قد يؤدي إلى البول "الحرق" والآفات الجلدية. علاج البول الرطوبة عن طريق قص الشعر، وتطبيق تتسرب الماء الدافئ لإزالة البول، وصمة عار بلطف الجافة. إذا الآفات الجلدية موجودة تطبيق المضاداتمرهم التشنج.
- تعيين NS 4 (إنسانية نقطة النهاية) إذا لوحظ ما يلي: عندما يتم تعليق الماوس من ذيله، وهناك شلل جامدة في hindlimbs. عندما يسمح للماوس على المشي، لا يوجد أي حركة إلى الأمام. عندما يتم وضع الماوس على جانبها الأيسر والأيمن أنها ليست قادرة على تصحيح نفسها في غضون 10 ثانية من الجانب سواء. أي غياب المنعكس التقويمي.
4. دخول وتحليل البيانات
- أثناء دراسة فعالية الدواء، أدخل البيانات التي تم جمعها عن كل فأر في مختبر نظام إدارة المعلومات (LIMS) أو إلى برنامج جداول البيانات المتاحة تجاريا.
ملاحظة: LIMS البرمجيات المتقدمة TDI-ALS هو مستودع مركزي لجميع البيانات التي تم جمعها من الدراسات الداخلية، مما يجعل هذه البيانات يمكن الوصول إليها بسهولة مع مرور الوقت للمحققين ALS TDI. LIMS يتتبع أي فأر الفردية، مع ID فريدة من نوعها، والعودة إلى النسب، ووزن الجسم، أو النتيجة العصبية في جميع أيام الدراسة،ويشمل ذلك أي ملاحظات أخرى لاحظت أثناء ديمومته. LIMS يولد في نهاية المطاف جدول الذي يستخدم للتحليلات لاحقة. - عند الانتهاء من دراسة المخدرات فعالية، أي عندما تصل جميع الفئران إنسانية نقطة النهاية، والبرمجيات استخدام جداول البيانات (انظر الجدول من المواد) لحساب NS مجتمعة لكل الماوس، عن كل يوم عن طريق حساب متوسط hindlimb اليسار واليمين NS . بعد ذلك، حساب متوسط العمر في كل NS لكل الماوس وعدد الأيام تنفق كل الماوس في NS معين.
- تحليل التغيرات الشاملة في NS مع مرور الوقت عن طريق استيراد البيانات من برنامج جداول البيانات إلى البرنامج الإحصائي (انظر جدول المواد). تناسب هذه البيانات باستخدام نموذج الانحدار اللوجستي الترتيبي الذي يقدر المتوقع NS، مع متوسط العمر في NS والعلاج من تعاطي المخدرات عن الآثار في الانحدار. باستخدام سجل رتبة اختبار مربع كاي تقدير احتمال تأثير احتمال وتحديد ما إذا كان تأثير العلاج من تعاطي المخدرات في NS التقدم هو الإحصائيهام لاي (انظر ملف التعليمات البرمجية التكميلي للخطوة بخطوة تعليمات).
ملاحظة: يعتبر A-قيمة P <0.05 دلالة إحصائية.
ملاحظة: هذه الطريقة في التحليل الإحصائي يحترم طبيعة التراتبية البيانات NS والطبيعة المتغيرة لمسارات NS للفئران الفردية. يفضل بسبب الفردية مسارات NS يمكن أن تكون مختلفة بشكل ملحوظ مما أدى إلى NS المتوسطات مجموعة المرتبط الوقت الذي لا يعكس ردود NS بما فيه الكفاية. بالإضافة إلى ذلك، في بعض الحالات NS يمكن أن تتقلب، ولا سيما عندما تكون في نطاق صفر إلى واحد. - وأخيرا، استخدام البرمجيات الرسوم البيانية (انظر الجدول من المواد) لتوليد "ترتيبي المتوقعة NS مقابل متوسط العمر عند NS" الرسوم البيانية للحيوانات المعالجة المخدرات والسيطرة (الشكل 2، وانظر ملف التعليمات البرمجية التكميلي للخطوة بخطوة تعليمات). استخدام هذه الرسوم البيانية لتقدير ملائم التحولات بين المجموعات المعالجة المخدرات وسيطرة التحريف من المحور الصادي متوسط العمر من بداية ظهور أعراض المرض (ط.ه.، NS 2) على محور س.
ملاحظة: الفرق في متوسط العمر بين المجموعتين يمثل تحولا المخدرات التي يسببها ويتم التعامل كإجراء عملي لحجم تأثير.
