Introduction
A entrada do vírus influenza A (IAV) é um processo multi-etapas que começa com a ligação do vírus a receptores na membrana plasmática das células alvo 1. O receptor para IAV é ácido siálico que está presente em uma grande variedade de glicoproteínas e glicolípidos. A hemaglutinina (HA) de IAV proteína que está presente no envelope viral se liga ao ácido siálico e assim medeia a ligação das partículas virais na membrana plasmática das células alvo 2. O vírus entra nas células através de endocitose mediada por clatrina, mas também as vias de entrada alternativos, tais como macropinocitose, foram descritos 3-6. A interacção entre o HA e o ácido siálico parece ser suficiente para mediar os dois, a ligação e internalização de disparo de partículas virais 7. No entanto, os receptores de entrada alternativos foram propostos e seus papéis na entrada IAV estão sendo investigados 1,8,9.
Curatualmente, são feitos esforços para identificar os fatores do hospedeiro que estão envolvidos no ciclo de vida viral com o objectivo de desenvolver terapias antivirais novos urgentemente necessários 10-12. A entrada do vírus seria um passo favorável para o direcionamento de crescimento IAV, a fim de bloquear a infecção viral em seu ponto mínimo. Medindo diferentes fases de entrada é um desafio IAV experimentalmente como geralmente grandes quantidades de vírus são necessárias para detectar o vírus de entrada. Além disso, a gama de detecção de mudanças na entrada do vírus é única linear devido à falta de replicação viral. Isso ressalta a necessidade de ensaios com alta sensibilidade.
O ensaio apresentamos aqui permite a detecção de vírus ligados à superfície da célula, bem como a detecção de vírus internalizado em relação à quantidade total de vírus associados a células. A utilização de vírus de tipo selvagem biotinilado permite a medição conveniente através de coloração com a STV-Cy3 e leitura por citometria de fluxo. Vírus Biotinilado é frio-limite para celulars para permitir a ligação, mas impedir a internalização de partículas virais. As células podem ser fixadas, permeabilizadas e coradas com STV-Cy3 para medir vírus anexado. O sinal de viriões extracelulares, podem ser ligados revogada se um passo de bloqueamento é aplicada antes da fixação, em que as células são incubadas com estreptavidina não marcado (STV). Numa etapa seguinte, a seguir à fixação dos IAV biotinilado, a temperatura é deslocada para 37 ° C e internalização de partículas virais é permitido tomar lugar. Partículas internalizadas são protegidos de se ligar de STV permitindo assim a discriminação entre os vírus extra e intracelulares.
Por condição experimental, são necessários quatro amostras: '0 min': A primeira amostra, denominada "0 min ', é medir vírus do resfriado-bound na superfície da célula. '+ 0 min STV': A segunda amostra, rotulado '0 min + STV', dá a intensidade do sinal da linha de base do experimento. Vírus anexado é bloqueado sagacidadeh STV e o sinal após coloração com STV-Cy3 deve ser muito menor em comparação com a amostra "0 minutos". Min '30 ': A terceira amostra, '30 min' contém em anexo e internalizado do vírus devido à mudança de temperatura para 37 ° C durante 30 min. '30 Min + STV ': A quarta amostra, '30 min + STV' medidas a fração intracelular do vírus. O passo de bloqueamento STV é aplicado após o período de incubação de 30 min. Como resultado, as partículas virais na superfície celular estão ligados por STV deixando somente vírus internalizados disponível para coloração com STV-Cy3. A quantidade relativa de vírus internalizado pode ser calculado como a razão entre vírus internalizado (medido na '30 min + STV 'amostra) dividida pela quantidade total de vírus (descrito pela min '30' amostra).
Como controlos sugerimos que incluem células não infectadas. O sinal seguinte STV-Cy3 coloração de células falsamente infectadas dá ao fundoresultante do protocolo de coloração. Um controlo para IAV fixação é o pré-tratamento das células com neuraminidase bacteriana (NA). NA cliva off ácido siálico de glicoproteínas celulares, removendo-se assim os receptores de ligação da superfície da célula. A azida de sódio (SA) é um potente inibidor metabólico e, desse modo bloqueia a endocitose 13. As células tratadas com azida de sódio deve ser positiva para a ligação do vírus, mas negativo para a internalização.
