Introduction
Under fosterudviklingen, væv og organer morfogenese ske gennem en præcist program, der kan beskrives ved hjælp af celleproliferation, cellemigration og slægt specifikation 1-4. Disse biologiske processer er også involveret i at opretholde homeostase voksent væv, som kræver stamcelle regeneration. Lineage sporing, identifikation og sporing af afkommet af en specifik type celle befolkning, giver et vigtigt redskab til at studere embryogenese og stamceller homeostase. Faktisk er det i stigende grad bliver brugt i mange forskningsområder. Især afstamning sporing blev et vigtigt redskab i at identificere oprindelsen og skæbnen for stamceller i homeostase og kræft udvikling. Dette er fordi det kan give væsentlige oplysninger om, hvordan cellen opfører sig i forbindelse med den intakte væv eller organisme, med minimal eksperimenterende indgreb i modsætning til celleisolering og in vitro kultur eller transplantatipå dette kan resultere i uønsket bias.
Traditionelt farvestoffer, såsom lipidopløselige carbocyanin, der inkorporerer i plasmamembranen i celler, blev anvendt til afstamning sporing. Selv om disse typer af eksperimenter med succes har ført til store opdagelser og formede skelsættende begreber i udviklingsmæssige biologi 5,6, de har nogle begrænsninger, herunder vanskeligheden ved at styre specificitet målrettede celler, den uønskede effekt af farvestoffet på celle adfærd og fortyndingen af etiketten over tid. Nukleotid analog mærkning tilgange har aktiveret dokumentere eksistensen af slow-cykling "label fastholde celler", der formentlig svarer til hvilende stamceller 7,8. Men mens denne teknik kunne påvise tilstedeværelsen af langsomme cykling celler baseret på spredning kinetik over en begrænset periode kunne det ikke give væsentlige indsigter vedrørende funktionaliteten af stamceller. En optimal afstamning sporing methtode bør minimere virkningen af mærkningen på egenskaberne af den markerede celle, dens afkom eller dens naboer. Derudover ville det være fordelagtigt at have kontrol på mærkningen induktion, nemlig at have evnen til at mærke cellepopulationen af interesse på en scene og tidsafhængig måde samt i en enkelt celle (klonal) måde. En stabil og irreversibel mærkning metode, der videregives til alt afkom af grundlæggeren cellen er vigtigt, så etiketten kan bibeholdes over tid, og ikke overføres til naboceller.
For nylig blev genetiske tilgange cellemærkning udviklet. I disse systemer, kan cellespecifikke promotorer anvendes til at udløse Cre-rekombinase ekspression med henblik på at fjerne en loxP-flankeret vejspærring og tillade ekspressionen af reportergener, såsom grønt fluorescerende protein eller Β-galactosidase reportergener 9-13. Denne fremgangsmåde gør det muligt ikke blot sporing af celler og deres afkom, men også tillader celle erolation og molekylær karakterisering. Cellesporing på enkelt celle niveau blev mulig ved induktion af ekspressionen af et enkelt fluorescent reportergen. En vigtig begrænsning ved dette system er, at kun når meget lav procentdel af celler er mærket, er det muligt at adskille og spore individuelle kloner. For at overvinde denne begrænsning flerfarvet reportere kan anvendes. Ved brug af flerfarvet mærkning, kan sporing af forskellen skæbne naboceller i samme niche opnås effektivt 14-17. For nylig blev en række Brainbow (BR) alleler udviklet til afstamning sporing eksperimenter, der muliggør en stokastisk ekspression af multiple fluorescerende reportergener under anvendelse af Cre / lox-systemet. Cre / lox-systemet består af Cre-rekombinase-enzym, som genkender og binder til specifikke DNA-sekvenser, såsom loxP-sites. Efter bindingen af Cre-rekombinase, stedspecifik rekombination forekommer, hvilket bevirker fjernelse af loxP flankeret sekvenser resulting i tilfældig ekspression af forskellige fluorescerende proteiner (mekanismen er beskrevet nedenfor). En række Br linjer er tilgængelige til brug (se anmeldelser 16,18,19). De store forskelle mellem Br stammer omfatter (i) forskelle i antallet af fluorescerende gener indgår i kassetten, der spænder fra 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) til 4 (Br1.1, Br2.1) fluorescerende gener , (ii) tilstedeværelsen af gensidigt orienteret lox-steder for at tillade gen-inversion (Br2.0-2.1), (iii) den type lox steder, der anvendes, og (iv) udtrykket eller stilhed fluorescerende genekspression før Cre aktivering. Det nyligt etablerede Br3 tilbyder en forbedret metode til flerfarvet billeddannelse af neuroner. En af de vigtigste funktioner i denne udskrift er, at det indeholder et nyt sæt fotostabile farnesylerede fluorescerende proteiner, som giver en jævn farvning af de fineste neuronale processer 20.
