Introduction
Under embryonal utvikling, vev og organ morphogenesis skje gjennom et presist program som kan beskrives i form av celleproliferasjon, cellemigrasjon og avstamning spesifikasjon 1-4. Disse biologiske prosesser er også involvert i å opprettholde homeostase voksent vev, noe som krever stamcelle regenerering. Lineage tracing, identifisering og sporing av avkommet av en bestemt type cellepopulasjon, gir et viktig verktøy for å studere embryogenese og stamcelle homeostase. Faktisk er det i økende grad blir brukt i mange forskningsfelt. Spesielt ble avstamning tracing et viktig verktøy i å identifisere opprinnelsen og skjebnen til stamceller i homeostase og kreftutvikling. Dette er fordi det kan tilveiebringe viktig informasjon om hvordan cellen oppfører seg i sammenheng med intakt vev eller organisme, med minimal eksperimentell inngrep, i motsetning til celle isolering og in vitro-kultur eller transplantatipå som kan føre til uønsket skjevhet.
Tradisjonelt, fargestoffer som for eksempel lipid-oppløselige carbocyanine, som innlemme inn i plasmamembranen til celler, ble anvendt for avstamning tracing. Selv om slike forsøk har med hell ført til store oppdagelser og formede seminale begreper i utviklingsbiologi 5,6, har de noen begrensninger, blant annet vanskeligheter med å kontrollere spesifisiteten av målceller, den uønskede virkningen av fargestoffet på celle atferd og fortynningen av markøren over tid. Nukleotidanalog merking tilnærminger har aktivert dokumentere eksistensen av slow-sykling "label beholde celler" som antakelig tilsvarer stille stamceller 7,8. Men mens denne teknikken kan påvise langsomme sykkel celler basert på spredningskinetikk over en begrenset tidsperiode det ikke kunne gi betydelige innsikt om funksjonaliteten til stamceller. En optimal avstamning tracing methodology skal minimere effekten av merkingen på egenskapene til den markerte cellen, dets avkom, eller dens naboer. I tillegg vil det være fordelaktig å ha kontroll på merkingen induksjon, nemlig å ha mulighet for å merke cellepopulasjonen av interesse ved et trinn og tidsavhengig måte, så vel som i en enkelt celle (klonale) måte. En stabil og irreversibel merking metode som er sendt videre til alle avkom av grunnleggeren cellen er viktig slik at etiketten ville bli beholdt over tid, og ikke overføres til nabocellene.
Flere nylig, ble genetiske metoder for celle merking utviklet. I disse systemene kan cellespesifikke promotere brukes til å utløse Cre rekombinase uttrykk for å fjerne et loxP-flankert hindring og tillate ekspresjon av rapportørgener slik som grønt fluorescerende protein eller Β-galaktosidase-reportergener 9-13. Denne tilnærmingen muliggjør ikke bare sporing av celler og deres avkom, men tillater også celle erolation og molekylær karakterisering. Celle sporing på celle-nivået ble mulig ved induksjon av ekspresjonen av en enkelt fluorescerende reportergen. En viktig begrensning ved dette system er det faktum at bare når meget lav prosentandel av celler som er merket det er mulig å separere og spore individuelle kloner. For å overvinne denne begrensningen flerfarget journalister kan brukes. Når du bruker flerfarget merking, kan sporing av differensial skjebnen til nabocellene i samme nisje oppnås effektivt 14-17. Nylig ble en rekke Brainbow (BR) alleler utviklet for avstamning tracing eksperimenter, slik at en stokastisk uttrykk for flere fluorescerende reporter gener utnytte Cre / lox system. Den Cre / lox Systemet består av en Cre rekombinase enzym, som gjenkjenner og binder til spesifikke DNA-sekvenser som loxP-seter. Etter binding av Cre rekombinase, stedsspesifikke rekombinasjon skjer, noe som fører til fjerning av loxP flankert sekvenser resulting i tilfeldig ekspresjon av forskjellige fluorescerende proteiner (mekanismen er beskrevet nedenfor). En rekke Br linjene er tilgjengelig for bruk (se vurderinger 16,18,19). De store forskjellene mellom Br stammer inkluderer (i) forskjeller i antall fluorescerende gener som inngår i kassetten, alt fra 2 (Br 2,0), 3 (Br1.0) til 4 (Br1.1, Br2.1) fluorescerende gener , (ii) nærværet av gjensidig orientert lox sider for å tillate gen inversjon (Br2.0-2.1), (iii) den type lox områder som benyttes, og (iv) ekspresjon eller stillheten av fluorescerende genekspresjon før Cre aktivering. Det nylig etablerte BR3 tilbyr en forbedret metode for flerfarget avbildning av nerveceller. En av de viktigste funksjonene i denne transkripsjon er at den inneholder et nytt sett med fotostabile farnesylated fluorescerende proteiner, som gjør en enda farging av de fineste nevronale behandler 20.
