Introduction
Der Eintrag von Influenza-A-Virus (IAV) ist ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Bindung des Virus an Rezeptoren auf der Plasmamembran von Zielzellen 1 beginnt. Der Rezeptor für die IAV Sialinsäure, die auf einer Vielzahl von Glykoproteinen und Glykolipiden vorliegt. Das Hämagglutinin (HA) Proteins der IAV, die in der Virushülle vorhanden ist bindet an Sialinsäure und vermittelt so die Befestigung der viralen Partikel in der Plasmamembran von Zielzellen 2. Das Virus tritt in die Zellen über Clathrin-vermittelte Endozytose, sondern auch alternative Eintrittswege wie Makropinozytose, beschrieben worden, 3-6. Die Wechselwirkung zwischen HA und Sialinsäure ausreichend erscheint zum Vermitteln sowohl Befestigung und Auslösen Internalisierung von Viruspartikeln 7 sein. Dennoch alternative Eingabe Rezeptoren wurden vorgeschlagen und ihre Rollen in IAV Eintrag werden derzeit untersucht 1,8,9.
CurBeauty Preis werden Anstrengungen unternommen, um Wirtsfaktoren, die im viralen Lebenszyklus mit dem Ziel der Entwicklung von dringend benötigten neuen antiviralen Therapien 10-12 beteiligt sind, zu identifizieren. Virus Eintrag würde eine günstige Schritt für die Ausrichtung IAV Wachstum, um eine virale Infektion in seinen frühesten Zeitpunkt zu blockieren. Mess verschiedenen Stadien der IAV Eintrag experimentell ist anspruchsvoll wie in der Regel große Mengen des Virus erforderlich sind, um eingehende Virus zu erkennen. Zusätzlich kann der Erfassungsbereich für Änderungen in den Eintritt des Virus ist nur linear durch das Fehlen der viralen Replikation. Dies unterstreicht die Notwendigkeit von Tests mit hoher Empfindlichkeit.
Der Test wir hier erlaubt den Nachweis gebunden Virus an der Zelloberfläche als auch internalisiert Nachweis von Viren in Bezug auf die Gesamtmenge der Zell-assoziierten Virus. Die Verwendung von biotinylierten Wildtyp-Virus ermöglicht die bequeme Messung durch Färbung mit STV-Cy3 und Auslesen mittels Durchflusszytometrie. Biotinylierte Virus ist kalt gebunden an Zells, um die Befestigung zu ermöglichen, sondern verhindern, Internalisierung von Viruspartikeln. Die Zellen können fixiert werden, permeabilisiert und mit STV-Cy3 gefärbt, um die angeschlossenen Virus zu messen. Das Signal von extrazellulären, befestigt Virionen können aufgehoben werden, wenn ein Blockierungsschritt vor der Fixierung in dem die Zellen mit nicht-markiertem Streptavidin (STV) inkubiert aufgetragen. In einem nächsten Schritt, nach Bindung von biotinyliertem IAV, Temperatur wird auf 37 ° C verschoben und Internalisierung von viralen Partikeln stattfinden darf. Internalisierten Partikel von Bindung von STV dadurch die Unterscheidung zwischen extra- und intrazellulärer Viren so geschützt.
Pro Versuchsbedingung werden vier Proben erforderlich: '0 min ": Die erste Probe, bezeichnet mit" 0 min "zu kalt gebundenen Virus an der Zelloberfläche zu messen. '0 min + STV': Die zweite Probe, '0 min + STV' markiert sind, gibt die Basissignalintensität des Experiments. Befestigt Virus blockiert with STV und das Signal nach Färbung mit STV-Cy3 sollte viel niedriger im Vergleich zu den "0 min" Probe sein. '30 Min ": Die dritte Probe, '30 min 'enthält befestigt und internalisiert Virus infolge der Temperaturverschiebung auf 37 & deg; C für 30 min. '30 Min + STV ': Die vierte Probe, '30 min + STV "Maßnahmen der intrazelluläre Anteil von Viren. STV Blockierungsschritt nach dem 30 min Inkubationszeit aufgetragen. Als Ergebnis werden Viruspartikel an der Zelloberfläche durch STV wobei nur internalisiert Viren zur Verfügung Färbung mit STV-Cy3 gebunden. Die relative Menge internalisiert Virus kann als das Verhältnis der internalisierten Virus (im '30 min + STV 'gemessene Probe) dividiert durch die Gesamtvirusmenge (von der '30 min beschriebenen "Probe) berechnet werden.