Vigtigt er det, kan forskellige versioner af Br kassetter indeholder den neuronale specifikke Thy1 promoter eller ubikvitært CAG (CMV) promotor. Endelig, mens nogle af Br transgene mus kan indeholde en enkelt Br transgen, kan andre bestå af flere transgene kopier, hvorved produktionen af et enormt antal af muligheder for farvekombinationer at blive udtrykt i hver celle (se for eksempel 16).
I vores undersøgelse, brugte vi R26R-Confetti mus, som indeholder Br 2.1 kassette 21. Br2.1 er unikt udformet til at tillade Cre-medieret DNA-inversioner og ikke kun ekscisioner grund for den gensidige orientering af loxP-steder (figur 1). Således kan disse inversion / excision begivenheder, der fører til farveændring fortsætte, så længe Cre er til stede 16. Derfor er afgørende for pålidelig celle tracking bruge Br2.1 en inducerbar tidsmæssig Cre ekspressionssystem. Som vist i fig. 1, i Br2.1 indeholder en allestedsnærværende CAG promotor efterfulgt af loxP-flankeret Neo R -cassette, der virker som en transkriptionel vejspærring, er denne efterfulgt af 4 fluorescerende reportergener, der koder for grønt (GFP), gul (YFP), rød (RFP) og cyan (FFP) fluorescerende proteiner, der er placeret i to tandem. Nr fluorescens udtrykkes før Cre aktivering. Induktion af Cre-rekombinase bevirker fjernelse af Neo-R kassetten muliggør tilfældig ekspression af en af de 4 fluorescerende proteiner i en given celle. Det første segment indeholder loxP-flankeret GFP og et omvendt YFP, mens det andet segment indeholder loxP-flankeret RFP og en omvendt FFP. Disse DNA-segmenter kan kontinuerligt inverteres (ved hjælp af loxP der er i omvendt orientering), eller udskåret, så længe Cre-rekombinase er til stede. Derfor bør en forbigående og kontrolleret Cre transgen anvendes. Den Br2.1 kassette giver en fremragende system til at skelne mellem overlappende emissioner på signal placering: udtryk for YFP og RFP er cytoplasmatisk, GFP er kernekraft og den fælles fiskeripolitik er bundet til cellemembranen. GFPog RFP emissioner adskilles let ved konventionel fluorescensmikroskopi. For at adskille emissioner YFP / GFP / FFP, er behov for en spektral konfokal imaging system. Alt i alt det Br2.1 kassetten tillader det tilfældige, inducerbare og væv specifikt udtryk for en ud af fire distinkte fluorescerende gener i hver målrettet celle. I virkeligheden, når et større antal farvekombinationer er nødvendigt, kan man danne homozygote mus, der indeholder 2 alleler af Br2.1, hvilket resulterer i ekspressionen af 2 farve tags for hver celle og til at øge antallet af mulige farvekombinationer til 10 22. Nogle af Br musestammer muliggøre ekspressionen af et langt større antal mulige farvekombinationer da flere kopier af kassetten blev integreret i deres genom 16. Men i de fleste tilfælde de fire farvekombinationer leveres af en enkelt Br2.1 allel er tilstrækkelige. Efter protokollen tilvejebragt her, kan man etablere denne fremgangsmåde under anvendelse af en relativt enkel opsætning af spectral mikroskopi med lidt, hvis noget behov for kalibrering.