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Protocol
Nota antes do início: Capa de Uso de fluxo laminar e biocontainment apropriado quando se trabalha com vírus vivo. Aqui, descrevemos as condições de crescimento adequadas para estirpe do vírus influenza cultura A / WSN / 33. Multiplicidade de infecção (MOI) de incubação e tempos podem variar dependendo da estirpe do vírus utilizado.
1. Preparação de biotinilada / WSN / 33
- Semente de células para um balão T175 cm 2 utilizando Meio Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina (Pen / Strep) Madin-Darby kindey canino (MDCK). As células de cultura a 37 ° C até cerca de 70% de confluência é atingido.
- Antes de infecção, remover o meio e lava-se as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH7.0-7.3) pela adição de um grande volume suficiente para cobrir a monocamada de células.
- Remover PBS e infectar as células com A / WSN / 33 com uma MOI de 10 -4. Dilui-se o vírus em PBS suplementado com 0,02 mg de Mg 2+, Ca 2+ de 0,01 mg </ sup>, 0,3% de albumina de soro bovino (BSA), e 1% de Pen / Strep (infecção-PBS). Usar um inoculo de 4 ml para um balão T175 cm 2.
- Incubar as células 1 h a 37 ° C. Remover por aspiração e inoculo de pipeta 10 ml de DMEM suplementado com 0,3% de BSA, 20 mM de HEPES, e 1% de Pen / Strep para o balão.
- Incubar as células a 37 ° C durante cerca de 3 dias até o efeito citopático (ECP) é visível, e depois da colheita sobrenadante. CPE pode ser reconhecido como arredondamento das células, seguido por descolamento e morte das células 14.
- Rotação sobrenadante a 450 xg durante 5 min para remover os detritos celulares. Transfira o sobrenadante para um novo tubo falcon e repita este passo mais uma vez. Descartar as pelotas.
- Sobrenadantes de transferência para tubos de ultracentrífuga e sobrenadantes underlay com 5 ml de sacarose a 30% diluído em tampão NTE (Tris 10 mM [pH 7,4], NaCl 100 mM, EDTA 1 mM). Equilibrar os tubos antes de ultracentrifugação e encher-se com PBS para atingir um volume final de 30 ml. Spin supernates em 112.398 xg (correspondente a 25.000 rpm durante um rotor SW28) durante 90 minutos em uma ultracentrífuga.
- Remova cuidadosamente o sobrenadante por pipetagem e mergulhar pellet vírus durante a noite a 4 ° C em 250 mL PBS. Ressuspender pellet pipetando cima e para baixo. Medir o teor de proteína do vírus purificado pelo ensaio de Bradford 15.
- Usar um kit de biotinilação para gerar biotinilado A / WSN / 33. Siga as instruções do fabricante.
- Em breve, adicionar a quantidade apropriada de biotina para o vírus purificado e incubar durante 2 horas em gelo. Transferir vírus para um tubo de ultracentrífuga e o tubo de enchimento se com PBS para atingir um volume final de 30 ml. Gire vírus a 112.389 xg durante 90 min em uma ultracentrífuga. Remover o sobrenadante por pipetagem e adicionar 250 ul de PBS. Soak pelete durante a noite a 4 ° C. Alíquotas e armazenar o vírus biotinilado armazenado a -80 ° C altura em que será estável durante pelo menos 24 meses.
NOTA: Pode ser útil para determinar o título do biotinilado preparação de IAV por ensaio de placa padrão. No entanto, deve notar-se que o protocolo subsequente só irá medir partículas de vírus biotinilados. Restante partículas não biotiniladas devido à biotinilação incompleta irá contribuir para o título infeccioso por ensaio de placas, mas não para o sinal medido no ensaio de fixação / internalização.
2. Determinar a quantidade necessária de Biotinilado Virus
NOTA: Antes do ensaio de fixação / internalização é realizada, é importante para determinar a quantidade de vírus necessária para infectar biotinilado todas as células de uma amostra.
- Cultura e células A549 Trypsinize de acordo com as instruções do fabricante. Contar as células utilizando uma câmara de células. Pipeta células 200.000 A549 em FACS Deepwell tubos. Spin 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 200 ul de PBS. Células arrefecer em gelo durante 10 min.
- Prepare a 5 diluições em série do biotiestoque de vírus nylated em PBS-infecção.
