Introduction
Durante el desarrollo embrionario, el tejido y la morfogénesis de órganos se realizan a través de un programa preciso que puede ser descrito en términos de proliferación celular, la migración celular y la especificación de linaje 1-4. Estos procesos biológicos también están involucrados en mantener la homeostasis de los tejidos adultos, que requiere la regeneración de células madre. Rastreo de linaje, la identificación y el seguimiento de la progenie de un tipo específico de población celular, proporciona una herramienta importante para el estudio de la embriogénesis y frenar la homeostasis celular. De hecho, cada vez se utiliza en muchos campos de la investigación. Particularmente, el trazado de linaje se convirtió en una herramienta esencial para identificar el origen y el destino de las células madre en la homeostasis y el cáncer de desarrollo. Esto es porque puede proporcionar información esencial acerca de cómo la célula se comporta en el contexto del tejido intacto o organismo, con mínima intervención experimental, en contraste con el aislamiento de células y en cultivo o in vitro transplantatien que puede resultar en sesgo no deseado.
Tradicionalmente, colorantes tales como carbocianina soluble en lípidos, que incorporan en la membrana plasmática de las células, se utilizaron para el rastreo linaje. Aunque estos tipos de experimentos se han llevado con éxito a importantes descubrimientos y conceptos seminales de forma en la biología del desarrollo 5,6, tienen algunas limitaciones, incluyendo la dificultad para controlar la especificidad de las células diana, el impacto no deseado del colorante sobre el comportamiento celular y la dilución de la etiqueta con el tiempo. Nucleótidos enfoques de etiquetado analógica han permitido documentar la existencia de "células de la etiqueta de retención" que presumiblemente corresponden a quiescent células madre 7,8 lento ciclismo. Sin embargo, mientras que esta técnica podría demostrar la presencia de células en ciclo lento basado en la cinética de proliferación durante un periodo de tiempo limitado que no podía proporcionar conocimientos sustanciales con respecto a la funcionalidad de las células madre. Un metanfetamina linaje trazado óptimometo- debe minimizar el efecto del etiquetado sobre las propiedades de la celda marcada, su progenie, o sus vecinos. Además, sería beneficioso tener un control sobre la inducción de etiquetado, es decir, para tener la posibilidad de etiquetar la población celular de interés en una etapa y de manera dependiente del tiempo, así como de una manera única célula (clonal). Un método de marcaje estable e irreversible que se transmite a toda la progenie de la célula fundador es importante para que la etiqueta se mantendría en el tiempo, y no se transfiere a las células vecinas.
Más recientemente, se han desarrollado enfoques genéticos de etiquetado celular. En estos sistemas, los promotores específicos de células pueden utilizarse para desencadenar Cre expresión de la recombinasa con el fin de eliminar un control de carretera loxP-flanqueado y permitir la expresión de genes indicadores tales como la proteína fluorescente verde o Β-galactosidasa genes informadores 9-13. Este enfoque permite no sólo el seguimiento de las células y su progenie, pero también permite que la célula esolation y caracterización molecular. Seguimiento de la célula en el nivel de células individuales se hizo posible por la inducción de la expresión de un solo gen reportero fluorescente. Una limitación importante de este sistema es el hecho de que sólo cuando porcentaje muy bajo de células se etiqueta es posible separar y rastrear los clones individuales. Para superar esta limitación reporteros multicolor pueden ser utilizados. Cuando se utiliza el etiquetado multicolor, el seguimiento del destino diferenciado de las células vecinas en el mismo nicho se puede lograr de manera eficiente 14-17. Recientemente, una variedad de Brainbow (Br) alelos se han desarrollado para los experimentos de rastreo de linaje, lo que permite una expresión estocástica de múltiples genes reporteros fluorescentes que utilizan el sistema Cre / lox. El sistema Cre / lox se compone de la enzima recombinasa Cre, que reconoce y se une a secuencias específicas de ADN tales como sitios loxP. Después de la unión de la recombinasa Cre, sitio de recombinación específica se produce, lo que provoca la eliminación de secuencias loxP flanqueado resulting en la expresión aleatoria de diferentes proteínas fluorescentes (el mecanismo se describe a continuación). Una variedad de líneas Br están disponibles para su uso (ver comentarios 16,18,19). Las principales diferencias entre las cepas Br incluyen (i) las diferencias en el número de genes fluorescentes incluidas en el casete, que van desde 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) a 4 (BR1.1, Br2.1) genes fluorescentes , (ii) la presencia de sitios lox recíprocamente orientadas para permitir la inversión de gen (Br2.0-2.1), (iii) el tipo de sitios lox utilizados, y (iv) la expresión o silencio de la expresión del gen fluorescente antes de la activación Cre. El Br3 recientemente establecida ofrece un método mejorado para la imagen multicolor de las neuronas. Una de las principales características de esta transcripción es que contiene un nuevo conjunto de proteínas fotoestables farnesylated fluorescentes, que permiten una tinción incluso de los mejores neuronal procesa 20.