ملاحظة: التحولات اليمين في NS مقابل منحنى متوسط العمر المتوقع تشير إلى تباطؤ تطور المرض أعراض. على العكس من ذلك، والتحولات نحو اليسار في NS مقابل منحنى متوسط العمر المتوقع تشير إلى تسارع تطور المرض أعراض.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
درس البيانات نتيجة العصبية لمدة 90 ذكور و 94 إناث الفئران غير المعالجة SOD1-G93A في ALS TDI خلال قيمت 2014. وأظهرت النتائج أن الفئران الذكور وعادة ما يكون تطور المرض أكثر عدوانية من إناث الفئران، كما يتضح من نسبة أكبر من حياتها في NS 1 مقارنة مع الإناث. NS 2 و 3 NS تحدث مع تردد يساوي تقريبا عبر الجنسين. NS 0 استبعد من التحليل لأنها تعتبر النمط الظاهري "طبيعية". تم استبعاد NS 4 أيضا لأنه من خلال تعريف أنه يمكن أن يحدث فقط مرة واحدة في حياة كل SOD1-G93A الفأر (الجدول 2 والشكل 1).
وتقدم البيانات NS من تقدم المرض دراسة فعالية الأدوية ALS اختبار مركب TDI173 في الفئران SOD1-G93A (ن = 16 في النوع الاجتماعي / العلاج؛ 64 مجموع الفئران). في الشكل 2، وتقدم معدل تطور المرض العصبي كما استولت عليها تحليل الانحدار ترتيبي البيانات جaptured باستخدام بروتوكول NeuroScore المفصلة هنا. وتمت مقارنة الفئران المعالجة TDI173 لسيارة معاملة السيطرة. لا إحصائيا لوحظت فروق ذات دلالة إحصائية عند تحليل الجنسين على حدة ولكن تم التوصل دلالة إحصائية عند تم دمج الجنسين. تحليل كابلان ماير من البقاء على قيد الحياة، حتى ولو تبين اتجاهات مماثلة كما في التحليل الإحصائي لوجستي ترتيبي، لم يكن حساسة بما يكفي للكشف عن اختلافات كبيرة حتى عندما تم دمج الجنسين (الشكل 3).
| NS 1 | يعرض hindlimb وتباعد غير طبيعي، أي وانهارت أو انهارت جزئيا نحو خط الوسط الجانبي أو فترتعد خلال الذيل تعليق أو يتم سحب عليه / شبك. | العادية أو أبطأ قليلا مشية. | NA |
| NS 2 | تم جزئيا أو كليا انهار hindlimb، لا تمتد كثيرا. هناك ربما الحادي والعشرينسوء تكون حركة المفاصل. | يتم استخدام hindlimb للحركة إلى الأمام إلا أن أصابع حليقة أسفل مرتين على الأقل خلال 75 سم مشيا على الأقدام أو أي جزء من القدم وسحب على طول أسفل القفص / الجدول. | الفأر هو قادرة على تصحيح نفسها في غضون 10 ثانية من كلا الجانبين. |
| NS 3 | شلل جامدة في hindlimb أو الحد الأدنى من حركة المفاصل. | الحركة إلى الأمام لكن لا يتم استخدام hindlimb للحركة إلى الأمام. | الفأر هو قادرة على تصحيح نفسها في غضون 10 ثانية من كلا الجانبين. |
| NS 4 | شلل جامدة في hindlimbs. | لا الحركة إلى الأمام. | الماوس ليست قادرة على تصحيح نفسها في غضون 10 ثانية من الجانب سواء. |
الجدول 1: ملخص الملاحظات المظهرية تستخدم لتعيين عشرات العصبية.
| تردد NS1 | تردد NS2 | تردد NS3 | ||||
| رجل | أنثى | رجل | أنثى | رجل | أنثى | |
| عدد من الفئران | 90 | 94 | 90 | 94 | 90 | 94 |
| الحد الأدنى | 12 | 5 | 1 | 1 | 0 | 0 |
| 25٪ | 29 | 16 | 4 | 4 | 0 | 0 |
| متوسط | 37 | 27.5 | 5 | 5 | 1 | 1 |
| 75٪ | 44 | 37.5 | 7.5 | 6.5 | 2.5 | 3 |
| أقصى | 61 | 60 | 28 | 11 | 8 | 9 |
الجدول 2: تحليل تواتر البيانات NS من الفئران غير المعالجة SOD1-G93A سجل يوميا من يوم سن 50 حتى الموت. تم حساب توزيعات NS 1 و 2 و 3.