- Rotação tubos contendo as células a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet com 100 ul contendo vírus infecção-PBS. Como o uso de controle de infecção simulada-PBS sem vírus biotinilado. Incubar os tubos em gelo durante 1 hr.
- Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS. Repita este passo mais uma vez.
- Para a fixação, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de 3,7% de paraformaldeído (PFA). Incubar durante 10 min à TA. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4).
- Para permeabilização, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 100 ul de PBS contendo 0,5% de Triton X-100. Incubar durante 6 min à temperatura ambiente. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4).
- Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 50 ul 2% BSA diluído em PBS contendo STV-Cy3. (Por favor, note que a concentração adequada de STV-Cy3 deve ser determinado antes do início do experimento Comece com uma concentração de 1:. 200 e teste de diluições de 2 vezes até 1:. 2400 Em nossas mãos, uma diluição de 1: 1000 provou para ser óptima.)
- Incubar 1 hora no escuro à temperatura ambiente. Então, passo de lavagem de repetição descrito em 2.4, mas ressuspender o sedimento em 200 ul de BSA a 2% diluído em PBS.
- Analisar amostras por citometria de fluxo 16. Porta na população Cy3 positivo. Escolha a concentração mais baixa de vírus biotinilado resultante do número máximo de células positivas Cy3 na população A549.
3. Determinar a quantidade necessária de Streptavidin
NOTA: A eficiência de bloqueio o sinal obtido a partir do vírus extracelular determina o alcance de detecção do ensaio. Portanto, é importante para revogar o sinal STV-Cy3, tanto quanto possível. ºe quantidade necessária de STV necessário depende da quantidade de estoque de vírus biotinilado utilizado (determinado no ponto 2).
- Siga os passos 2,1-2,4, mas usar concentração de vírus determinado no ponto 2.
- Preparar diluições em série de cinco vezes de STV diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1%.
- Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender sedimento em 50 ul de diluição STV. Como o uso de controle simulado PBS contendo 2% de BSA e azida de sódio a 0,1%, sem STV. Incubar os tubos durante 30 min em gelo. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4.
- Siga os passos 2,5-2,9. Para o ensaio de internalização, escolher a concentração mais baixa de STV resultando numa forte bloco do sinal de Cy3 (em comparação com a amostra na qual não estava presente STV). Para isso, a percentagem de células positivas com Cy3 ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3 pode ser usado. Idealmente, o sinal de Cy3 de amostras tratadas-STV deve ser o mais próximo do sinal de falsamente infectadascélulas possível.
4. Fixação / Interiorização Assay
NOTA: Certifique-se de preparar todos os reagentes antes de iniciar o ensaio. Para os três grupos de controlo apresentados na seção de resultados (células infectadas simulados, células pré-tratadas neuraminidase e células azida de sódio tratados) pequenas alterações ao protocolo são obrigatórios.
- Preparar tubos de 16 poços profundos, cada um contendo 200.000 células A549. Ao lado do conjunto experimental que consiste em 4 tubos, há 3 condições de controle, cada um exigindo 4 tubos: células falsamente infectadas, neuraminidase (NA) -pretreated células e células tratadas com azida de sódio. Cada grupo é composto por 4 tubos rotulados como '0 min', '0 min + STV', '30 minutos ', '30 min + STV'.
- Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS.
- Tubos de centrifugação a 4 ° C a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 200 ul de DMEM contendo 0,3% de BSA, HEPES 20 mM e 1% de penicilina-estreptomicina (meio de incubação). Incubar durante 30 min a 37 ° C.
NOTA: Para o controlo de neuraminidase: Utilização neuraminidase bacteriana (por exemplo sialidase a partir de Vibrio cholera) a uma concentração de 200 mU / ml diluído em meio de incubação para ressuspender as células. - Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS. Repetir este passo mais uma vez, em seguida, os tubos frescos para baixo sobre o gelo durante 10 min.
- Tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender pellet em 100 ul biotinilados vírus (use a concentração de vírus determinado no ponto 2 diluída em infecção-PBS). Incubar 1 hora em gelo. Em seguida, repita o passo de lavagem descrito em 2.4.