Es importante destacar que las diferentes versiones de cassettes Br pueden contener el específica neuronal Thy1 promoter o la doquier expresó CAG (CMV). Por último, mientras que algunos de los ratones transgénicos Br puede contener un único transgén Br, otros pueden consistir en múltiples copias del transgén, lo que permite la producción de un inmenso número de posibilidades de combinaciones que se expresa en cada célula (por ejemplo, véase 16).
En nuestro estudio, hemos utilizado el ratón R26R-Confeti que contiene el Br 2,1 casete 21. Br2.1 está especialmente diseñado para permitir que las inversiones de ADN mediada por Cre y no sólo escisiones Debido a la orientación recíproca de los sitios loxP (Figura 1). Por lo tanto, estos acontecimientos inversión / escisión que conducen al cambio de color pueden continuar mientras Cre está presente 16. Por esa razón, un sistema de expresión inducible Cre temporal es esencial para el seguimiento fiable de células usando Br2.1. Como se muestra en la figura. 1, la Br2.1 contiene un promotor CAG ubicua seguido por loxP-flanqueado Neo R -cassette, que actúa como un control de carretera de la transcripción, que es seguido por 4 genes fluorescentes reportero, codificación de verde (GFP), amarillo (YFP), rojo (RFP) y cian (PPC) proteínas fluorescentes, colocados en dos tándems. No fluorescencia se expresa antes de la activación Cre. La inducción de la recombinasa Cre provoca la eliminación de la casete Neo-R que permite la expresión aleatoria de una de las 4 proteínas fluorescentes en una célula dada. El primer segmento contiene GFP-loxP flanqueado y una YFP invertido, mientras que el segundo segmento contiene RFP-loxP flanqueado y una PPC invertido. Estos segmentos de ADN pueden ser invertidos de forma continua (utilizando loxP que está en orientación inversa), o extirpados, siempre y cuando la recombinasa Cre está presente. Por lo tanto, se debe utilizar un transgen Cre transitoria y controlada. El casete Br2.1 proporciona un excelente sistema para distinguir entre las emisiones de solapamiento de la ubicación de la señal: la expresión de YFP y RFP es citoplasmática, la GFP es nuclear y la PPC se une a la membrana celular. GFPy las emisiones de RFP se separan fácilmente por microscopía de fluorescencia convencional. Con el fin de separar las emisiones de YFP / GFP / CFP, se necesita un sistema de imagen confocal espectral. En total, el casete Br2.1 permite la expresión específica al azar, inducible, y el tejido de uno de cada cuatro genes fluorescentes distintos en cada célula diana. De hecho, cuando se necesita un mayor número de combinaciones de colores, se puede generar ratones homocigotos que contiene 2 alelos de Br2.1, lo que resulta en la expresión de 2 etiquetas de color para cada célula y en el aumento del número de posibles combinaciones de colores para 10 22. Algunas de las cepas de ratón Br permiten la expresión de un número mucho mayor de posibles combinaciones desde múltiples copias del casete se integraron en su genoma 16. Sin embargo, en la mayoría de los casos, las cuatro combinaciones de color proporcionadas por un único alelo Br2.1 son suficientes. Siguiendo el protocolo aquí proporcionada, se puede establecer este método utilizando una relativamente sencilla configuración de SPECTRal microscopía con poca o ninguna necesidad de calibración.