Her giver vi en tilpasningsdygtig protokol for anvendelse af R26R-Confetti mus, der indeholder et enkelt Br2.1 allel, for afstamning spore eksperimenter af hornhindens epitel. Dette transgen musestamme er blevet anvendt til at studere oprindelse og skæbne colon 21,23 og hornhindeepitelceller stamceller 22,24, tilstedeværelsen af stamceller aktivitet i tarmkræft 25 og til karakterisering nyre podocyte i focal segmental glomerulosklerose (FSGS) 17.
Protocol
Etik Statement: I dette studie Dyrepleje og brug blev tilpasset til ARVO erklæring til brug af dyr i Ophthalmic og Vision Research. Alle forsøg blev godkendt af den lokale etiske komité.
1. Vælg en egnet Cre-rekombinase Udtrykke musestamme
- Ud af det store udvalg af Cre transgene linjer købes 26 og afhængigt af målvævet, som skal undersøges, vælge en Cre transgene mus stamme, hvori Cre-rekombinase-genet styres af en promotor, der er specifik for vævet af interesse. I er brug tilfælde tidsmæssig kontrol, skal du vælge en inducerbar Cre linje.
Bemærk: Vi valgte den tamoxifen inducerbare K14-Cre ERT transgen til specifikt mærke limbale og hornhindeepitelceller stamceller / progenitorceller 24. Bemærk, at der kan være forskelle mellem stammerne, som Di Girolamo og kolleger rapporterede limbale specificitet uden hornhinde udtryk for deres K14-Cre ERT 22. En fordel ved at anvende inducerbare transgene mus Cre er, at det giver mulighed for induktion af afstamning sporing på alsidige tidsrammer.
2. Vælg en egnet Br musestamme
- Vælg den relevante Br kassette afhængigt af forskningsspørgsmål og tilgængelig Cre linje 16,18,20.
- Hvis der anvendes en ikke-inducerbare Cre musestamme vælge en Br-kassette, der ikke tillader kontinuerlig DNA inversioner / ekscisioner og dermed give anledning til dead-end produkter (f.eks Br1.0 eller Br1.1) 16.
3. Kryds transgene linjer Interessante
- For protokollen er vist her, krydser homozygot R26R-Confetti stamme (Br2.1 / Br2.1) med homozygot Cre ERT stamme (Cre ERT / Cre ERT) for at opnå hemizygote afkom (Br2.1 / +; Cre / +) som er klar til mono-allel slægt sporing da de alle indeholder en enkelt Br2.1 allel og enenkelt Cre allel.
Bemærk: For at øge effektiviteten af mærkning, kunne man generere mus, der indeholder to Cre alleler (Br2.1 / +; Cre / Cre), mens to Br2.1 alleler (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) ville øge farvekombinationer (som beskrevet i 22).
4. Cre-rekombinase Induktion
Bemærk: Administrationen af Tamoxifen i disse eksperimenter blev udført ved daglig intraperitoneal injektion, for varigheden af 3-4 dage, med henblik på at inducere translokation af Cre-rekombinase ERT i kernen i limbal og hornhinden basal K14-positive stamceller / progenitor epitelceller. Følgende protokol kan anvendes til indsprøjtning af fire mus. Alternativt topisk påføring af Tamoxifen til øjets overflade giver højere effektivitet. Den Tamoxifen Opløsningen kan opbevares i mørke ved 4 ° C i op til en uge. Varm opløsningen før brug.
- 100 mg afvejes af Tamoxifen og opløse den i 5 ml majsolie tildannelse af en 20 mg / ml opløsning tamoxifen.
- Injicer 200 pi Tamoxifen (4 mg) opløsning intraperitonealt til 8 uger gamle mus for 3-4 dage i træk.