Viktigere, kan forskjellige versjoner av Br kassetter inneholde nevronale bestemt Thy1 promoter eller overalt uttrykt CAG (CMV) promoter. Til slutt, mens noen av de Br transgene mus kan inneholde en enkelt Br transgen, mens andre kan bestå av flere transgene eksemplarer, for derved å tillate fremstilling av et enormt antall muligheter for fargekombinasjoner skal uttrykkes i hver celle (se for eksempel 16).
I vår studie har vi brukt R26R-Confetti mus som inneholder Br 2,1 kassett 21. Br2.1 er unikt designet for å tillate Cre-mediert DNA inversjoner og ikke bare excisions grunn av gjensidig orientering av loxP områder (figur 1). Således kan disse inversjon / eksisjons- hendelser som fører til fargeendring fortsette så lenge Cre er til stede 16. Av den grunn er en induserbar temp Cre uttrykk system viktig for pålitelig celle sporing ved hjelp Br2.1. Som vist i fig. 1, inneholder Br2.1 en allestedsnærværende CAG promoter fulgt av loxP-flankert Neo R -cassette, som fungerer som en transkripsjons veisperring, som er etterfulgt av 4 fluorescerende reporter gener, koding for grønn (GFP), gul (YFP), rød (RFP) og cyan (CFP) fluorescerende proteiner, plassert i to tandemsykler. Ingen fluorescens er uttrykt før Cre aktivering. Induksjon av Cre rekombinase bevirker fjerning av Neo-R-kassetten slik at den tilfeldige ekspresjon av en av de 4 fluorescerende proteiner i en gitt celle. Det første segmentet inneholder loxP-flankert GFP og en reversert YFP, mens det andre segment inneholder loxP-flankert RFP og en reversert CFP. Disse DNA-segmenter fortløpende kan byttes om (ved hjelp av loxP det vil si i motsatt retning) eller utskåret, så lenge Cre rekombinase er til stede. Derfor bør en forbigående og kontrollert Cre transgenet benyttes. Den Br2.1 kassetten gir et godt system for å skjelne mellom overlappende utslipp ved signal sted: ekspresjon av YFP og RFP er cytoplasmisk, GFP er atom og CFP er bundet til cellemembranen. GFPog RFP utslipp lett separeres ved hjelp av konvensjonell fluorescerende mikroskopi. For å skille YFP / GFP / CFP-utslipp, er en spektral confocal imaging system nødvendig. Alt i alt tillater Br2.1 kassetten tilfeldig, induserbare og vevsspesifikke ekspresjon av en av fire forskjellige fluorescerende gener i hvert målrettet celle. Faktisk, når et større antall fargekombinasjoner er nødvendig, kan man generere homozygote mus som inneholder 2 alleler av Br2.1, noe som resulterer i ekspresjonen av 2 fargekoder for hver celle, og i å øke antall mulige fargekombinasjoner til 10 22. Noen av de Br musestammer muliggjøre ekspresjon av et mye større antall mulige fargekombinasjoner ettersom flere kopier av kassetten ble integrert inn i deres genom 16. Men i de fleste tilfeller de fire fargekombinasjoner som leveres av en enkelt Br2.1 allel er tilstrekkelig. Etter protokollen gitt her, kan man etablere denne metoden bruker en relativt enkel oppsett av spectral mikroskopi med lite, om noe behov for kalibrering.