Als Kontrollen schlagen wir vor, mock-infizierten Zellen enthalten. Das Signal nach STV-Cy3-Färbung von mock-infizierten Zellen gibt den Hintergrunddie sich aus dem Färbungsprotokoll. Eine Steuerung für IAV Befestigung ist die Vorbehandlung von Zellen mit bakteriellen Neuraminidase (NA). NA abspaltet Sialinsäure von zellulären Glykoproteine, wodurch Befestigungs Rezeptoren von der Zelloberfläche zu entfernen. Natriumazid (SA) ist ein potenter Inhibitor metabolischen und dadurch blockiert Endozytose 13. Zellen mit Natriumazid sollte positiv für Virusbindung, aber negativ für die Internalisierung sein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Beachten Sie vor dem Start: Verwenden Sie Laminarströmungshaube und geeignete biocontainment bei der Arbeit mit Lebendvirus. Hier beschreiben wir das Wachstum geeigneten Bedingungen, um Kulturinfluenzavirusstamm A / WSN / 33. Multiplizität der Infektion (MOI) und Inkubationszeiten können je nach Virusstamm variieren.
1. Herstellung von biotinyliertem A / WSN / 33-Virus
- Samen Madin-Darby canine kindey Zellen (MDCK) in eine T175 cm 2 -Kolben mit Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% FBS und 1% Penicillin-Streptomycin (Pen / Strep) ergänzt. Kulturzellen bei 37 ° C bis ungefähr 70% Konfluenz erreicht wird.
- Vor der Infektion zu entfernen Medium und wäscht die Zellen mit phosphatgepufferter Salzlösung (PBS, pH7.0-7.3) durch Zugabe einer ausreichend großen Volumen, um die Zellschicht zu bedecken.
- Entfernen PBS und infizieren Zellen mit A / WSN / 33 mit einer MOI von 10 -4. Verdünnte Virus in PBS, ergänzt mit 0,02 mg Mg 2+, 0,01 mg Ca 2+ </ sup>, 0,3% Rinderserumalbumin (BSA) und 1% Pen / Strep (Infektion-PBS). Verwenden Sie ein Inokulum von 4 ml für eine T175 cm 2-Kolben.
- Inkubiere Zellen 1 h bei 37 ° C. Entfernen Inokulum durch Aspiration und Pipette 10 ml DMEM mit 0,3% BSA, 20 mM HEPES und 1% Pen / Strep in den Kolben ergänzt.
- Zellen bei 37 ° C für etwa 3 Tage bis cytopathischen Effekt (CPE) zu sehen ist, und dann Ernte Standes. CPE als Aufrundung der Zellen, gefolgt von Ablösung und Tod von Zellen 14 erkannt werden.
- Spinüberstand bei 450 · g für 5 min, um die Zelltrümmer zu entfernen. Übertragen Überstand in ein neues Falcon-Röhrchen und ein weiteres Mal wiederholen Sie diesen Schritt. Entsorgen Sie die Pellets.
- Transfer-Überstände in Ultrazentrifugenröhrchen und Unterstände mit 5 ml 30% Saccharose in NTE-Puffer (10 mM Tris [pH 7,4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) verdünnt. Balancieren Rohre vor Ultrazentrifugation und füllen sich mit PBS, um ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen. Spin supernanern bei 112.398 xg (entsprechend 25.000 rpm für einen SW28 Rotor) für 90 min in einer Ultrazentrifuge.
- Überstand vorsichtig abnehmen durch Pipettieren und genießen Viruspellet über Nacht bei 4 ° C in 250 ul PBS. Pellet durch Auf- und Abpipettieren. Messen Proteingehalt des gereinigten Virus durch Bradford-Assay 15.
- Verwenden Sie einen Biotinylierungskit an biotinylierte A / WSN / 33 zu erzeugen. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
- Kurz gesagt, fügen Sie die entsprechende Menge an Biotin zu dem gereinigten Virus und Inkubation für 2 Stunden auf Eis. Übertragen Virus ein Ultrazentrifugenröhrchen und das Füllrohr mit PBS auf ein Endvolumen von 30 ml zu erreichen. Spin Virus bei 112.389 × g für 90 min in einer Ultrazentrifuge. Überstand entfernen durch Pipettieren und fügen Sie 250 ul PBS. Soak Pellet über Nacht bei 4 ° C. Aliquot und speichert das biotinylierte Virus bei -80 ° C gelagert wird, wo sie für mindestens 24 Monate stabil.