Aquí proporcionamos un protocolo adaptable para el uso de los ratones R26R-confeti que contienen un único alelo Br2.1, para el rastreo de linaje experimentos del epitelio corneal. Esta cepa de ratón transgénico ha sido utilizado para estudiar el origen y el destino de cáncer de colon 21,23 y células madre epiteliales de la córnea 22,24, la presencia de actividad de células madre en el cáncer intestinal 25, y para la caracterización de podocitos renal en glomeruloesclerosis focal y segmentaria (GSF) 17.
Protocol
Declaración de Ética: En este estudio el cuidado animal y el uso se ajusta a la Declaración de ARVO para el uso de animales en Oftálmica y Vision Research. Todos los experimentos fueron aprobados por el comité de ética local.
1. Elija un cre-recombinasa adecuados Expresando ratón Strain
- Fuera de la gran variedad de líneas transgénicas Cre disponibles para la compra 26 y dependiendo de el tejido diana a ser investigado, elegir un Cre cepa de ratón transgénico en el que la recombinasa Cre gen está controlada por un promotor que es específico para el tejido de interés. En se necesita control temporal caso, elija una línea Cre inducible.
Nota: Elegimos el tamoxifeno inducible transgén K14-Cre ERT para etiquetar específicamente epiteliales células madre / progenitoras del limbo corneal y 24. Tenga en cuenta que puede haber diferencias entre las cepas, como Di Girolamo y compañeros de trabajo informó especificidad del limbo sin expresión de la córnea para su K14-Cre ERT 22. Una ventaja de utilizar los ratones transgénicos Cre inducibles es que permite la inducción de linaje seguimiento en marcos de tiempo versátiles.
2. Elija un Adecuado Strain Br Ratón
- Elija el casete Br apropiado dependiendo de la pregunta de investigación y disponible línea 16,18,20 Cre.
- Si se utiliza una cepa de ratón Cre no inducible, elija un cassette Br que no permite DNA Inversions / escisiones continuos y por lo tanto dar lugar a productos sin salida (por ejemplo Br1.0 o BR1.1) 16.
3. Cruce las líneas transgénicas de interés
- Para el protocolo que se muestra aquí, cruzar el homocigotos cepa R26R-Confeti (Br2.1 / Br2.1) con los homocigotos cepa Cre ERT (Cre ERT / Cre ERT) para obtener crías hemizygous (Br2.1 / +; Cre / +) que están listos para su linaje mono-alélica trazado ya que todos ellos contienen un solo alelo Br2.1 ysolo alelo Cre.
Nota: Para aumentar la eficiencia del etiquetado, se podría generar ratones que contienen dos alelos Cre (Br2.1 / +; Cre / Cre), mientras que dos alelos Br2.1 (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) sería aumentar combinaciones (como se detalla en el 22).
Inducción 4. Cre-recombinasa
Nota: La administración de tamoxifeno en estos experimentos se llevó a cabo mediante inyección intraperitoneal diaria, durante la duración de 3-4 días, a fin de inducir la translocación de recombinasa Cre ERT en el núcleo de limbal y corneal tallo basal K14-positive / progenitor células epiteliales. El siguiente protocolo se puede utilizar para la inyección de cuatro ratones. Alternativamente, la aplicación tópica de tamoxifeno a la superficie ocular produce una mayor eficiencia. La solución tamoxifeno se puede mantener en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de una semana. Calentar la solución antes de su uso.
- Pesar 100 mg de Tamoxifeno y disolverlo en 5 ml de aceite de maíz aformar una solución de tamoxifeno 20 mg / ml.
- Inyectar 200 l de solución de tamoxifeno (4 mg) por vía intraperitoneal a ratones de 8 semanas de edad durante 3-4 días consecutivos.
Nota: La solución tamoxifeno se puede mantener en la oscuridad a 4 ° C durante un máximo de una semana. Calentar la solución antes de su uso. - Para la aplicación tópica: se pesan 60 mg de Tamoxifeno y disolverla en 1 ml de aceite de maíz para formar una solución tamoxifeno 60 mg / ml. Vortex y establecer la solución en un baño de agua con agitación mantenido a 65 ° C hasta que se convierte licencia clara en el baño hasta su uso.