Her gir vi en tilpasningsdyktig protokoll for anvendelse av R26R-Confetti mus som inneholder en enkelt Br2.1 allel, for sporing avstamning eksperimenter cornealepitelets. Dette transgen musestamme er blitt benyttet for å studere sted skjebnen til tykktarm 21,23 og corneale epitele stamceller 22,24, tilstedeværelse av stamcelle-aktivitet i intestinal cancer 25, og for å karakterisere nyre podocyte i fokal segmentell glomerulosklerose (FSGS) 17.
Protocol
Etikk redegjørelse: I denne studien dyr omsorg og bruk ble likedannet ARVO erklæringen for bruk av dyr i Ophthalmic og Vision Research. Alle forsøkene ble godkjent av lokale etiske komité.
1. Velg et egnet Cre-rekombinase uttrykke Mouse Strain
- Ut av den store variasjonen av Cre transgene linjer tilgjengelig for kjøp 26 og avhengig av målrettet vevet som skal undersøkes, velg en Cre transgen musestamme der Cre rekombinasegenet styres av en promoter som er spesifikk for vevet av interesse. I tilfelle temporal kontroll er nødvendig, velger du en induserbar Cre linje.
Merk: Vi valgte tamoxifen induserbar K14-Cre ERT transgen å spesifikt merke limbale og hornhinneepitelet stilk / stamceller 24. Merk at det kan være forskjeller mellom stammer, som Di Girolamo og kolleger rapporterte limbale spesifisitet uten hornhinne uttrykk for sin K14-Cre ERT 22. En fordel ved å bruke induserbare transgene Cre mus er at det tillater induksjon av avstamning sporing på allsidige tidsrammer.
2. velge et passende Br Mouse Strain
- Velg riktig Br kassett avhengig av problemstilling og tilgjengelig Cre linje 16,18,20.
- Hvis en ikke-induserbar Cre mus belastning brukes, velger du en Br kassett som ikke tillater kontinuerlig DNA inversjoner / excisions og dermed gi opphav til dead-end produkter (for eksempel Br1.0 eller Br1.1) 16.
3. Kryss transgene linjer av interesse
- For protokollen vist her, krysser homozygot R26R-Confetti stamme (Br2.1 / Br2.1) med homozygot Cre ERT stamme (Cre ERT / Cre ERT) for å oppnå hemizygous avkom (Br2.1 / +; Cre / +) som er klare for mono-allelisk lineage tracing som de alle inneholder et enkelt allel og en Br2.1singel Cre allel.
Merk: For å øke effektiviteten av merking, kan man generere mus som inneholder to Grobunn alleler (Br2.1 / +, Cre / Cre), mens to Br2.1 alleler (Br2.1 / Br2.1; Cre / +) ville øke fargekombinasjoner (som beskrevet i 22).
4. Cre-rekombinase Induksjon
Merk: Administrering av Tamoxifen i disse eksperimentene ble utført ved daglig intraperitoneal injeksjon, i løpet av 3-4 dager, for å indusere translokasjon av Cre rekombinase ERT inn i kjernen av limbale og korneal basal K14-stammen positive / progenitor epitelceller. Den følgende protokoll kan benyttes for injeksjon av fire mus. Alternativt gir topisk påføring av Tamoxifen til den okulære overflaten høyere effektivitet. Den Tamoxifen løsning kan holdes i mørke ved 4 ° C i opptil en uke. Varm løsningen før bruk.
- Veier 100 mg av Tamoxifen og oppløse den i 5 ml maisolje tildannelse av en 20 mg / ml oppløsning tamoxifen.
- Injisere 200 ul Tamoxifen (4 mg) oppløsning intraperitonealt til 8 uker gamle mus i 3-4 etterfølgende dager.