HINWEIS: Es könnte hilfreich sein, um den Titer des biotinylierten p bestimmen,Reparatur von IAV durch Standard-Plaque-Test. Es sollte jedoch beachtet werden, dass die nachfolgenden Protokoll nur biotinylierte Viruspartikeln zu messen. Restlichen biotinylierten Partikel aufgrund unvollständiger Biotinylierung wird dem Infektionstiter mittels Plaque-Assay, aber nicht zu dem Signal in dem Befestigungs- / Internalisierung Assay gemessen bei.
2. Bestimmen Sie die erforderliche Menge an biotinyliertem Virus
Hinweis: Vor dem Anschließen / Internalisierung Assay durchgeführt wird, ist es wichtig, die Menge an biotinyliertem Virus benötigt, um alle Zellen einer Probe zu infizieren bestimmen.
- Kultur und trypsinize A549 Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers. Zählen Sie die Zellen unter Verwendung eines Zellenkammer. Pipette 200.000 A549-Zellen in FACS Deepwell Rohre. Spin 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet mit 200 ul PBS. Coole Zellen nach unten auf Eis für 10 min.
- Bereiten Sie das 5-fache serielle Verdünnungen der biotinylated Virusstamm in infektions PBS.
- Spin Röhrchen mit den Zellen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet mit 100 ul virushaltigen Infektion-PBS. Wie Mock Steuer Verwendung infektions PBS ohne biotinyliertes Virus. Röhrchen auf Eis für 1 Stunde inkubiert.
- Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 200 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal.
- Zur Fixierung, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 100 ul 3,7% Paraformaldehyd (PFA). Inkubation für 10 min bei RT. Wiederholen Sie dann in 2.4 beschriebenen Waschschritt).
- Zur Permeabilisierung, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 100 ul PBS, das 0,5% Triton X-100. Inkubation für 6 min bei RT. Wiederholen Sie dann in 2.4 beschriebenen Waschschritt).
- Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und resuspendieren pellet in 50 & mgr; l 2% BSA in PBS, das STV-Cy3 verdünnt. (Bitte beachten Sie, sollte die entsprechende Konzentration des STV-Cy3 vor dem Start des Experiments bestimmt werden Beginnen Sie mit einer Konzentration von 1:. 200 und Test 2-fache Verdünnungen bis zu 1:. 2400 In unseren Händen, eine Verdünnung von 1: 1000 bewiesen optimal zu sein.)
- Inkubieren 1 Stunde im Dunkeln bei RT. Dann wiederholen Sie die Waschschritt in 2.4 beschrieben, aber das Pellet in 200 ul 2% BSA in PBS verdünnt.
- Analyse Proben mittels Durchflusszytometrie 16. Tor auf der Cy3-positiven Population. Wählen, die niedrigste Konzentration an biotinyliertem Virus was zu der maximalen Anzahl von Cy3-positiven Zellen in der A549 Bevölkerung.
3. Bestimmen Sie die erforderliche Menge an Streptavidin
HINWEIS: Die Effizienz der Blockierung der von extrazellulärem Virus abgeleitete Signal bestimmt den Erfassungsbereich des Assays. Daher ist es wichtig, den STV-Cy3-Signal so weit wie möglich aufheben. The erforderliche Menge an STV benötigt wird, hängt von der Menge an biotinyliertem Virusstamm verwendet (in Abschnitt 2 bestimmt).
- Führen Sie die Schritte 2,1 bis 2,4, aber verwenden Sie in Abschnitt 2 festVirusKonzentration.
- Vorbereitung Fünffache Serienverdünnungen STV in PBS, enthaltend 2% BSA und 0,1% Natriumazid verdünnt.
- Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 50 & mgr; STV Verdünnung. Wie Mock Steuer Verwendung PBS mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid ohne STV. Röhrchen für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Dann wiederholen Sie die Waschschritt in 2.4 beschrieben.
- Führen Sie die Schritte 2,5-2,9. Für die Internalisierung Assay, wählen Sie die niedrigste Konzentration des STV, was zu einem starken Block der Cy3-Signals (im Vergleich zu der Probe, in der kein STV war vorhanden). Hierzu kann der Prozentsatz von Cy3-positiven Zellen oder der mittleren Fluoreszenzintensität des Cy3-Signal verwendet werden. Idealerweise sollte das Cy3 Signal STV-behandelten Proben so nahe an dem Signal von mock-infiziertZellen wie möglich.