الشكل 1. التمثيل البياني لعدد الأيام التي قضاها في كل NeuroScore غير طبيعي لكل الماوس من السكان من دون علاج الفئران SOD1-G93A في مستعمرة لدينا خلال 2014 (الذكور ن = 90، أنثى ن = 94). الترددات النتيجة لنفسه يتم تمثيل الفئران لكل NS الممكنة. تم حذف NS 4 لأن الحدث يمكن أن يحدث فقط مرة واحدة في العمر لكل الماوس عن طريق التعريف. الرجاء انقر هنا لعرض أكبر أصدارات ن من هذا الرقم.
الشكل 2 نموذجي ترتيبي اللوجستي تحليل الرسم البياني إحصائية مقارنة تطور المرض العصبي للفئران المعالجة TDI173 (خط أحمر) إلى القمامة يقابل السيطرة على الفئران المعالجة المركبة. (الخط الأزرق، وذكرت ف القيم تمثل تسجيل رتبة اختبار مربع كاي) الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الشكل 3 نموذجي كابلان ماير تحليل الرسم البياني مقارنة حياة الفئران المعالجة TDI173 (خط أحمر) إلى القمامة يقابل السيطرة على الفئران المعالجة المركبة (الخط الأزرق، وذكرت ف القيم تمثل تسجيل رتبة الاختبار).jove.com/files/ftp_upload/53257/53257fig3large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا التقرير، وصفنا بروتوكول الفيديو سريعة وبسيطة والتي، إذا ما طبقت بشكل صحيح، غير قادرة على تقييم موثوق تطور المرض في الفئران SOD1-G93A وتحديد التغيرات التي يسببها الدواء. بينما الجماعات المختلفة قد وضعت أنظمة التهديف المظهرية للفئران SOD1-G93A 10/08، فإنهم غالبا ما لا توفر تفاصيل كافية عن الإجراء وغير كافية للنسخ المتماثل. ونتيجة لذلك، نادرا ما تستخدم أنظمة التهديف خارج المجموعة المحددة التي يتطور بها. في هذا التقرير، فإن الجمع بين مخطوطة مفصلة مع الفيديو يقلل من الغموض تسجيل والتباين بين المجرب مما يسمح للبروتوكول الذي سيعتمده غيرها من المختبرات وتمكين مقارنات بين الدراسات التي تجري في ظروف مختلفة.
نظام التسجيل عصبي المبينة في هذا التقرير، ويشار إلى NeuroScore، يولد البيانات الترتيبية حيث القيم العددية الدقيقة ينسب إلى مجموعات من علامات وسيmptoms ليس لها معنى وراء تأسيس المركز شدة المرض. في هذه الحالة، NS 0 هو أقل الحالة المرضية الشديدة ويدل على الماوس مع وظيفة hindlimb طبيعية بينما NS 4 هي حالة المرض أشد مع الفئران في أو الاقتراب من الإصابة بالأمراض الثانوية إلى الأمراض العصبية والعضلية. على الرغم من أن نظام التسجيل يجعل من استخدام عتبات الأعراض، تشمل كل قيمة NS ترتيبي مجموعة واسعة من العروض السريرية المحتملة وكثير منها تم القبض على الفيديو والواردة في هذا التقرير.
NS 1 يشمل الطيف من الأعراض المبكرة للمرض في الفئران SOD1-G93A، والتي يمكن أن تختلف على نطاق واسع من الفأر إلى الماوس. بعض الفئران تبدي أي تباعد غير طبيعي مع hindlimbs انهيار نحو خط الوسط في حين أن البعض الآخر الهزات hindlimb وحتى بعض تظهر تراجع hindlimb أو الشبك. وعلاوة على ذلك، في المراحل المبكرة من المرض NS بعض الفئران قد تقلب لعدة أيام بين NS 1 0. وعلى الرغم دائما، في SOD1-G93A الفئران الترددمن NS 1 يزداد مع الوقت، وتضم أكثر وأكثر من الظواهر المختلفة الموصوفة. في المتوسط، من الذكور والإناث SOD1-G93A الفئران عادة تنفق 37 و 28 يوما على التوالي في هذه المرحلة.