Merk: Tamoxifen løsning kan holdes i mørke ved 4 ° C i opptil en uke. Varm løsningen før bruk. - For topisk applikasjon: veier 60 mg av Tamoxifen og oppløse den i 1 ml maisolje for å danne en 60 mg / ml oppløsning tamoxifen. Vortex og setter oppløsningen i et ristende vannbad som ble holdt ved 65 ° C før det blir klart permisjon det i badekaret før bruk.
- Nøye 100 ul av den Tamoxifen løsning til hver okulær overflate av mus.
5. Vevspreparering for Imaging
- Ofre dyr med isofluran (2% fordampet i oksygen) anestesi (bekrefte riktig anesthetization av mangel på reflekser) etterfulgt av CO 2 innånding ved passende tidspunkter følgende Tamoxifen injeksjon og colge relevant vev.
- For disse eksperimentene, enucleate øyne på de følgende tidspunkter: 1, 4, 8, 12 og 16 uker etter injeksjon Tamoxifen. Oppnå enucleation ved hjelp buede tang. Trykk øyelokkene forårsaker øyeeplet for å sprette ut av øyehulen. Plasser tang bak øyeeplet holde synsnerven. Dra forsiktig øyeeplet og løsne det.
Merk: I denne fasen, som beskrevet nedenfor, vev kan fremstilles for wholemount analyse av merkede celler. Jevn frosne vevssnitt kan også fremstilles, fiksert i PFA og avbildes som beskrevet nedenfor (se avsnitt 6 og 22).
- For disse eksperimentene, enucleate øyne på de følgende tidspunkter: 1, 4, 8, 12 og 16 uker etter injeksjon Tamoxifen. Oppnå enucleation ved hjelp buede tang. Trykk øyelokkene forårsaker øyeeplet for å sprette ut av øyehulen. Plasser tang bak øyeeplet holde synsnerven. Dra forsiktig øyeeplet og løsne det.
- Plassere hvert øye i en 60 mm skål fylt med PBS.
- Under et stereomikroskop ved hjelp av tang holde øye nær den optiske nerven med hornhinnen vendt ned og bruke en skalpell for å fjerne den optiske nerve, muskel og bindevev og foreta et lite snitt i den bakre del av øyet.
- Bruke våren saks nøye forstørrekutte la objektivet sprette ut og fjerne iris bruker tang.
- Flate hornhinnen ved å gjøre 4-5 radielle snitt start fra sentrum mot periferi ved hjelp av en skalpell.
- Bruk en skalpell til å kutte overflødig perifert vev utover limbus.
- Fiks hornhinner i 4% PFA i 10 min, deretter kort vask dem med PBS.
- Inkuber prøver med DAPI i 10 minutter og vasker kort med PBS.
- Mount hornhinner på glassplater med epiteliale siden opp. Plasser en dråpe montering media på toppen av hornhinnen og dekselet med en cover-glass. La lysbilder tørke O / N i RT. Hold lysbilder ved 4 ° C.
6. Konfokalmikroskopi og Imaging Analysis
- Bruk en spektral confocal system som gjør det mulig separasjon av YFP / GFP / CFP utslipp. Set fluorescenseksitasjon og emisjonsbølgelengder, avhengig av de fluorescerende proteiner av Br kassetten. Velg den mest passende eksitasjonsbølgelengden for hvert protein sikte på å minimere korseksitasjon. Velge smale emisjonsområder for å minimalisere lekkasjen av signaler fra de forskjellige proteiner.
- For Br2.1 kassetten, bruker følgende oppsett av fluorescenseksitasjon (ex) og utslipp (em) som utgangspunkt: DAPI - ex 405 nm / em 420-480 nm, CFP - ex 458 nm / em 470-500 nm, GFP - ex 488 nm / em 497-508 nm, YFP - ex 514 nm / em 529-540 nm, og RFP - ex 561 nm / em 575-615 nm.
- For å visualisere store vevsområder med høy oppløsning, erverve flis imaging. For resultatene vist i figur 2A-B, bilde hele hornhinnen ved å skaffe en matrise på 12 x 12 bilder, dvs. skaffe 144 felt (512 x 512) ved bruk av 4 fluorescerende kanaler i hvert felt. Tilsammen samle 576 bilder, og deretter flette.