4. Befestigung / Internalisierung Assay
HINWEIS: Sicherstellen, dass alle Reagenzien vor Testbeginn vorzubereiten. Für die drei Kontrollgruppen im Ergebnisteil (mock-infizierten Zellen, Neuraminidase vorbehandelt Zellen und Natriumazid Zellen) präsentiert kleine Änderungen an dem Protokoll erforderlich.
- Bereiten Sie 16 Deepwell Rohre jeweils 200.000 A549-Zellen enthält. Neben der experimentellen Set bestehend aus 4 Röhren gibt es 3 Kontrollbedingungen, die jeweils benötigt 4 Röhren: mock-infizierten Zellen, Neuraminidase (NA) -pretreated Zellen und Natriumazid behandelten Zellen. Jede Gruppe besteht aus 4 Röhren als "0 min", "0 min + STV ', '30 Minuten', '30 min + STV 'beschriftet.
- Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 200 ul PBS.
- Spin-Röhrchen bei 4 ° C bei 450 x g. Überstand entfernen und resuspendieren pellet in 200 ul DMEM, enthaltend 0,3% BSA, 20 mM HEPES und 1% Penicillin-Streptomycin (Inkubationsmedium). Inkubation für 30 min bei 37 ° C.
HINWEIS: Für die Neuraminidase Steuerung: Verwenden Sie bakterielle Neuraminidase (zB Sialidase aus Vibrio cholera) in einer Konzentration von 200 mU / ml in Inkubationsmedium verdünnt, um die Zellen zu resuspendieren. - Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 200 ul PBS. Wiederholen Sie diesen Schritt noch einmal, dann kühlen Rohre nach unten auf Eis für 10 min.
- Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand und Pellet in 100 ul biotinyliertes Virus zu entfernen (verwenden Sie die Viruskonzentration in Abschnitt 2 in infektions PBS bestimmt). Inkubieren Sie 1 Stunde auf Eis. Dann wiederholen Sie die Waschschritt in 2.4 beschrieben.
HINWEIS: Für den Mock-infizierten Kontroll: Verwendung Infektion-PBS ohne Virus. Für Natriumazids Control: Nutzung Virus in Infektions-PBS verdünnt, ergänzt mit 0,1% Natriumazid. - ProfiBearbeitung der Proben nach der Infektion auf Eis:
- Für die "0 min" Proben, folgen Sie Schritt 2,5 und Lagerung von Proben bei 4 ° C, bis die anderen Proben werden fixiert.
- Für die "0 min + STV" Proben, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 50 & mgr; STV (verwenden Sie die in Abschnitt 3 fest Konzentration) in PBS mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid verdünnt (zur Internalisierung zu verhindern, während der Handhabung der Probe). Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Folgen Sie Schritt 2,4 bis 2,5 und die Proben bei 4 ° C.
- Für die '30 min "Proben, Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 200 ul PBS, das 2% BSA. Inkubieren 30 min bei 37 ° C. Folgen Sie Schritt 2,4 bis 2,5 und die Proben bei 4 ° C.
ANMERKUNG: Die Natriumazid Kontrolle: Mit PBS, ergänzt mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid für 30 min Inkubation bei 37 ° C. - Für die "30 min + STV Proben der Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand abnehmen und das Pellet erneut in 200 ul PBS, das 2% BSA. Inkubieren 30 min bei 37 ° C. Dann Spin-Röhrchen bei 4 ° C für 3 min bei 450 x g. Überstand entfernen und Pellet in 50 & mgr; STV (verwenden Sie die in Abschnitt 3 fest Konzentration) in PBS mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid verdünnt (zur Internalisierung zu verhindern, während der Handhabung der Probe). Inkubieren Sie 30 Minuten auf Eis. Folgen Sie Schritt 2,4 bis 2,5 und die Proben bei 4 ° C.
ANMERKUNG: Die Natriumazid Kontrolle: Mit PBS, ergänzt mit 2% BSA und 0,1% Natriumazid für 30 min Inkubation bei 37 ° C.
- Führen Sie die Schritte 2,6-2,8 und Proben zu analysieren mittels Durchflusszytometrie. Bestimmen Sie den Prozentsatz der Cy3-positiven Zellen in jeder Probe.
- Der prozentuale Anteil befestigt Virus und die relative Menge der internalisierten Virus.
- Um die Menge der beigefügten Virus zu berechnen verwenden Sie den Prozentsatz der Cy3-positive geschlossene Zellen oder die mittlere Fluoreszenzintensität der Cy3-Signal. Zum Vergleich gesetzt unbehandelten Zellen auf 100% (4B).