NS 2 يمثل بداية خزل (شلل خفيف أو الجزئي) ويقدم دليلا لا يمكن إنكاره لوجود أمراض. في حين أنه من غير المألوف لمن النوع البري الماوس لفي بعض الاحيان كما NS 1، 2 NS يحدث فقط في الفئران SOD1-G93A. وعلى غرار NS 1، NS 2 يلتقط مجموعة من العلامات والأعراض. في عرض تقديمي في مرحلة مبكرة من NS 2 الفأر هو الإسعافية وحيوية. عرض أكثر تقدما من NS 2 يكشف عن الفأر مع قدرة محدودة للغاية للتحرك. شلل جزئي متقدمة في hindlimbs قد منع الفئران من الوصول إلى الغذاء والماء في الجزء العلوي من القفص، لذلك يجب أن توضع كريات الغذاء في الجزء السفلي من القفص أو ينبغي توفير الغذاء رطب. أيضا، يجب أن توضع أنابيب sipper أطول على زجاجات المياه. SOD1-G93A الفئران typicaLLY قضاء 5 أيام في هذه المرحلة.
NS 3 يدل hindlimb الشلل التام، وبكل المقاييس هو أسهل النمط الظاهري لتحديد والنتيجة. أعراض الشلل التي تشملها NS 3 قد يكون إما الرخو أو تشنجي، ولكن عادة ما تكون التشنجي. من خلال هذه النقطة، والفئران هي مريضة جدا ويجب أن تتم مراقبتها بشكل متكرر. في المتوسط، الفئران SOD1-G93A تنفق 1-2 أيام في هذه المرحلة.
NS 4 يدل على غياب "لا ارادي المقوم" التي لا تعتمد حصرا على وظيفة hindlimb مثل NS 0-3 لكن بدلا من ذلك يعكس العافية الجسم كله من الفأرة. القدرة على فأرة الحاسوب لإثبات العادي "لا ارادي المقوم" تتطلب الدافع والطاقة، ولكن أيضا وظيفة المجموعات العضلية متعددة بما في ذلك hindlimbs، الأمامية، والبطن. ومن المهم أن نلاحظ أن تطور المرض في هذه الفئران في كثير من الأحيان لا متناظرة والفأر التي يمكن أن يكمل بنجاح المنعكس المقوم عند وضعها على جانب واحد م عبد المنعم يوسف انه غير قادر على القيام بذلك عند وضعه على الجانب الآخر. ولذا فمن المهم، من أجل المعاملة الإنسانية للحيوانات وللسلامة من الدراسة، لأداء الاختبار على كلا الجانبين، والموت ببطء الماوس إذا فشلت في الحق نفسه في أي من الجانبين.
NS 4 يحدد تاريخ للقتل الرحيم وافتراضيا توائم بصورة مباشرة مع البيانات البقاء على قيد الحياة. ومع ذلك، فإن تطور المرض بشكل عام، كما تم تعريفها من خلال تحليل الانحدار ترتيبي NS، قد لا تتداخل تماما مع كابلان ماير منحنيات البقاء على قيد الحياة والبيانات وزن الجسم. التدخلات العلاجية معينة قد تؤثر على ظهور مرض أو أعراض، ولكن تفشل في التأثير على عمر العام.
في حين لم تناقش في العمق في هذا التقرير، يمكن وزن الجسم هي المقياس أخرى والتي يمكن استخدامها في تركيبة لNS لتقييم بدء المرض والتقدم في SOD1-G93A ومع ذلك فإنه يمكن انحرفت عن الاختلافات في النظم الغذائية والعلاجات التي تسبب وذمة أو النفوذ التمثيل الغذائي للدهون 11،12.
