Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Im Alter von Neuronen im Hippocampus

María Calvo-Rodríguez; Carlos Villalobos; Lucía Nuñez

doi:10.3791/53330

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Methodenartikel

Fluoreszenz- und Biolumineszenz-Bildgebung subzellulärer Ca

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DOI:

10.3791/53330

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1. Dezember 2015

María Calvo-Rodríguez¹ , Carlos Villalobos¹ , Lucía Nuñez²

¹Instituto de Biologìa y Genética Molecular, Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas, ²Departamento de Bioquìmica y Biologìa Molecular y Fisiologìa, Universidad de Valladolid

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Intrazellulärer Ca2⁺-Umbau im Alter kann zu Exzitotoxizität und Neuronenschäden beitragen, Prozesse, die durch Ca2⁺-Überlastung vermittelt werden. Unser Ziel war es, den Ca2⁺-Umbau im alternden Gehirn mit Hilfe von Fluoreszenz- und Biolumineszenzbildgebung von zytosolischem und mitochondrialem Ca2⁺ in Langzeitkulturen von Hippocampus-Neuronen der Ratte, einem Modell der neuronalen Alterung, zu untersuchen.

Zusammenfassung

Anfälligkeit für Neuronen Zelltod zu Neurodegeneration und Ischämie verbunden sind außerordentlich im Alter von Gehirn erhöht, sondern Mechanismen verantwortlich sind schlecht bekannt. Exzitotoxizität, ein Verfahren angenommen, um Neuronenschaden durch beide Beleidigungen induzierte beizutragen, wird durch Aktivierung der Glutamat-Rezeptoren, ^Ca2 + -Einstrom und mitochondriale ^Ca 2+ Last fördert vermittelt. Eine wesentliche Änderung der intrazellulären ^Ca 2+ Homöostase oder Umbau ^von intrazellulärem Ca 2+ Homöostase kann Neuronenschäden in alten Nervenzellen begünstigen. Zur Untersuchung von ^Ca 2+ Umbau im Altern haben wir Live Cell Imaging in Langzeitkulturen von Ratten-Hippocampus-Neuronen, die in einigen Aspekten im Alter von Neuronen in vivo ähnlich verwendet. Zu diesem Zweck Hippocampus-Zellen sind, in erster Linie frisch aus neugeborenen Ratten-Hippocampus dispergiert und auf poli-D-Lysin beschichteten Deckgläser plattiert. Dann Kulturen werden in kontrollierten Medien für mehrere Tage aufbewahrt oder mehrere wochen zur Untersuchung von jung und alt Neuronen auf. Zweitens werden kultivierten Neuronen mit Fura2 verladen und nach Messungen des cytosolischen ^Ca 2+ -Konzentration mit digitalen Fluoreszenzverhältnis Bildgebung unterzogen. Drittens werden kultivierten Neuronen mit Plasmiden ein Tandem von geringer Affinität Aequorin und GFP zu Mitochondrien ziel transfiziert. Nach 24 Stunden wird Aequorin in Zellen mit Coelenterazin rekonstituiert und Neuronen zu Biolumineszenz-Bildgebung für die Überwachung der mitochondrialen Ca ^{2+ -Konzentration} ausgesetzt. Dieses Drei-Schritt-Verfahren erlaubt die Überwachung der cytosolischen ^Ca 2+ und mitochondriale antwortet relevante Stimuli wie zum Beispiel die Glutamat-Rezeptor-Agonisten NMDA und Vergleichen, ob diese und andere Ergebnisse werden durch Alterung beeinflußt. Dieses Verfahren kann neue Erkenntnisse darüber, wie Alterungs Einfluss zytosolischen und mitochondrialen ^Ca 2+ Antworten auf ausgewählte Stimuli sowie die Prüfung der ausgewählten Medikamente zur Verhinderung von Neuronenzelle gerichtet ergebenTod im altersbedingten Krankheiten.

Einleitung

Exzitotoxizität ist einer der wichtigsten Mechanismen, der einen Beitrag zur Neuronenschädigung und Zelltod in neurologischen Beleidigungen wie Ischämie und in einigen neurodegenerativen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit ^ein. Diese Art von Neurotoxizität wird hauptsächlich durch Glutamat wirkend auf Ca ²⁺ vermittelte -durchlässigen, ionotropen NMDA-Rezeptoren (NMDAR) ^2. Exposition von kultivierten Neuronen Glutamat kann Exzitotoxizität ^{3, die} neuronale Apoptose ⁴ verursacht führen. Wir und andere haben bereits berichtet, dass die neuronale Anfälligkeit für NMDA-induzierte Apoptose bei der Entwicklung i....