- Aplique cuidadosamente 100 l de la solución de tamoxifeno a cada superficie ocular del ratón.
5. Preparación de tejidos para Imaging
- Animales de sacrificio utilizando isoflurano (2% vaporizado en oxígeno) anestesia (confirmar anestesia adecuada por la falta de reflejos) seguido por inhalación de CO2 en los puntos de tiempo apropiados tras la inyección y col tamoxifenonar la tejido relevante.
- Para estos experimentos, enuclear ojos en los siguientes puntos de tiempo: 1, 4, 8, 12, y 16 semanas después de la inyección tamoxifeno. Lograr la enucleación utilizando pinzas curvas. Pulse los párpados que causan el globo ocular para que salga de la cuenca del ojo. Coloque la pinza detrás del globo ocular que sostiene el nervio óptico. Tire suavemente el globo ocular y separarlo.
Nota: En esta etapa, como se describe a continuación, los tejidos se pueden preparar para el análisis wholemount de células marcadas. Secciones regulares de tejido congelado también se pueden preparar, se fijaron en PFA y la imagen como se describe más adelante (véase la sección 6 y 22).
- Para estos experimentos, enuclear ojos en los siguientes puntos de tiempo: 1, 4, 8, 12, y 16 semanas después de la inyección tamoxifeno. Lograr la enucleación utilizando pinzas curvas. Pulse los párpados que causan el globo ocular para que salga de la cuenca del ojo. Coloque la pinza detrás del globo ocular que sostiene el nervio óptico. Tire suavemente el globo ocular y separarlo.
- Coloque cada ojo en una placa de 60 mm lleno de PBS.
- Bajo un estereomicroscopio utilizando fórceps tienen el ojo cerca del nervio óptico con la córnea mirando hacia abajo y el uso de un escalpelo para eliminar el nervio óptico, los músculos y el tejido conectivo y hacer una pequeña incisión en la parte posterior del ojo.
- Con unas tijeras de primavera agrandar cuidadosamente lacortar dejando que la lente se salga y se quite el iris utilizando fórceps.
- Aplanar la córnea haciendo 4-5 incisiones radiales a partir desde el centro hacia la periferia usando un bisturí.
- Utilice un bisturí para cortar el tejido periférico exceso más allá del limbo.
- Fijar córneas en PFA 4% durante 10 min, luego lavar brevemente con PBS.
- Incubar las muestras con DAPI durante 10 min y se lava brevemente con PBS.
- Mount córneas en portaobjetos de vidrio con el lado epitelial hacia arriba. Coloque una gota de medio de montaje en la parte superior de la córnea y la tapa con una cubierta de vidrio. Deje secar diapositivas O / N en RT. Mantenga diapositivas a 4 ° C.
6. Microscopía Confocal y Análisis de Imágenes
- Utilice un sistema confocal espectral que permite la separación de las emisiones de YFP / GFP / PPC. Set de excitación de fluorescencia y longitudes de onda de emisión en función de las proteínas fluorescentes de la casete Br. Elija la longitud de onda de excitación más adecuado para cada proteína con el objetivo de minimizar la cruzexcitación. Elija rangos de emisión estrechas con el fin de minimizar la filtración de señales de las diferentes proteínas.
- Para el cassette Br2.1, utilice la siguiente configuración de excitación de fluorescencia (ex) y emisión (em) como punto de partida: DAPI - ex 405 nm / em cuatrocientos veinte hasta cuatrocientos ochenta nm, CFP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em desde 497 hasta 508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529 a 540 nm, y RFP - ex 561 nm / em 575 a 615 nm.
- Con el fin de visualizar grandes áreas de tejido con alta resolución, adquirir imágenes azulejo. Por los resultados mostrados en la Figura 2A-B, imagen toda la córnea mediante la obtención de una matriz de 12 x 12 imágenes, es decir, adquirir 144 campos (512 x 512) con 4 canales fluorescentes en cada campo. En total recolectar 576 imágenes y luego fusionar.