- For å utforske lokalisering av merket celler i ulike dybder og strukturer i vevet, erverve Z-stack bilder av ulike regioner av interesse. For to image full dybde av hornhinnen, erverve 8 optiske seksjoner på 3 mikrometer intervaller. Ortogonale visninger av seksjonene innsamlede samt bildeprojeksjoner basert på maksimal intensitet kan konstrueres ved hjelp av konvensjonelle bilde programvare 24.
7. skade på hornhinnen Kombinert med Tamoxifen Induksjon
- Bedøve mus med isofluran (2% fordampes i oksygen), og administrere analgetika (10 mg / kg Carpofen, injisert subkutant). Bekreft riktig anesthetization ved manglende respons på tå-klemme.
- Vei 1 g av Tamoxifen pulver og oppløse den i 5 ml sterilt DMSO for å gi 200 mg / ml konsentrasjon oppløsning.
- Varm Tamoxifen løsningen til 65 ° C i et vannbad inntil løsningen blir klar. Hold oppløsningen i badet inntil bruk.
- Påfør øye salve til ubehandlet kontralaterale øyet for å unngå dehydrering under anestesi. Ikke la et dyr uten tilsyn før det har gjenvunnet tilstrekkelig conav bevissthet for å opprettholde sternal recumbency. Ikke returnere musene som hadde gjennomgått øye såret i selskap med andre mus til fullt restituert. Mus bør overvåkes nøye etter skaden. Dersom de mister mer enn 10% av sin kroppsvekt, lider av korneal erosjon, eller ubehag, må forsøket stoppes. Gjenta analgetika administrering hver 24. time i løpet av hele eksperimentet.
- Ved hjelp av en steril sprøyte, uten at en nål festet til den; anvende 200 ul Tamoxifen løsning topisk over hele overflaten av hornhinnen ett øye av hver mus.
Merk: Den flytende løsning stivner raskt på øyets overflate ved RT. Effekten av korneal skade avhenger av alvorligheten av såret. Etter ett program av Tamoxifen / DMSO løsning ingen bivirkninger er observert i mus. Ved gjentatte søknader hornhinne kan observeres. - Fortsett med vev forberedelse og imaging (se sektioner 5 og 6) på relevante tidspunkter. For de som vises her, resultater, ofre musene (som beskrevet i trinn 5.1) én uke etter såret (figur 2 og 24).
Representative Results
Nylig, rettet vi på å identifisere opprinnelsen, overlevelse og migrasjon av stamceller og stamceller av cornealepitelets 24. Akkumulere bevis støtter dogme at cornealepitelets regenereres av stamceller ligger utelukkende i limbale nisje, en ringformet sone på hornhinnen periferien. Denne teorien støttes av in vitro og in vivo data, og ved kliniske bevis som ga grunnlag for vellykket pioner limbale stamcelleterapi 27-29. Men dette emnet forble sterkt debattert i de siste årene på grunn av en studie basert på limbale pode eksperimenter som antydet at musen limbus ikke deltar i hornhinnen fornyelse 30. For å teste dette interessant hypotese, til avstamning tracing eksperimenter ved hjelp R26R-Confetti mus ble utført, følger skjebnen til limbale og hornhinneepitel stilk / stamceller under konstante forhold i opp til 120 dager 24.Øynene ble enucleated og flat-mount hornhinner ble analysert ved spektral confocal laser scanning fluorescens mikros 10 og 120 dager etter Tamoxifen injeksjon. Som forventet, ble det observert små sporadiske klynger av fluorescerende celler som observeres i den okulære overflaten 10 dager etter injeksjon, mens 1-4 måneder senere (figur 2B og 24), langstrakte partier som strekker seg fra limbus til hornhinnen midten langsomt utviklet. Dette resultatet tyder på at hornhinnen regenereres ved celler som migrerer fra limbus mot midten av hornhinnen. Deretter ble hornhinnen regenerering etter såret forhold undersøkes. For å teste skjebnen til K14-positive limbale / corneale celler i henhold til såret betingelser, mens det induseres effektiv celle sporing, oppløste vi Tamoxifen i dimetylsulfoksid (DMSO), noe som fører til skade på hornhinnen ved topisk applikasjon. På denne måten klarte vi å indusere mild såret hvis en enkelt lokal applikasjon ble påført (figur 2C), mo redusere belastningen såret hvis ytterligere DMSO alene behandling ble brukt i dag før Tamoxifen induksjon eller alvorlig såret da DMSO alene ble topikalt i 2 sekvensielle dager før Tamoxifen induksjon.
