Fluorescencia y bioluminiscencia de imágenes de subcelular Ca^{2 +} Envejecido en las neuronas del hipocampo

Summary

Intracellular Ca²⁺ remodeling in aging may contribute to excitotoxicity and neuron damage, processes mediated by Ca²⁺ overload. We aimed at investigating Ca²⁺ remodeling in the aging brain using fluorescence and bioluminescence imaging of cytosolic and mitochondrial Ca²⁺ in long-term cultures of rat hippocampal neurons, a model of neuronal aging.

Abstract

La susceptibilidad a la muerte celular neuronal asociada a la neurodegeneración y la isquemia se incrementan excesivamente en el cerebro envejecido pero los mecanismos responsables están mal conocido. La excitotoxicidad, un proceso que se cree que contribuir al daño neuronal inducido por ambos insultos, está mediada por la activación de receptores de glutamato que promueve Ca ^{2 + afluencia} y mitocondrial Ca ^{2 + sobrecarga.} Un cambio sustancial en Ca ^{2 + homeostasis} intracelular o remodelación de ^Ca2 + intracelular homeostasis puede favorecer el daño neuronal en las neuronas viejas. Para la investigación de Ca ²⁺ remodelación en el envejecimiento se han utilizado imágenes de células vivas en cultivos a largo plazo de las neuronas del hipocampo de rata que se asemejan en algunos aspectos las neuronas in vivo edades. Para este fin, las células del hipocampo son, en primer lugar, recién dispersa de nuevos hipocampo de rata nacida y chapada en cubreobjetos recubierto, vidrio poli-D-lisina. A continuación, los cultivos se mantienen en medios de comunicación controlados por varios días o varias wEeks para la investigación de las neuronas jóvenes y mayores, respectivamente. En segundo lugar, las neuronas cultivadas se cargan con fura2 y sometidos a mediciones de la concentración citosólica ^de Ca2 + utilizando imágenes de fluorescencia ratio digital. En tercer lugar, las neuronas cultivadas son transfectadas con plásmidos que expresan un tándem de aequorina baja afinidad y GFP apuntado a las mitocondrias. Después de 24 h, aequorina dentro de las células se reconstituye con coelenterazina y las neuronas son sometidos a imágenes de bioluminiscencia para la monitorización de la concentración de Ca ²⁺ mitocondrial. Este procedimiento de tres pasos permite la monitorización de citosólica y mitocondrial ^Ca 2 + respuestas a los estímulos relevantes como, por ejemplo, el agonista del receptor de glutamato NMDA y comparar si estas y otras respuestas están influenciadas por el envejecimiento. Este procedimiento puede producir nuevos conocimientos en cuanto a cómo el envejecimiento influencia citosólica y mitocondrial ^Ca 2 + respuestas a los estímulos seleccionados, así como las pruebas de medicamentos seleccionados destinadas a prevenir célula de la neuronamuerte en enfermedades relacionadas con la edad.

Introduction

La excitotoxicidad es uno de los mecanismos más importantes que contribuyen al daño neuronal y muerte celular en insultos neurológicos tales como isquemia, y en algunas enfermedades neurodegenerativas tales como la enfermedad de Alzheimer ^1. Este tipo de neurotoxicidad está mediada principalmente por el glutamato actúa sobre Ca ²⁺ receptores ionotrópicos, -permeable NMDA (NMDAR) ^2. La exposición de las neuronas cultivadas a glutamato puede conducir a la excitotoxicidad ^3, lo que provoca la apoptosis neuronal ^4. Nosotros y otros han informado anteriormente de que la vulnerabilidad neuronal a la apoptosis inducida por NMDA puede cambiar con el desarrollo in vitro y el envejecimiento de ^5-8.

Es ampliamente aceptado que un aumento en la ^{concentración} de Ca2 + citosólico-libre ^([Ca2 +] _cyt) conduce a la activación de las células. Sin embargo, si este aumento es demasiado alta y / o sostenida suficiente, puede desencadenar la muerte celular ^9. Por otra parte, se ha propuestoque excitotoxicidad requiere Ca ²⁺ mitocondrial captación ^10, ya que el tratamiento de las neuronas con las neuronas protegidas desacoplador mitocondrial contra glutamato inducida por la muerte celular ^11. Si mitocondrias ocupan demasiado Ca ^2+, se puede producir la apertura de la transición de la permeabilidad mitocondrial, lo que lleva a la liberación de citocromo c y otros factores pro-apoptóticos, y la apoptosis que induce. Recientemente hemos demostrado que este mitocondrial ^de Ca 2 + captación está directamente relacionado con la susceptibilidad dependiente de la edad a la excitotoxicidad, midiendo directamente inducida por NMDA mitocondrial ^de Ca 2 + captación en las neuronas del hipocampo ^individuales 5, un método que se informa en este artículo. El hipocampo, involucrado en procesos fisiológicos tales como el aprendizaje, la memoria y otros procesos cognitivos ^12, es altamente vulnerable al envejecimiento y los trastornos neurodegenerativos ^13. Se ha propuesto que, después de varias semanas in vitro, se cultivaronlas neuronas del hipocampo muestran un número de características típicas de las neuronas de edad ^14. En consecuencia, las neuronas del hipocampo en cultivo a largo plazo pueden proporcionar un modelo integral para investigar Ca ²⁺ mecanismos mediadas de mayor excitotoxicidad en el envejecimiento.