- Para explorar la localización de las células etiquetadas en diferentes profundidades y las estructuras de los tejidos, adquirir imágenes Z-pila de diferentes regiones de interés. Para to la imagen de la profundidad completa de la córnea, adquirir 8 secciones ópticas a 3 micras intervalos. Vistas ortogonales de las secciones recogidos, así como las proyecciones de imagen basándose en intensidades máximas pueden construirse usando softwares de imagen convencionales 24.
7. Lesiones de córnea combinado con tamoxifeno Inducción
- Anestesiar a los ratones con isoflurano (2% vaporizado en oxígeno) y administrar analgésicos (10 mg / kg, Carpofen inyectaron por vía subcutánea). Confirme anestesia adecuada por falta de respuesta a los pies de pellizcar.
- Pesar 1 g de polvo de Tamoxifeno y disolverlo en 5 ml de DMSO estéril para producir 200 solución de concentración mg / ml.
- Calentar la solución tamoxifeno a 65 ° C en un baño de agua hasta que la solución se vuelve transparente. Mantenga la solución en el baño hasta su uso.
- Aplicar pomada ocular en el ojo contralateral sin tratar para prevenir la deshidratación durante la anestesia. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el suficiente aireconciencia de mantener decúbito esternal. No devuelva los ratones que habían sido sometidos a ojo hiriendo a la compañía de los otros ratones hasta que se recupere totalmente. Los ratones se debe supervisar de cerca después de la lesión. En caso de que pierdan más del 10% de su peso corporal, sufren de erosión corneal, o incomodidad, el experimento debe ser detenido. Administración de analgésicos Repetir cada 24 horas durante todo el experimento.
- Con una jeringa estéril, sin aguja que se le atribuye; aplicar solución 200 l tamoxifeno por vía tópica sobre toda la superficie de la córnea de un ojo de cada ratón.
Nota: La solución líquida se solidifica rápidamente en la superficie del ojo a TA. El efecto de la lesión en la córnea depende de la gravedad de la herida. Después de una aplicación de la solución de tamoxifeno / DMSO no hay efectos adversos se observan en los ratones. En caso de aplicaciones repetidas se puede observar opacidad de la córnea. - Continúe con la preparación del tejido y de imagen (véase la seccióniones 5 y 6) en puntos de tiempo relevantes. Para los resultados que se muestran aquí, sacrifican los ratones (como se detalla en la etapa 5.1) de la herida de una semana (Figura 2 y 24).
Representative Results
Recientemente, hemos destinado a identificar el origen, la supervivencia y la migración de las células madre y células progenitoras del epitelio corneal 24. La acumulación de evidencia apoya el dogma de que el epitelio corneal se regenera las células madre localizadas exclusivamente en el nicho del limbo, una zona en forma de anillo en la periferia de la córnea. Esta teoría es apoyada por in vitro e in vivo de datos, y por la evidencia clínica que sirvió de base para la terapia de células madre del limbo exitosa pionera 27-29. Sin embargo, este tema quedó muy debatido en los últimos años debido a un estudio basado en experimentos de injerto del limbo que sugerían que el limbo del ratón no participa en la renovación de la córnea 30. Para probar esta hipótesis interesante, del linaje de rastreo experimentos con ratones se realizaron R26R-confeti, para seguir el destino de las células epiteliales madre / progenitoras del limbo corneal y en condiciones de estado estacionario para un máximo de 120 días 24.Los ojos fueron enucleados y de montaje en piso córneas fueron analizados por confocal espectral de fluorescencia de barrido láser microscopía de 10 y 120 días después de la inyección tamoxifeno. Como se esperaba, se observaron pequeños grupos esporádicos de células fluorescentes a lo largo de la superficie ocular 10 días después de la inyección, mientras que 1-4 meses después (Figura 2B y 24), estrías alargadas que se extienden desde el limbo hacia el centro de la córnea desarrollan lentamente. Este resultado sugiere que la córnea se regenera por las células que migran desde el limbo hacia el centro de la córnea. A continuación, se examinó la regeneración de la córnea bajo condiciones herida. Con el fin de probar el destino de las células de la córnea / limbares K14-positivos bajo condiciones hiriendo mientras que la inducción de seguimiento celular eficiente, que disolvió el tamoxifeno en sulfóxido de dimetilo (DMSO), que causa lesión de la córnea después de la aplicación tópica. De esta manera se logró inducir heridas leves si se aplicó una sola aplicación tópica (Figura 2C), mo desclasificar hiriendo si se aplicó tratamiento solo adicional DMSO en el día antes de la inducción tamoxifeno o una herida grave cuando DMSO solo se aplica tópicamente en 2 días consecutivos antes de la inducción de tamoxifeno.