Bemærk: Den Tamoxifen Opløsningen kan opbevares i mørke ved 4 ° C i op til en uge. Varm opløsningen før brug. - Til topisk anvendelse: vejer 60 mg Tamoxifen og opløse den i 1 ml majsolie for at danne en 60 mg / ml opløsning tamoxifen. Vortex og indstil opløsning i et rystevandbad holdt ved 65 ° C, indtil det bliver klart lade den stå i badet indtil brug.
- Forsigtigt 100 pi af Tamoxifen opløsning til hver okulær overflade af musen.
5. Tissue Forberedelse til Imaging
- Sacrifice dyr under anvendelse af isofluran (2% fordampet i oxygen) anæstesi (bekræft korrekt bedøvelse af manglen på reflekser) efterfulgt af CO 2 inhalation på passende tidspunkter efter injektion og Tamoxifen colLect den relevante væv.
- Til disse eksperimenter enucleate øjne på følgende tidspunkter: 1, 4, 8, 12 og 16 uger efter injektion Tamoxifen. Opnå enucleation ved hjælp buet pincet. Tryk øjenlågene forårsager øjeæblet til pop ud af øjenhulen. Placer tangen bag øjeæblet holder synsnerven. Træk forsigtigt øjeæblet, og tag det.
Bemærk: I denne fase, som beskrevet nedenfor, væv kan fremstilles til wholemount analyse af mærkede celler. Regelmæssige frosne vævssnit kan også fremstilles, fastsat i PFA og filmede som beskrevet nedenfor (se afsnit 6 og 22).
- Til disse eksperimenter enucleate øjne på følgende tidspunkter: 1, 4, 8, 12 og 16 uger efter injektion Tamoxifen. Opnå enucleation ved hjælp buet pincet. Tryk øjenlågene forårsager øjeæblet til pop ud af øjenhulen. Placer tangen bag øjeæblet holder synsnerven. Træk forsigtigt øjeæblet, og tag det.
- Placer hvert øje i en 60 mm skål fyldt med PBS.
- Under et stereomikroskop ved anvendelse af pincetter holde øjet nær synsnerven med hornhinden nedad og bruge en skalpel for at fjerne synsnerven, muskler og bindevæv og lave et lille snit i den bageste del af øjet.
- Brug foråret saks omhyggeligt forstørreskære lade objektivet pop ud og fjern iris hjælp pincet.
- Glat hornhinden ved at gøre 4-5 radiale snit startende fra midten mod periferien ved hjælp af en skalpel.
- Brug en skalpel til at skære overskydende perifere væv uden for limbus.
- Fix hornhinder i PFA 4% i 10 minutter, derefter kortvarigt vaske dem med PBS.
- Inkuber prøver med DAPI i 10 minutter og vaskes hurtigt med PBS.
- Mount hornhinder på objektglas med epitelial opad. Placer en dråbe montering medier oven på hornhinden og tildækkes med en cover-glas. Lad dias tørre O / N i RT. Hold objektglas ved 4 ° C.
6. Konfokal og Billeddannelse Analysis
- Brug en spektral konfokal system, som gør det muligt adskillelse af emissioner YFP / GFP / fælles fiskeripolitik. Set fluorescens excitation og emissionsbølgelængder afhængigt af de fluorescerende proteiner i Br kassetten. Vælg den mest passende ekscitationsbølgelængde for hvert protein sigter mod at minimere crossexcitation. Vælg smalle emission intervaller for at minimere lækagen af signaler fra de forskellige proteiner.
- For Br2.1 kassette, skal du bruge følgende sat op af fluorescens excitation (tidligere) og emission (em) som udgangspunkt: DAPI - ex 405 nm / em 420-480 nm, den fælles fiskeripolitik - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm, og RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm.
- For at visualisere store vævsområder med høj opløsning, erhverver flise billeddannelse. For resultaterne vist i figur 2A-B, billede hele hornhinden ved at opnå en matrix af 12 x 12 billeder, dvs. erhverve 144 felter (512 x 512) under anvendelse af 4 fluorescerende kanaler i hvert felt. Tilsammen indsamle 576 billeder og derefter fusionere.