I motsetning til de tynne limbale striper som sakte utviklet og nådde hornhinnen sentrum innen 4 måneder etter steady-state, cellemigrasjon etter skade var rask. Bemerkelsesverdig, ble lange og tykke limbale striper allerede utviklet under disse forholdene innen 7 dager. Interessant, farge mangfold var noen ganger minimal (figur 2D). I våre hender, noen ganger, hovedsakelig røde celler ble identifisert i hele hornhinnen, noe som indikerer at farge mangfold kan være forutinntatt mot spesifikke fluorophores. Dette uønsket skjevhet kan kalibreres ved doseresponstester som tidligere rapportert i Br1.0L 31 og i Br2.1 21.
les / ftp_upload / 53370 / 53370fig1.jpg "/>
Figur 1. Skjematisk illustrasjon av R26R-konfetti konstruksjon. (A) Den R26R-konfetti konstruksjonen inneholder en CAG promoter for høye uttrykk nivåer, en loxP (svart trekant) -flanked Neo R -roadblock og Brainbow2.1 kassett på Rosa26 locus 16,21. Den Brainbow2.1 kassett inkluderer to head-to-tail loxP-flankert dimerer. En dimer består av kjernefysisk-lokaliserte grønt fluorescerende protein (GFP) og en omvendt-orientert cytoplasmic gul fluoriserende protein (YFP, invers orientering er utpekt - PFY). Den andre dimer inneholder cytoplasma RFP og en omvendt-orientert membran-tethered cyan fluorescerende protein (CFP, invers orientering er utpekt - PFC) 16. (B - E) Ved Cre-rekombinase aktivering, kan ulike eksisjons- og inversjon oppstår hendelser; mulige utfall er exemplified i B - E. Den Cre aktivitet induserer stokastisk omorganisering av kassetten fører til genet flytting og / eller inversjoner og dermed resulterer i tilfeldig uttrykk for en av de fire fluorescerende proteiner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Hornhinne avstamning sporing etter homeostase og skade. R26R-konfetti / K14-Cre mus ble injisert med 4 mg Tamoxifen som beskrevet i protokollen. I angitte tidspunkter poste induksjon flatet hornhinner ble fotografert (A - B). Hornhinnen såret kombinert med Cre-induksjon ble oppnådd ved topisk påføring av Tamoxifen oppløst i DMSO (C - D). Mosaikkbilder innhentetav flerkanals flislegging spektral konfokalmikroskopi er vist (A - D). I homeostase, radiale limbale striper av langsomme trekkende celler utvidet mellom limbus og hornhinnen sentrum. Disse stripene utviklet seg sakte, nå hornhinnen sentrum innen 4-5 måneder (B). Klynger av hornhinneceller var tydelig så vel (hvite piler, B). I motsetning til dette store limbale streker viste seg i løpet av en enkelt uke etter såret betingelser (C). Et eksempel på forspenningen av farge mangfold mot røde celler (D). Den limbale-hornhinnen grensen blir kommentert av en stiplet linje. Scale bar er 500 mikrometer. Forkortelser: CFP, cyan fluorescerende protein; GFP, grønt fluorescerende protein; RFP, rød fluorescerende protein; YFP, gul fluoriserende protein. Dette tallet har blitt forandret fra 24. Klikk her for å se en større versjon avdette tallet.