HINWEIS: Der Prozentsatz der beigefügten Virus wird durch die "0 min" Probe beschrieben. - Um die Menge der internalisierten Virus zu berechnen, nehmen Sie das Verhältnis der "30 min + STV" Probe auf die "30 Minuten" Probe (5B).
HINWEIS: Wie oben erwähnt, kann der Prozentsatz von Cy3 positive gated Zellen oder der mittleren Fluoreszenzintensität des Cy3-Signal verwendet werden.
- Um die Menge der beigefügten Virus zu berechnen verwenden Sie den Prozentsatz der Cy3-positive geschlossene Zellen oder die mittlere Fluoreszenzintensität der Cy3-Signal. Zum Vergleich gesetzt unbehandelten Zellen auf 100% (4B).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ein Cartoon beschreiben die vier verschiedenen experimentellen Bedingungen ist in Figur 1 gezeigten Ergebnissen eines repräsentativen Experiments sind in den 2 vorgelegt. - 5. In der "0 min" Probe ist biotinyliertes Virus Kalt verpflichtet, Zellen, die durch STV-Cy3-Färbung sichtbar gemacht werden können, zielen (Abbildungen 1 und 2). Wenn ein Blockierungsschritt (in der "0 min + STV" Probe) angewendet wird, kann Virus an der Zelloberfläche nicht mehr von STV-Cy3-Färbung nachgewiesen werden. Als Ergebnis wird die Signalintensität in der "0 min + STV" Probe stark gegenüber dem "0 min" Probe (Abbildungen 1 und 2) reduziert. Nach Erhöhung der Temperatur auf 37 ° C, liegt bei Virus in die Zellen ("30 min" Probe) entnommen. Internalisiert Virus ist nicht empfindlich gegenüber dem Blockieren mit unmarkiertem STV, die in einer weniger dramatischen Abfall der Signalintensität in der & # Ergebnisse8220; 30 min + STV "Proben in Bezug auf die" 30 Minuten "Probe, bei der keine STV Blockierung angewendet wurde (Abbildungen 1 und 2).
Als Kontrolle verwendeten wir Scheininfektion, NA Behandlung und SA-Behandlung. Abbildung 3 zeigt den prozentualen Anteil der Cy3-positiven Zellen für alle in Abschnitt 4. Mock-infizierten Zellen geben, die Hintergrundsignalintensität für das Experiment und als negative Kontrolle für die experimentellen Bedingungen Virus Befestigung (Abbildung 4). Eine zusätzliche Kontrolle für die Virus-Befestigung ist die Behandlung mit bakteriell exprimierten NA. NA entfernt Sialinsäure, den Rezeptor für IAV Befestigung von Glykoproteine auf der Zelloberfläche und verringert dadurch die Bindung des Virus an Zellen 17 zu zielen. Wie in 4 gezeigt ist, die Behandlung mit NA hebt stark IAV Befestigungs um etwa 90% im Vergleich zu unbehandelten Zellen. In Bezug auf die Internalisierung verwendeten wir SA als Kontrolle. SA tr eatment umgehend verbraucht zellulären ATP-Spiegel, wodurch die Hemmung energieverbrauchende Prozesse wie Endozytose 13. Inkubation von Zellen mit SA während und nach der Infektion inhibiert Internalisierung von Viruspartikeln. Die relative Menge internalisiert Virus (in 5 gezeigt) wurde von etwa 10% bis 45% durch Inkubation bei 37 ° C für 30 min in unbehandelten Zellen erhöht. Folgende SA Behandlung jedoch der Prozentsatz der relativen internalisiert Virus etwa 15% sowohl für Zellen, die für 0 inkubiert und 30 min bei 37 ° C. Dies zeigt an, dass in der Tat, SA verringert die effektive Aufnahme von Viruspartikeln in Zellen.
