Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie

Marie O. Pohl; Silke Stertz

doi:10.3791/53372

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Methodenartikel

Mess Bindung und Internalisierung von Influenza A-Virus in A549-Zellen mittels Durchflusszytometrie

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DOI:

10.3791/53372

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4. November 2015

Marie O. Pohl¹ , Silke Stertz¹

¹Institute of Medical Virology, University of Zurich

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll, das eine semiquantitative Methode zur Messung sowohl der Bindung von Influenza-A-Viren an A549-Zellen als auch der Internalisierung von Viruspartikeln in die Zielzellen durch Durchflusszytometrie beschreibt.

Zusammenfassung

Die Bindung an Zielzellen, gefolgt von der Internalisierung, sind die allerersten Schritte im Lebenszyklus des Influenza-A-Virus (IAV). Wir stellen hier ein detailliertes Protokoll zur Messung relativer Veränderungen in der Menge an Viruspartikeln zur Verfügung, die an A549-Zellen, einer menschlichen Lungenepithelzelllinie, anlagern, sowie in der Menge der Partikel, die in die Zelle internalisiert werden. Wir verwenden biotinylierte Viren, die nach einer Färbung mit Cy3-markiertem Streptavidin (STV-Cy3) leicht nachgewiesen werden können. Wir beschreiben das Wachstum, die Reinigung und die Biotinylierung von A/WSN/33, einem weit verbreiteten IAV-Laborstamm. Kaltgebundene biotinylierte IAV-Partikel auf A549-Zellen werden mit STV-Cy3 gefärbt und mittels Durchflusszytometrie gemessen. Um die Aufnahme von Viruspartikeln zu untersuchen, lässt man kältegebundene Viren bei 37 °C internalisieren. Um zwischen externen und internalisierten Viruspartikeln zu unterscheiden, wird ein Blockierungsschritt angewendet: Freie Bindungsstellen auf dem Biotin des angehefteten Virus auf der Zelloberfläche werden durch unmarkiertes Streptavidin (STV) gebunden. Die anschließende Zellpermeabilisierung und Färbung mit STV-Cy3 ermöglicht dann den Nachweis internalisierter Viruspartikel. Wir stellen eine Berechnung vor, um die relative Menge an internalisierten Viren zu bestimmen. Dieser Assay ist geeignet, um die Auswirkungen von medikamentösen Behandlungen oder anderen Manipulationen auf die Bindung oder Internalisierung von IAV zu messen.

Einleitung

Der Eintrag von Influenza-A-Virus (IAV) ist ein mehrstufiges Verfahren, das mit der Bindung des Virus an Rezeptoren auf der Plasmamembran von Zielzellen ¹ beginnt. Der Rezeptor für die IAV Sialinsäure, die auf einer Vielzahl von Glykoproteinen und Glykolipiden vorliegt. Das Hämagglutinin (HA) Proteins der IAV, die in der Virushülle vorhanden ist bindet an Sialinsäure und vermittelt so die Befestigung der viralen Partikel in der Plasmamembran von Zielzellen ^2. Das Virus tritt in die Zellen über Clathrin-vermittelte Endozytose, sondern auch alternative Eintrittswege wie Makropinozytose, beschrieben worden, ^3-6. Die Wechselwirkung zwisch....