NOTA: Para o mock-infectados controle: Use infecção-PBS sem vírus. Para o controlo de azida de sódio: A utilização de vírus diluída em PBS-infecção suplementado com azida de sódio a 0,1%. - Prócessamento das amostras após a infecção em gelo:
- Para as amostras '0' mínimo, siga o passo 2.5 e armazenar amostras a 4 ° C até que as outras amostras são fixos.
- Para a '0 min + STV »amostras, tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ul STV (utilizar a concentração determinada no ponto 3) diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% (para evitar a internalização durante o manuseamento da amostra). Incubar 30 minutos em gelo. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C.
- Para as amostras '30 min ', tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS contendo BSA a 2%. Incubar 30 min a 37 ° C. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C.
NOTA: Para o controle de azida de sódio: Utilização PBS suplementado com BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% para os 30 min de incubação a 37 ° C. - Para o '30 min + amostras STV 'girar tubos a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 200 ul de PBS contendo BSA a 2%. Incubar 30 min a 37 ° C. Em seguida, os tubos de centrifugação a 4 ° C durante 3 min a 450 x g. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet em 50 ul STV (utilizar a concentração determinada no ponto 3) diluídos em PBS contendo BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% (para evitar a internalização durante o manuseamento da amostra). Incubar 30 minutos em gelo. Siga o passo 2,4-2,5 e armazenar amostras a 4 ° C.
NOTA: Para o controle de azida de sódio: Utilização PBS suplementado com BSA a 2% e azida de sódio a 0,1% para os 30 min de incubação a 37 ° C.
- Siga os passos 2,6-2,8 e analisar amostras por citometria de fluxo. Determinar a percentagem de células positivas Cy3 em cada amostra.
- Calcula-se a percentagem em anexo vírus e a quantidade relativa de vírus internalizado.
- Para calcular a quantidade de vírus anexado, use a percentagem de Cy3-positive células fechadas ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3. Para efeitos de comparação, não tratadas para definir células de 100% (Figura 4B).
NOTA: O percentual do vírus ligado é descrita pela amostra "0 minutos". - Para calcular a quantidade de vírus internalizado, levar a razão entre a "30 min + STV" amostra ao "30 minutos" de amostra (Figura 5B).
NOTA: Como mencionado acima, a percentagem de células positivas fechado Cy3 ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3 pode ser usado.
- Para calcular a quantidade de vírus anexado, use a percentagem de Cy3-positive células fechadas ou a intensidade de fluorescência média do sinal de Cy3. Para efeitos de comparação, não tratadas para definir células de 100% (Figura 4B).
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Representative Results
Um desenho que descreve as quatro condições experimentais diferentes é mostrada na Figura 1 Os resultados de uma experiência representativa são apresentados nas Figuras 2 -. 5. Na amostra "0 minutos", vírus biotinilado é ligado a frio para células alvo que podem ser visualizadas através de coloração STV-Cy3 (Figuras 1 e 2). Quando um passo de bloqueio (no "0 min + STV" amostra) é aplicada, de vírus na superfície da célula já não pode ser detectado por coloração STV-Cy3. Como resultado, a intensidade do sinal no "0 min + STV" amostra é fortemente reduzida em comparação com a amostra "0 min" (Figuras 1 e 2). Após a elevação da temperatura até 37 ° C, vírus ligado é levada para a as células ("30 minutos" de amostra). Vírus internalizado não é sensível ao bloqueio com STV não marcado, que resulta numa queda menos dramática na intensidade do sinal no & #8220; 30 min + STV "amostras em relação ao" "amostra de 30 min em que não foi aplicada a STV bloqueio (Figuras 1 e 2).
Como controles foram empregados infecção simulada, tratamento e tratamento NA SA. A Figura 3 mostra as percentagens de células Cy3-positivos para todas as condições experimentais descritos na seção 4. células falsamente infectadas dar a intensidade do sinal de fundo para o experimento e agir como controle negativo para acessório do vírus (Figura 4). Um controle adicional para a fixação do vírus é o tratamento com bactérias expressa NA. NA remove o ácido siálico, o receptor para IAV anexo, a partir de glicoproteínas na superfície das células e, assim, reduz a ligação do vírus às células alvo 17. Como mostrado na Figura 4, o tratamento com NA anula fortemente fixação IAV por aproximadamente 90% em comparação com células não tratadas. Em relação à interiorização, usamos SA como controle. SA tr ratamento imediatamente diminui os níveis de ATP celular inibindo assim processos consumidores de energia, tais como a endocitose 13. A incubação de células com SA durante e após a infecção inibida internalização de partículas de vírus. A quantidade relativa de vírus internalizado (representado na Figura 5) foi elevada de cerca de 10% a 45%, por incubação a 37 ° C durante 30 min em células não tratadas. A seguir ao tratamento SA no entanto, a percentagem de vírus em relação internalizada foi de cerca de 15% para ambos, as células foram incubadas durante 0 e 30 min a 37 ° C. Isto indica que, de facto, SA reduz a absorção eficaz de partículas virais nas células.