Abbildung 1. Prinzip des Assays. Karikatur, die das Prinzip der Befestigung / Internalisierung Assay.= "_ blank"> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Repräsentative Ergebnis für IAV Befestigung und Internalisierung. (A) Histogramm, das die Signalintensität des Cy3-Signal für den unbehandelten Zellen. Dargestellt sind die "0 min", "0 min + STV", "30 Minuten" und "30 min + STV" Probe. (B) Prozentsatz der Cy3-positiven Zellen von A. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Repräsentative Ergebnisse für die Befestigung und die Internalisierung einschließlich Kontrollen. rong> Prozentsatz der Cy3-positiven A549 Zellen nach indizierte Behandlung. Dargestellt sind scheininfizierten, unbehandelt, NA-behandelt und SA-behandelten Zellen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4. Die Hemmung der Virus-Befestigung durch Neuraminidase. (A) Histogramm, das die Cy3 Signalintensität "0 min" Proben. Angezeigt werden, sind unbehandelten Zellen (in blau) und zwei Kontrollproben: Mock-infizierten und NA-behandelten Zellen (in rot und orange, respectively). (B) Prozentsatz der Cy3-positiven Zellen von A. Dargestellt sind mock, unbehandelt und NA behandelten Zellen von der "0 min" Probe. Der Wert für die unbehandelten Zellen wurde auf 100% gesetzt.com / files / ftp_upload / 53.372 / 53372fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Hemmung der Virus Internalisierung durch Natriumazid (SA). (A) Histogramm, das die Cy3 Signalintensität des "30 Min" und "30 Minuten + STV" Proben von unbehandelten (in rot und orange, respectively) und SA- behandelt (in blau und grün, respectively) Zellen. (B) Prozentsatz der relativen verinnerlicht Virus aus unbehandelten und SA-behandelten Zellen nach 0 und 30 Min. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Unser Protokoll beschreibt eine einfache Möglichkeit zur Messung der Virus-Bindung und Internalisierung durch Durchflusszytometrie. Es erlaubt die Verwendung von markierten Wildtyp-Virus, das imitiert enger Virus-Infektionen im Vergleich zur Verwendung von virusähnlichen Partikeln (VLP). Während unsere Protokoll wurde optimiert, um Bindung und Internalisierung von IAV messen, kann es leicht für andere Viren angepasst werden. Darüber hinaus, wie Durchflusszytometrie ist zum Auslesen verwendet, aufeinander Färbungen können leicht an den Protokoll zB hinzugefügt werden, um die Expressionsniveaus folgenden Zuschlags oder Überexpression eines Proteins von Interesse zu testen. Somit ermöglicht die Modifikationen des Protokolls in Abhängigkeit von den individuellen Bedürfnissen des Assays. Zu beachten ist, kann der Assay auch für eine Reihe von Zeitpunkten, um Virus-Internalisierung über die Zeit zu messen und kinetische Daten durchgeführt werden. Dies kann besonders wichtig sein, wenn der Assay waren für einen anderen Virus mit unbekannten Internalisierung Kinetik angepasst werden.
However sollte angemerkt werden, dass das Fenster der Erkennung ist relativ kleinen Unterschiede in An- bzw. Internalisierung auf einer linearen Skala auftreten wegen der Abwesenheit der viralen Replikation ist. Um das Vertrauen zu erhöhen und die Lärm empfehlen wir einschließlich der Kontrollen zu reduzieren (zB die Kontrollen zu beschreiben oben) und mehrere Wiederholungen. Während die gezeigten Ergebnisse zeigen ein repräsentatives Experiment beobachteten wir gute Konsistenz zwischen verschiedenen Experimenten: Zum Beispiel, für die Befestigung der Prozentsatz der Cy3-positive Zellen, die aus 60-80% lag; zur internalisierten Virus erhielten wir Werte zwischen 40-60%.
Bevor der Test gestartet wird, ist es wichtig, die Arbeitskonzentrationen der verwendeten Reagenzien wie STV, STV-Cy3 und die Menge an biotinyliertem Virus titrieren. Bitte beachten Sie, dass die Menge der Reagentien und Inkubationszeiten können in Abhängigkeit von der Zelllinie und Virusstamm variieren. Um das Fenster zur Erkennung, den Prozentsatz an Zellen positiv für Viren attachmen maximierent sollte so hoch wie möglich in der "0 min und" 30 min "Probe (in Abhängigkeit von der Menge des biotinylierten-Virus), so gering wie möglich in der" 0 min + STV "Probe (in Abhängigkeit von der Menge des STV verwendet ). Darüber hinaus kann das Rauschen, indem die Zellen bei 4 ° C während der Zentrifugation und Waschen mit eiskaltem PBS reduziert werden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss aus dem Schweizerischen Nationalfonds (31003A_135278) SST unterstützt. MOP ist der Begünstigte einer Promotionsstipendium der AXA Forschungsfonds. Wir bedanken uns bei Patricia Nigg für die Hilfe bei der Gestaltung der Figur 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
References
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