- At undersøge lokalisering af mærkede celler i forskellige dybder og strukturer i vævet, erhverve Z-stack billeder af forskellige områder af interesse. For to billedet den fulde dybde af hornhinden, erhverve 8 optiske sektioner på 3 um intervaller. Retvinklede udsigt over sektionerne indsamlet samt billede fremskrivninger baseret på maksimale intensiteter kan konstrueres ved hjælp af konventionelle billeddiagnostiske software 24.
7. hornhindeskade kombineret med Tamoxifen Induktion
- Bedøver mus med isofluran (2 fordampet i oxygen%) og administrerer analgetika (10 mg / kg Carpofen, injiceret subkutant). Bekræft ordentlig bedøvelse ved passivitet til tå-knivspids.
- 1 g af Tamoxifen pulver afvejes og opløses det i 5 ml sterilt DMSO til frembringelse af 200 mg / ml koncentration opløsning.
- Varm Tamoxifen opløsningen til 65 ° C i et vandbad, indtil opløsningen bliver klar. Hold løsning i badet indtil brug.
- Anvend øjet salve til den ubehandlede kontralaterale øje at undgå dehydrering under anæstesi. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkeligt conBevidsthed at opretholde brystleje. Må ikke returnere mus, der havde gennemgået øje sårede til selskab med andre mus, indtil fuldt tilbagebetalt. Mus bør overvåges nøje efter skaden. I tilfælde mister de mere end 10% af deres kropsvægt, lider corneaerosion eller ubehag, bør forsøget stoppes. Gentag analgetika administration hver 24 timer gennem hele forsøget.
- Ved hjælp af en steril sprøjte uden nål fastgjort til det; anvendes 200 pi Tamoxifen opløsning topisk over hele hornhindens overflade af det ene øje på hver mus.
Bemærk: Den flydende opløsning størkner hurtigt på øjets overflade ved RT. Effekten af hornhindeskade afhænger af sværhedsgraden af såret. Efter en anvendelse af Tamoxifen / DMSO-opløsning ingen bivirkninger er observeret i mus. I tilfælde af gentagne ansøgninger kan observeres uklarhed af hornhinden. - Fortsæt med væv forberedelse og billedbehandling (se sektioner 5 og 6) ved relevante tidspunkter. For de her beskrevne, ofre musene (som beskrevet i trin 5.1) én uge efter sårdannelse (figur 2 og 24).
Representative Results
For nylig har vi til formål at identificere oprindelsen, overlevelse og migration af stamceller og stamceller fra hornhindens epitel 24. Akkumulere beviser støtter dogme, hornhindeepitelet regenereres ved stamceller er placeret udelukkende i limbale niche, en ringformet zone ved hornhindens periferi. Denne teori understøttes af in vitro og in vivo-data, og ved klinisk dokumentation for, at dannede grundlag for en vellykket banebrydende limbal stamcellebehandling 27-29. Men forblev dette emne meget omdiskuteret i de seneste år på grund af en undersøgelse baseret på limbale podning eksperimenter, der foreslog, at musen limbus ikke deltager i hornhinde fornyelse 30. For at teste denne interessante hypotese, til afstamning sporing eksperimenter med R26R-Confetti mus blev udført, skal du følge skæbne limbale og hornhinden epitel stamceller / stamceller under steady-state betingelser i op til 120 dage 24.Øjne var udskrællet og flade-mount hornhinder blev analyseret ved spektral konfokal laser scanning fluorescensmikroskopi 10 og 120 dage efter Tamoxifen injektion. Som forventet blev små sporadiske klynger af fluorescerende celler observeret i hele øjets overflade 10 dage efter injektion, mens 1-4 måneder senere (figur 2B og 24), aflang striber, der strækker sig fra limbus mod hornhinden center langsomt udviklet. Dette resultat antyder, at hornhinden regenereres ved celler, der migrerer fra limbus mod midten af hornhinden. Dernæst blev hornhinde regenerering under sårede betingelser undersøgt. For at teste skæbne K14-positive limbale / hornhinde celler under betingelser, mens såret inducere effektiv sporing celle, opløste vi tamoxifen i dimethylsulfoxid (DMSO), som forårsager corneal skade ved topisk anvendelse. På den måde lykkedes at fremkalde milde såret hvis en enkelt lokal applikation blev anvendt (figur 2C), mo reducer sårede hvis yderligere DMSO alene behandling blev anvendt i dagen før Tamoxifen induktion eller svær sår, da DMSO alene blev topisk anvendt i 2 sekventielle dage før Tamoxifen induktion.