En contraste con las rayas del limbo delgadas que poco a poco desarrollados y llegaron al centro de la córnea dentro de 4 meses en condiciones de estado estacionario, la migración celular después de la lesión fue rápida. Sorprendentemente, largas y gruesas rayas limbo ya se desarrollaron en estas condiciones el plazo de 7 días. Curiosamente, la diversidad de color a veces era mínima (Figura 2D). En nuestras manos, de vez en cuando, se identificaron principalmente glóbulos rojos en toda la córnea, lo que indica que la diversidad color puede ser sesgada hacia fluoróforos específicos. Este sesgo no deseado puede ser calibrado por medio de pruebas de dosis-respuesta como se informó anteriormente en Br1.0L 31 y en Br2.1 21.
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Figura 1. Ilustración esquemática del constructo R26R-confeti. (A) La construcción R26R-confeti contiene un promotor CAG para los altos niveles de expresión, un loxP (triángulo negro) -flanked Neo R -roadblock y el casete Brainbow2.1 en el locus Rosa26 16,21. El casete Brainbow2.1 incluye dos de cabeza a cola dímeros loxP-flanqueado. Un dímero formado por la proteína nuclear localizada verde fluorescente (GFP) y un citoplasmática proteína fluorescente amarilla orientada inversa (YFP, la orientación invertida se designa - OPU). La segunda dímero contiene RFP citoplasmática y una proteína fluorescente cian-membrana anclada orientada inversa (PPC, la orientación invertida se designa - PFC) 16. (B - E) Tras la activación Cre-recombinasa, se pueden producir diferentes eventos de escisión y de inversión; posibles resultados son ilustración coned en B - E. La actividad Cre induce reordenamiento estocástico del casete que conduce a el traslado de genes y / o inversiones y por lo tanto resulta en la expresión aleatoria de una de las cuatro proteínas fluorescentes. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
La Figura 2. Linaje Corneal rastreo en el marco homeostasis y lesiones. R26R-confetti / ratones K14-Cre fueron inyectados con 4 mg de tamoxifeno como se detalla en el protocolo. En el tiempo indicado puntos después de la inducción aplanado córneas fueron imágenes (A - B). Herida corneal junto con Cre inducción se logra mediante la aplicación tópica de tamoxifeno se disolvió en DMSO (C - D). Imágenes Mosaico obtienenpor multicanal embaldosado microscopía confocal espectral se muestran (A - D). En la homeostasis, rayas radiales del limbo de células que migran lentamente extendieron entre el limbo y el centro de la córnea. Estas rayas desarrollan lentamente, alcanzando el centro de la córnea dentro de 4-5 meses (B). Los racimos de células de la córnea fueron evidentes, así (flechas blancas, B). En contraste, grandes rayas limbares aparecieron dentro de una sola semana en condiciones hiriendo (C). Un ejemplo de sesgo de la diversidad de colores hacia las células rojas (D). La frontera del limbo corneal es anotado por una línea discontinua. La barra de escala es de 500 micras. Abreviaturas: PPC, proteína fluorescente cian; GFP, la proteína verde fluorescente; RFP, proteína fluorescente de color rojo; YFP, proteína fluorescente amarilla. Esta cifra se ha modificado desde el 24. Haga clic aquí para ver una versión más grande deesta figura.