Figura 1. Princípio do ensaio. Dos desenhos explicar o princípio do ensaio de fixação / internalização.= "_ blank"> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. resultado representativo para IAV fixação e internalização. (A) Histograma mostrando a intensidade de sinal do sinal de Cy3 para as células não tratadas. São mostrados o "0 min", "0 min + STV", "30 min" e "30 min + STV" amostra. (B) Percentagem de células Cy3-positivas a partir de A. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Resultado Representante para a fixação e interiorização incluindo controles. rong> Percentagem de células A549 Cy3-positivos após o tratamento indicado. São mostrados os mock-infectados, não tratados, tratados e NA-SA células-tratada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. A inibição de ligação do vírus por neuraminidase. (A) Histograma mostrando a intensidade de sinal de Cy3 amostras "0" mínimo. Exibida são células não tratadas (em azul) e duas amostras de controlo: células mock-infectados e tratados-NA (em vermelho e laranja, respectivamente). (B) Percentagem de células Cy3-positivos de A. Mostrado são simulada, não tratada e NA-trataram células da amostra "0 min". O valor para as células não tratadas foi definida como 100%.com / arquivos / ftp_upload / 53372 / 53372fig4large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. Inibição da internalização do vírus por azida de sódio (SA). (A) Histograma mostrando a intensidade de sinal de Cy3 do "30 minutos" e "30 min + STV" a partir de amostras não tratadas (em vermelho e laranja, respectivamente) e SA- tratada (em azul e verde, respectivamente) células. (B) Percentagem de vírus internalizado relativa de células não tratadas e tratadas-SA após 0 e 30 min. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Nosso protocolo descreve uma maneira fácil de medir fixação e interiorização do vírus por citometria de fluxo. Ele permite a utilização de vírus do tipo selvagem marcado que imita de perto mais infecções por vírus em comparação com a utilização de partículas do tipo vírus (VLP). Enquanto nosso protocolo foi optimizado para medir a fixação e internalização de IAV que pode ser facilmente adaptada para outros vírus. Além disso, como a citometria de fluxo é utilizada para leitura, co-colorações pode ser facilmente adicionada ao protocolo por exemplo, para testar os níveis de expressão seguinte knockdown ou sobreexpressão de uma proteína de interesse. Assim, o ensaio permite a modificação do protocolo de acordo com as necessidades individuais. Digno de nota, o ensaio também pode ser realizada por uma série de pontos de tempo para medir a internalização do vírus ao longo do tempo e obter informação cinética. Isto pode ser particularmente importante se o ensaio deviam ser adaptado para um vírus diferente, com uma cinética de internalização desconhecidos.
HoweVer, deve notar-se que a janela de detecção é relativamente pequena como diferenças em anexo ou internalização ocorrem numa escala linear devido à ausência de replicação virai. Para aumentar a confiança e para reduzir o ruído recomendamos incluindo controles (por exemplo, os controles descritos acima) e várias repetições. Embora os resultados apresentados representam uma experiência representativa, observou-se boa consistência entre diferentes experiências: Por exemplo, para a fixação, a percentagem de células positivas Cy3 variou de 60-80%; para o vírus internalizada obtivemos valores que variam entre 40-60%.
Antes do ensaio é iniciado, é importante para titular as concentrações de trabalho dos reagentes utilizados, tais como STV, STV-Cy3 e a quantidade de vírus biotinilado. Tenha em atenção que a quantidade de reagentes e tempos de incubação podem variar, dependendo da linha celular utilizada e estirpe do vírus. Para maximizar a janela de detecção, a percentagem de células positivas para o vírus attachmenT deve ser tão elevada quanto possível no "0 min e" 30 minutos "de amostra (dependendo da quantidade de vírus biotinilado usado) e o mais baixo possível no" 0 min + STV amostra "(dependendo da quantidade de STV usados ). Além disso, o ruído pode ser reduzido, mantendo as células a 4 ° C durante a centrifugação e por lavagem com PBS arrefecido em gelo.