I modsætning til de tynde limbale striber, der langsomt udviklet og nået hornhindens centrum inden for 4 måneder under steady-state betingelser, cellemigration efter skade var hurtig. Bemærkelsesværdigt var lange og tykke limbale striber allerede udviklet under disse betingelser inden for 7 dage. Interessant, farve mangfoldighed var til tider minimal (figur 2D). I vores hænder, til tider, hovedsageligt røde celler blev identificeret i hele hornhinden, hvilket indikerer, at farven mangfoldighed kan være forudindtaget mod specifikke fluoroforer. Denne uønskede skævhed kan kalibreres ved dosis-respons test som tidligere rapporteret i Br1.0L 31 og i Br2.1 21.
les / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg "/>
Figur 1. Skematisk illustration af R26R-Confetti konstruktionen. (A) Den R26R-konfetti konstruktionen indeholder en KAG promotor til høje ekspressionsniveauer, en loxP (sort trekant) -flanked Neo R -roadblock og Brainbow2.1 kassette på Rosa26 locus 16,21. Den Brainbow2.1 kassette indeholder to hoved-til-hale loxP-flankeret dimerer. En dimer består af nuklear-lokaliseret grønt fluorescerende protein (GFP) og en revers-orienteret cytoplasmatisk gult fluorescerende protein (YFP, den inverse orientering udpeges - PFY). Den anden dimer indeholder cytoplasmatisk RFP og en omvendt-orienteret membran-tøjret cyan fluorescerende protein (FFP, den inverse orientering udpeget - PFC) 16. (B - E) Ved Cre-rekombinase aktivering, kan der opstå forskellige udskæring og inversion begivenheder; mulige udfald er exemplified i B - E. Cre aktivitet inducerer stokastisk omlægning af kassetten, der fører til gen flytning og / eller inversioner og dermed resulterer i tilfældige udtryk for en af de fire fluorescerende proteiner. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Corneal afstamning sporing under homeostase og skade. R26R-konfetti / K14-Cre mus blev injiceret med 4 mg Tamoxifen som beskrevet i protokollen. I angivne tidspunkter efter induktion fladtrykte hornhinder blev afbildet (A - B). Corneal sårdannelse kombineret med Cre induktion blev opnået ved topisk påføring af Tamoxifen opløst i DMSO (C - D). Mosaik billeder opnåetaf multikanal flisebelægning spektral konfokal mikroskopi er vist (A - D). I homeostase, radiale limbale striber af langsom migrerende celler udvides mellem limbus og hornhindens centrum. Disse striber er udviklet langsomt og nåede hornhindens centrum inden 4-5 måneder (B). Klynger af hornhindeceller var tydelige samt (hvide pile, B). Derimod store limbale striber vist sig inden for en enkelt uge under sårede betingelser (C). Et eksempel på forspænding farver forskellighed i forhold til røde blodlegemer (D). Den limbale-hornhinde grænse kommenteret med en stiplet linie. Scale bar er 500 um. Forkortelser: FFP, cyan fluorescerende protein; GFP, grønt fluorescerende protein; RFP, rødt fluorescerende protein; YFP, gult fluorescerende protein. Dette tal er blevet ændret fra 24. Klik her for at se en større version afdette tal.