معشوقة = "jove_content"> أعظم أصول البروتوكول TDI ALS هو بساطته والتنفيذ السريع. وهذا يمكن أن يأتي على حساب عدم التقاط بعض الظواهر المرض. على سبيل المثال، في حالات نادرة الأعراض المرتبطة به إلى ALS في الفئران SOD1-G93A قد تظهر العجز الحركي كما فموي لساني وforelimb 13 وليس hindlimb العجز الحركي، النمط الظاهري التي لم يتم التقاطها بواسطة NeuroScore. قيود أخرى من هذا البروتوكول هو حقيقة أن تم تصميمه لوينطبق إلا على نسخة عالية الفئران SOD1-G93A. في تجربتنا، والأعراض السريرية للمرض في نماذج الفئران الأخرى من المرض، مثل نسخة منخفضة SOD1-G93A الماوس 14 أو TDP-43 الماوس 15،16، يختلف عنه في نسخة عالية الفئران SOD1-G93A وهذا النظام NS قد يكون غير ملائم لتلك النماذج. وبالتالي، فمن المهم تحديد عدد النسخ التحوير من الفئران قبل تكليفهم للدراسات والتحقق من أنه مساو لارتفاع نسخة السيطرة على الفئران إيجابية. بغض النظر، فإن فوائد لناجي هذا النظام التهديف العصبي تفوق حدودها وهذا البروتوكول الفيديو يمكن أن تكون بمثابة أداة تدريب ممتازة للباحثين ALS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6SJLTgN(SOD1G93A)1Gur strain | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 002726 | Strain of mice used in this study |
| Breeders | Biomedical Research Models, Inc., Worcester, MA | Colony maintainance | |
| Scale | Navigator OHAUS, Parsippany, NJ | Model N14120 | Used to weigh mice |
| Nutra-GelH | Bio-Serv, Flemington, NJ | #S4798 | Wet food provided to sick mice |
| Irradiated Lab Animal Diet | Harlan, Indianapolis, IN | 2918-111914M | Chow diet |
| Lab-grade Sani-chips | Harlan Teklad, Indianapolis, IN | 7090 | Bedding |
| JMPH | SAS Institute, Inc., SAS Campus Drive, Cary, NC | v10.0.2 | Statistical software |
| Microsoft Excel | Microsoft, One Microsoft Way, Redmond, WA | Excel 2013 (v 15.0) | Spreadsheet software |
| GraphPad Prism 5 | GraphPad software Inc., La Jolla, CA | v5.4 | Graphing software |
| Mouse Huts | Bio-Serv, Flemington, NJ | K3272 | For environmental enrichment |
References
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Rosen, D. R., et al. Mutations in Cu/Zn superoxide dismutase gene are associated with familial amyotrophic lateral sclerosis. Nature. 362 (6415), 59-62 (1993).
- Gurney, M. E. The use of transgenic mouse models of amyotrophic lateral sclerosis in preclinical drug studies. J Neurol Sci. 152, Suppl. 1 (6415), (1997).
- Scott, S., et al. Design, power, and interpretation of studies in the standard murine model of ALS. Amyotroph Lateral Scler. 9 (1), 4-15 (2008).
- Hegedus, J., Putman, C. T., Gordon, T. Time course of preferential motor unit loss in the SOD1 G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurobiol. Dis. 28 (2), 154-164 (2007).
- Gordon, T., Ly, V., Hegedus, J., Tyreman, N. Early detection of denervated muscle fibers in hindlimb muscles after sciatic nerve transection in wild type mice and in the G93A mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Neurol. Res. 31 (1), 28-42 (2009).
- Gurney, M. E., et al. Motor neuron degeneration in mice that express a human Cu,Zn superoxide dismutase mutation. Science. 264 (5166), 1772-1775 (1994).
- Kim, K., Moore, D. H., Makriyannis, A., Abood, M. E. AM1241, a cannabinoid CB2 receptor selective compound, delays disease progression in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis. Eur. J. Pharmacol. 542 (1-3), 1-3 (2006).
- Weydt, P., Hong, S. Y., Kliot, M., Moller, T. Assessing disease onset and progression in the SOD1 mouse model of ALS. Neuroreport. 14 (7), 1051-1054 (2003).
- Azari, M. F., et al. Behavioural and anatomical effects of systemically administered leukemia inhibitory factor in the SOD1(G93A G1H) mouse model of familial amyotrophic lateral sclerosis. Brain Res. 982 (1), 92-97 (2003).
- Guan, Y., et al. Thiazolidinediones expand body fluid volume through PPARgamma stimulation of ENaC-mediated renal salt absorption. Nat. Med. 11 (8), 861-866 (2005).
- Savcheniuk, O. A., et al. The effect of probiotic therapy on development of experimental obesity in rats caused by monosodium glutamate. Fiziol. Zh. 60 (2), 63-69 (2014).
- Smittkamp, S. E., Brown, J. W., Stanford, J. A. Time-course and characterization of orolingual motor deficits in B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J mice. Neuroscience. 151 (2), 613-621 (2008).
- C, M., Gurney, M. E. A low expressor line of transgenic mice carrying a mutant human Cu,Zn superoxide dismutase (SOD1) gene develops pathological changes that most closely resemble those in human amyotrophic lateral sclerosis. Acta Neuropathol. 93 (6), 537-550 (1997).
- Wegorzewska, I., Baloh, R. H. TDP-43-based animal models of neurodegeneration: new insights into ALS pathology and pathophysiology. Neurodegener. Dis. 8 (4), 262-274 (2011).
- Hatzipetros, T., et al. C57BL/6J congenic Prp-TDP43A315T mice develop progressive neurodegeneration in the myenteric plexus of the colon without exhibiting key features of ALS. Brain Res. 1584, 59-72 (2014).