Discussion
Lineage tracing eksperimenter har blitt utført i mange år. De siste teknologiske forbedringer og fremveksten av Confetti musestammer åpnet nye veier for forskning. Dag, kan forskere ha nytte av et stort antall kommersielt tilgjengelige vevsspesifikke Cre linjer, knockout-mus og transgene mus. Dette gir en mulighet for å designe allsidig eksperimentelle systemer for adressering vitenskapelige spørsmål med grunnleggende kompetanse, unngå arbeidskrevende praksis, samtidig som det gir robuste og pålitelige data.
R26R-Confetti mus er et elegant verktøy for effektiv sporing og studere naturen og oppførselen til cellene i en levende organisme. Systemet er enkelt å etablere og det tillater ikke-invasiv avstamning sporing av enkeltceller under embryogenese, stamcelle regenerering etter homeostase, eller under andre omstendigheter som skade, betennelse og kreft. Oppnåelig data gir et robust beskrivendeion av overlevelse av målrettede celler, celle klonal ekspansjon og cellemigrasjon, på en kvantifiserbar måte. Et kritisk skritt vil være å velge riktig genetisk musestamme som kan sikkert tillate effektiv vevsspesifikk merking på en presis utviklingsstadiet. En begrensning ved dette system er at for å overvåke en levende organisme, må vevet være tilgjengelig og gjennomsiktig. Tilsvarende sporing av et tykt vev i et levende dyr, kan bare lettes ved to-foton eller multi-foton mikroskopi. Imidlertid er celle sporing mulig på postmortem vevssnitt og kanskje intakt vev kan bli studert etter at den har blitt transformert til å bli gjennomsiktig ved KLARHET metode 32,33. En annen begrensning tas i betraktning, er at selv om tilstøtende celler som uttrykker det samme fluoroforen sannsynligvis tilhører samme klonale avstamning, er det også mulig at de kan være avledet fra uavhengige celleopprinnelse som tilfeldig uttrykk for det samme fluorescerende genet. Dette possibility blir svært usannsynlig når du bruker flere Br alleler å tillate en rekke fargekombinasjoner.
I fremtiden kombinere Confetti system med tilgjengelige genetiske verktøy (dvs. knockout, Knockin og transgene musemodeller) vil tillate studiet av gener og deres mutasjoner i helse og patologi. Likeledes, avstamning sporing under forskjellige system forstyrrelser (dvs. stamcelle nisje ødeleggelse, laser mediert celle ablasjon, medikamentell behandling) vil bringe ny innsikt på involvering av signalveier i cellen skjebne beslutninger. Til syvende og sist den kombinatoriske bruk av fluoriserende og bioluminescens merking, vil genetiske journalister av signalveier og cutting edge mikros gi forskerne et robust system for å lære hvordan enkeltceller svare på deres rundt i sitt opprinnelige miljø.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| R26R-Confetti transgenic mice homozygous for the Brainbow 2.1 cassette | Jackson | strain #013731 | |
| K14-CreERT mice | Jackson | strain #005107 | |
| tamoxifen | Sigma | T5648 | |
| isoflurane USP Terrell | Piramal Critical Care | ||
| Carprieve 30 | b.wt | ||
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | used at concentration of 4 µg/ml |
| Immu Mount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| LSM 510 Meta laser scanning confocal system hooked to an inverted motorized microscope (Axiovert 200M) equipped with a motorized stage | Zeiss | The spectral overlap between GFP, YFP and CFG requires the use of spectral imaging which allows the separation of the emission spectra of the fluorescent proteins. Here we use the Zeiss LSM 510 Meta spectral confocal microscope. The Meta detector included in this system has 32 detector elements each collecting emission from a 10-nanometer waveband. This technique termed "spectral fingerprinting" enables the user to set the most adequate limits for waveband filtering. There is a variety of spectral confocal systems that can be used, including Leica SP5(ref #21), SP8, Zeiss LSM 780 (ref #22). | |
| Zen 2009 Imaging Software | Zeiss | ||
| Duratears-eye ointment | Alcon |
References
- Buckingham, M. E., Meilhac, S. M. Tracing cells for tracking cell lineage and clonal behavior. Dev Cell. 21, 394-409 (2011).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M.