Discussion
Lineage sporing forsøg er blevet udført i mange år. De seneste teknologiske forbedringer og fremkomsten af Confetti musestammer åbnet nye muligheder for forskning. Dag, kan forskerne drage fordel af et stort antal kommercielt tilgængelige vævsspecifikke Cre linjer, knockout-mus og transgene mus. Dette giver mulighed for at designe alsidige eksperimentelle systemer til håndtering videnskabelige spørgsmål med grundlæggende ekspertise, undgå besværlig praksis, men samtidig give robuste og pålidelige data.
R26R-Confetti mus er en elegant værktøj til effektiv sporing og undersøgelse af arten og opførsel af celler i en levende organisme. Systemet er nemt at etablere og det giver mulighed for ikke-invasiv slægt sporing af enkelte celler under embryogenese, stamceller regenerering under homeostase eller under forskellige omstændigheder som skade, betændelse og kræft. Den opnåelige data giver en robust description af overlevelsen af målrettede celler, klonal celleekspansion og celle migration, på en kvantificerbar måde. En kritisk skridt ville være at vælge den relevante genetiske mus stamme, der kan pålideligt muliggøre en effektiv væv specifik mærkning på en præcis udviklingsstadiet. En begrænsning ved dette system er, at til overvågning af en levende organisme, skal vævet være tilgængelige og gennemsigtige. Tilsvarende sporing af en tyk væv i et levende dyr kan kun lettes ved to-foton eller multi-foton mikroskopi. Men cellesporing er mulig på postmortem vævssnit og måske det intakte væv kan undersøges, efter at den er blevet transformeret til bliver gennemsigtig ved CLARITY metode 32,33. En anden begrænsning, der skal overvejes, er, at selv om tilstødende celler, der udtrykker den samme fluorofor sandsynligvis tilhører samme klonale linie, er det også muligt, at de kan være afledt af uafhængige celle oprindelse, der tilfældigt udtrykte samme fluorescerende gen. Denne mulighety bliver meget usandsynlig, når du bruger flere Br alleler at tillade mange farvekombinationer.
I fremtiden kombinere Confetti systemet med tilgængelige genetiske værktøjer (dvs. knockout, Knockin og transgene musemodeller) vil tillade undersøgelsen af gener og deres mutationer i sundhed og patologi. Ligeledes afstamning sporing under forskellige systemer forstyrrelser (dvs. stamceller niche ødelæggelse, laser medieret celle ablation, narkotikabehandling) vil bringe nye indsigter på inddragelse af signalveje i celle skæbne beslutninger. I sidste ende, det kombinatoriske brug af fluorescerende og bioluminescens mærkning, vil genetiske indberettere af signalveje og banebrydende mikroskopi give forskerne et robust system til at lære, hvordan enkelt celler reagerer på deres omgivelser i deres oprindelige miljø.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R26R-Confetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette | Jackson | strain #013731 | |
| K14-CreERT mice | Jackson | strain #005107 | |
| tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
| Carprieve 30 | b.wt | ||
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4 µg/ml |
| Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
| Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
| Duratears-eye ointment | Alcon |
References
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior. Dev Cell. 21, 394-409 (2011).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M.
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).
- Beck, B., Blanpain, C. Unravelling cancer stem cell potential. Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).
- Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration. Development. 106, 809-816 (1989).
- Eagleson, G. W., Harris, W. A. Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis. J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Snippert, H. J., Clevers, H.
- Snippert, H. J., et al. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin. Science. 327, 1385-1389 (2010).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
- Jaks, V., et al. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).
- Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip. Nature. 476, 409-413 (2011).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis. Kidney Int. 85, 972-980 (2014).
- Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. Generating and imaging multicolor Brainbow mice. Cold Spring Harb Protoc. , 763-769 (2011).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199, 293-306 (2015).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nat Methods. 10, 540-547 (2013).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 33, 157-169 (2015).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33, 230-239 (2015).
- Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337, 730-735 (2012).
- Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R.
- Collinson, J. M., et al. Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium. Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).
- Buck, R. C. Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).
- Nagasaki, T., Zhao, J. Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).
- Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface. Nature. 456, 250-254 (2008).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10, 508-513 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