Discussion
Lineage experimentos de rastreo han llevado a cabo durante muchos años. Los últimos avances tecnológicos y la aparición de las cepas de ratón confeti abrieron nuevas vías para la investigación. Hoy en día, los investigadores pueden beneficiarse de un gran número de disponibles comercialmente específicos de tejido Cre líneas, los ratones knockout y los ratones transgénicos. Esto proporciona una oportunidad para el diseño de sistemas versátiles experimentales para abordar cuestiones científicas con experiencia básica, evitando la práctica laboriosa, mientras que proporciona datos sólidos y fiables.
Ratones R26R-confeti son una herramienta elegante para el seguimiento eficiente y el estudio de la naturaleza y el comportamiento de las células en un organismo vivo. El sistema es fácil de establecer y permite el rastreo de linaje no invasiva de células individuales durante la embriogénesis, la regeneración de células madre bajo homeostasis, o bajo diferentes circunstancias tales como lesión, inflamación y cáncer. Los datos obtenible proporciona un descripta robustaion de la supervivencia de las células diana, la expansión clonal de células y la migración celular, de una manera cuantificable. Un paso crítico sería elegir la cepa de ratón genético apropiado que puede permitir con fiabilidad el etiquetado específico de tejido eficiente en una etapa de desarrollo precisa. Una limitación de este sistema es que para el seguimiento de un organismo vivo, el tejido debe ser accesible y transparente. Del mismo modo, el seguimiento de un tejido grueso en un animal vivo puede ser sólo facilitado por dos fotones o microscopía multi-fotón. Sin embargo, el seguimiento de celda disponible en secciones de tejido postmortem y quizás el tejido intacto puede estudiarse después de que ha sido transformado para convertirse en transparente por el método CLARITY 32,33. Otra limitación a tener en cuenta es que, aunque las células adyacentes que expresan el mismo fluoróforo probable que pertenecen al mismo linaje clonal, también es posible que se pueden derivar de origen celular independiente que expresa al azar el mismo gen fluorescente. Este possibilidad se hace muy poco probable cuando se utilizan múltiples alelos Br para permitir numerosas combinaciones.
En el futuro, combinando el sistema de confeti con herramientas genéticas disponibles (es decir, nocaut, modelos knockin y ratones transgénicos) que permitirá el estudio de los genes y sus mutaciones en la salud y la patología. Del mismo modo, el linaje de rastreo bajo diferentes perturbaciones del sistema (es decir, detener la destrucción nicho de células, mediada por láser de ablación celular, tratamiento farmacológico) aportará nuevos conocimientos sobre la participación de las vías de señalización en las decisiones del destino celular. En última instancia, el uso combinatorio de etiquetado fluorescente y bioluminiscencia, periodistas genéticos de las vías de señalización y corte microscopía borde será proporcionar a los investigadores un sistema robusto para aprender cómo las células solo responde a su entorno en su ambiente nativo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R26R-Confetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette | Jackson | strain #013731 | |
| K14-CreERT mice | Jackson | strain #005107 | |
| tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
| Carprieve 30 | b.wt | ||
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4 µg/ml |
| Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
| Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
| Duratears-eye ointment | Alcon |
References
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior. Dev Cell. 21, 394-409 (2011).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M.
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).
- Beck, B., Blanpain, C. Unravelling cancer stem cell potential. Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).
- Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration. Development. 106, 809-816 (1989).
- Eagleson, G. W., Harris, W. A. Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis. J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Snippert, H. J., Clevers, H.
- Snippert, H. J., et al. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin. Science. 327, 1385-1389 (2010).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
- Jaks, V., et al. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).
- Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip. Nature. 476, 409-413 (2011).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis. Kidney Int. 85, 972-980 (2014).
- Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. Generating and imaging multicolor Brainbow mice. Cold Spring Harb Protoc. , 763-769 (2011).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199, 293-306 (2015).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nat Methods. 10, 540-547 (2013).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 33, 157-169 (2015).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33, 230-239 (2015).
- Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337, 730-735 (2012).
- Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R.
- Collinson, J. M., et al. Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium. Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).
- Buck, R. C. Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).
- Nagasaki, T., Zhao, J. Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).
- Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface. Nature. 456, 250-254 (2008).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10, 508-513 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