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Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da Fundação Swiss National Science (31003A_135278) à SST. MOP é o beneficiário de uma subvenção de doutorado do Fundo de Investigação AXA. Agradecemos Patricia Nigg para obter ajuda com o desenho da Figura 1.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Life Technologies | 41966-052 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life Technologies | 15140-163 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-169 | |
| BSA | VWR Calbiochem | 126579 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-100 | |
| D-Sucrose | Fluka | 84100 | |
| TRIS | Biosolve BV | 20092391 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 3680 | |
| EZ-LINK NHS-SS-BIOTIN kit | Fisher Scientific | W9971E | |
| Bio Rad Protein Bio Assay | Bio Rad | 500-0006 | |
| deepwell tubes (1.2 ml microtubes) | Milian | 82 00 001 | |
| PFA | Lucerna chem Electron microscopy sciences | 15710 | |
| ultracentrifuge tubes | Hemotec HmbH | 253070 | |
| Triton X-100 | Fluka | 93420 | |
| STV-Cy3 | Life Technologies | 43-4315 | |
| STV | Life Technologies | 43-4302 | |
| sodium azide | Fluka | 71290 | |
| bacterial neuraminidase/sialidase | Sigma-Aldrich | N6514-1UN |
References
- Edinger, T. O., Pohl, M. O., Stertz, S. Entry of influenza A virus: host factors and antiviral targets. J Gen Virol. 95, 263-277 (2014).
- Palese, P., Shaw, M. L. Fields Virolog. Knipe, D. M., Howley, P. M. 2, Lippincott Williams and Wilkins. (2007).
- Matlin, K. S., Reggio, H., Helenius, A., Simons, K. Infectious entry pathway of influenza virus in a canine kidney cell line. J Cell Biol. 91, 601-613 (1981).
- Sieczkarski, S. B., Whittaker, G. R. Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin-mediated endocytosis. J Virol. 76, 10455-10464 (2002).
- Rust, M. J., Lakadamyali, M., Zhang, F., Zhuang, X. Assembly of endocytic machinery around individual influenza viruses during viral entry. Nat Struct Mol Biol. 11, 567-573 (2004).
- Vries, E., et al. Dissection of the influenza A virus endocytic routes reveals macropinocytosis as an alternative entry pathway. PLoS Pathog. 7, e1001329 (2011).
- Vries, E., et al. Influenza A virus entry into cells lacking sialylated N-glycans. Proc Natl Acad Sci USA. 109, 7457-7462 (2012).
- Londrigan, S. L., et al. N-linked glycosylation facilitates sialic acid-independent attachment and entry of influenza A viruses into cells expressing DC-SIGN or L-SIGN. J Virol. 85, 2990-3000 (2011).
- Wang, S. F., et al. DC-SIGN mediates avian H5N1 influenza virus infection in cis and in trans. Biochem Biophys Res Commun. 373, 561-566 (2008).
- Pohl, M. O., Edinger, T. O., Stertz, S. Prolidase is required for early trafficking events during influenza A virus entry. J Virol. 88, 11271-11283 (2014).
- Konig, R., et al. Human host factors required for influenza virus replication. Nature. 463, 813-817 (2010).
- Ludwig, S. Targeting cell signalling pathways to fight the flu: towards a paradigm change in anti-influenza therapy. J Antimicrob Chemothe. 64, 1-4 (2009).
- Simoes, S., Slepushkin, V., Duzgunes, N., Pedroso de Lima, M. C. On the mechanisms of internalization and intracellular delivery mediated by pH-sensitive liposomes. Biochim Biophys Acta. 1515, 23-37 (2001).
- Tran, A. T., et al. Knockdown of specific host factors protects against influenza virus-induced cell death. Cell death, and disease. 4, e769 (2013).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgramm quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Macey, M. G. Flow Cytometry Principles and Applications. Macey, M. G. , Humana Press. (2007).
- Burness, A. T., Pardoe, I. U. Effect of enzymes on the attachment of influenza and encephalomyocarditis viruses to erythrocytes. J Gen Viro. 55, 275-288 (1981).