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14, 489-502 (2013).
- Beck, B., Blanpain, C. Unravelling cancer stem cell potential. Nat Rev Cancer. 13, 727-738 (2013).
- Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. A vital dye analysis of the timing and pathways of avian trunk neural crest cell migration. Development. 106, 809-816 (1989).
- Eagleson, G. W., Harris, W. A. Mapping of the presumptive brain regions in the neural plate of Xenopus laevis. J Neurobiol. 21, 427-440 (1990).
- Cotsarelis, G., Cheng, S. Z., Dong, G., Sun, T. T., Lavker, R. M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate: implications on epithelial stem cells. Cell. 57, 201-209 (1989).
- Zhang, J., et al. Identification of the haematopoietic stem cell niche and control of the niche size. Nature. 425, 836-841 (2003).
- Snippert, H. J., Clevers, H.
- Snippert, H. J., et al. Lgr6 marks stem cells in the hair follicle that generate all cell lineages of the skin. Science. 327, 1385-1389 (2010).
- Morris, R. J., et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol. 22, 411-417 (2004).
- Barker, N., et al. Lgr5(+ve) stem cells drive self-renewal in the stomach and build long-lived gastric units in vitro. Cell Stem Cell. 6, 25-36 (2010).
- Jaks, V., et al. Lgr5 marks cycling, yet long-lived, hair follicle stem cells. Nat Genet. 40, 1291-1299 (2008).
- Rinkevich, Y., Lindau, P., Ueno, H., Longaker, M. T., Weissman, I. L. Germ-layer and lineage-restricted stem/progenitors regenerate the mouse digit tip. Nature. 476, 409-413 (2011).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506, 322-327 (2014).
- Livet, J., et al. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450, 56-62 (2007).
- Tao, J., Polumbo, C., Reidy, K., Sweetwyne, M., Susztak, K. A multicolor podocyte reporter highlights heterogeneous podocyte changes in focal segmental glomerulosclerosis. Kidney Int. 85, 972-980 (2014).
- Weissman, T. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W., Livet, J. Generating and imaging multicolor Brainbow mice. Cold Spring Harb Protoc. , 763-769 (2011).
- Weissman, T. A., Pan, Y. A. Brainbow: new resources and emerging biological applications for multicolor genetic labeling and analysis. Genetics. 199, 293-306 (2015).
- Cai, D., Cohen, K. B., Luo, T., Lichtman, J. W., Sanes, J. R. Improved tools for the Brainbow toolbox. Nat Methods. 10, 540-547 (2013).
- Snippert, H. J., et al. Intestinal crypt homeostasis results from neutral competition between symmetrically dividing Lgr5 stem cells. Cell. 143, 134-144 (2010).
- Di Girolamo, N., et al. Tracing the fate of limbal epithelial progenitor cells in the murine cornea. Stem Cells. 33, 157-169 (2015).
- Sato, T., et al. Paneth cells constitute the niche for Lgr5 stem cells in intestinal crypts. Nature. 469, 415-418 (2011).
- Amitai-Lange, A., et al. Lineage tracing of stem and progenitor cells of the murine corneal epithelium. Stem Cells. 33, 230-239 (2015).
- Schepers, A. G., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337, 730-735 (2012).
- Feil, S., Valtcheva, N., Feil, R.
- Collinson, J. M., et al. Clonal analysis of patterns of growth, stem cell activity, and cell movement during the development and maintenance of the murine corneal epithelium. Dev Dyn. 224, 432-440 (2002).
- Buck, R. C. Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 26, 1296-1299 (1985).
- Nagasaki, T., Zhao, J. Centripetal movement of corneal epithelial cells in the normal adult mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44, 558-566 (2003).
- Majo, F., Rochat, A., Nicolas, M., Jaoude, G. A., Barrandon, Y. Oligopotent stem cells are distributed throughout the mammalian ocular surface. Nature. 456, 250-254 (2008).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140, 2835-2846 (2013).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10, 508-513 (2013).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9, 1682-1697 (2014).