El objetivo general del método presentado es, por lo tanto, para investigar los cambios sustanciales en el Ca ²⁺ intracelular homeostasis o Ca ²⁺ remodelación en el envejecimiento del cerebro incluyendo las respuestas el diferencial Ca ²⁺ provocadas por agonistas de los receptores NMDA en un largo plazo neuronas del hipocampo en cultivo . El método incluye una descripción detallada de la cultura de las neuronas del hipocampo de rata y el seguimiento de las concentraciones de ^Ca2 + citosólico y mitocondrial mediante fluorescencia y imágenes de bioluminiscencia en las neuronas individuales, respectivamente. Imágenes de fluorescencia de Ca ²⁺ citosólico en las neuronas cultivadas es un procedimiento estándar. Sin embargo, este método es menos fiable para subcelular Ca ²⁺ mediciones incluyendo mitocondrial ^de Ca2 +. Las razones para esto son la falta de orientación adecuada de sondas sintéticas y afinidad inapropiado para Ca ²⁺ concentraciones que pueden cambiar en las mitocondrias del bajo nivel M, incluso al nivel mM. El uso de ^Ca 2 + sondas basadas en proteínas como, por ejemplo, aequorina, ha permitido a la focalización a orgánulos subcelulares y el uso de derivados de diferentes ^Ca 2 + afinidades utilizando diferentes coelenterazines o sondas mutados que carecen de sitios de unión específica ¹⁵ Ca ^2+. De esta manera, imágenes de bioluminiscencia de células que expresan aecuorina mitocondrias-dirigida puede permitir el seguimiento de mitocondriales ^de Ca 2 + concentraciones en neuronas individuales. Sin embargo, este procedimiento puede requerir el uso de cámaras de conteo de fotones o cámaras CCD ultrasensibles de imágenes de bioluminiscencia ^16-18. Este método puede producir nuevos resultados que debe ser confirmada en más establmodelos cies de envejecimiento del cerebro como, por ejemplo, secciones de cerebro de animales viejos.

Protocol

Declaración de Ética: Procedimientos que involucran sujetos animales han sido manejados bajo los protocolos aprobados por la instalación de alojamiento de los animales de la Universidad de Valladolid, de acuerdo con la Convención Europea 123 / Consejo de Europa y la Directiva 86/609 / CEE. 1. Corto y Largo Plazo Cultura de las neuronas del hipocampo de rata Preparación de poli-D-lisina recubierto, 12 mm cubreobjetos de vidrio. Esterilizar 12 mm cubreobjetos de vidrio de diámetro …

Representative Results

Aquí se describe un método simple para evaluar Ca 2+ remodelación y los efectos del NMDA en citosólica y mitocondrial [Ca2 +] en las neuronas de edad. La Figura 1 muestra el esquema del procedimiento para el aislamiento y cultivo de neuronas del hipocampo de ratas neonatales. Antes de empezar, tenemos que prepararnos, recubiertos, cubreobjetos de vidrio de poli-D-lisina estériles y colocarlos en una placa de 4 pocillos. A continuación, las ratas neonatales son asesinados y el…

Discussion

La remodelación de Ca ^{2 + homeostasis} intracelular en el envejecimiento del cerebro se ha relacionado con la pérdida cognitiva, aumento de la susceptibilidad a daños isquémico, la excitotoxicidad y la neurodegeneración. Para investigar esta hipótesis in vitro, procedimientos de imagen Ca ²⁺ están disponibles. Por desgracia, las culturas viables de las neuronas del hipocampo de edad no son fiables. Recientemente, se ha observado que los cultivos a largo plazo de las neuronas del hipo…

Materials

Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (from bovine pancreas)	Sigma	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 mm glass coverslips	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well multidish plaques	Nunc	176740
Petry dishes	JD Catalan s.l.	2120044T
Sterile pipettes	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
Coelenterazine n	Biotium	BT-10115-2250 uG
Digitonin	Sigma	D5628
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER fluorescence camera	Hamamatsu
VIM photon counting CCD camera	Hamamatsu
VC-8 valve controller	Warner Instruments
SH-27B heating system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics