The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.
على عكس الثدييات والحشرات مثل ذبابة الفاكهة لديها عدة أجهزة طعم. الخلايا العصبية حسي كيميائي على الساقين، خرطوم، والأجنحة وحامل البيض من ذبابة الفاكهة تعبر عن مستقبلات الذوقية 1،2، القنوات الأيونية 3-6، ومستقبلات ionotropic 7 التي تشارك في الكشف عن العظة الحسية المتطايرة وغير المتطايرة. هذه الخلايا العصبية الاتصال مباشرة tastants مثل المواد الغذائية والمواد الضارة والفيرومونات، وبالتالي تؤثر على العديد من السلوكيات المعقدة مثل التغذية، وضع البيض والتزاوج. التسجيلات الكهربائي والتصوير الكالسيوم وقد استخدمت على نطاق واسع في الحشرات لقياس الاستجابات العصبية التي حركها هذه tastants. ومع ذلك، الكهربية يتطلب معدات متخصصة وقياسات الحصول على من sensillum وطعم واحد يمكن أن يكون تحديا تقنيا تبعا لنوع الخلايا، حجم، وموقف. وبالإضافة إلى ذلك، القرار الخلايا العصبية واحد في ذبابة الفاكهة يمكن أن يكون من الصعب تحقيقها منذ هوى طعم الشعيراتحد ذاته أكثر من نوع واحد من الخلايا العصبية حسي كيميائي. طريقة التصوير الكالسيوم الحية وصفها هنا يسمح استجابات الخلايا العصبية الذوقية واحدة في الذباب الحية لقياسها. هذا الأسلوب هو مناسبة خاصة لتصوير الاستجابات العصبية للالفيرومونات الدهون وأنواع يجند الأخرى التي لديها القابلية للذوبان في المذيبات انخفاض المياه القائمة.
الحيوانات تعتمد على المعلومات الشمية والذوقية للتوسط القرارات الضرورية من أجل البقاء والتكاثر. فهم كيفية العظة حسي كيميائي يتم الكشف عنها ومعالجتها من قبل الجهاز العصبي يتطلب تحديد مستقبلات الحسية (ق) وبروابط كيميائية المقابلة. ذبابة الفاكهة كشف مجموعة متنوعة مذهلة من المركبات المتطايرة وغير المتطايرة والتي تشكل نموذجا ممتازا للدراسة الفسيولوجية الآليات الكامنة chemosensation. في حين أن أجهزة الشم تنظر الجزيئات غير المستقرة، وأجهزة الذوقية المتخصصة للكشف عن المركبات تقلبات منخفضة. هنا، فإننا نقدم وسيلة لقياس مباشرة الاستجابات العصبية من أجهزة طعم ذبابة الفاكهة إلى المنخفض التقلب، بروابط محبة للدهون.
وتشمل أجهزة الذوقية من ذبابة اليدين، خرطوم، والأجنحة. وزعت على السطح من أجهزة طعم لا يشبه الهياكل الشعر المعروفة باسم الشعيرات التي تستجيب إلى sugars، والبيرة، والأملاح والماء والفيرومونات 8. تم تصنيف الشعيرات شكليا إلى شعيرات طعم ومذاق أوتاد 9. وهناك حوالي 31 شعيرات الذوق على labellum التي يتم تصنيفها إلى طويلة (ل-نوع)، قصيرة (الصورة من نوع) والمتوسطة (ط من نوع) الأشكال التضاريسية. و'ل' و 'S' الشعيرات منزل 4 الخلايا العصبية الحسية التي تستجيب من الناحية الفسيولوجية للسكر (الخلية S)، قليل الملح (الخلية L1)، الملح العالية والمركبات المريرة (الخلية L2) والمياه (الخلية W) 10 11. و'ط' بيت 2 الخلايا العصبية الشعيرات الحسية، واحدة من الذي يستجيب على حد سواء لانخفاض الملح والسكر، في حين أن يستجيب أخرى إلى الملح ارتفاعه 12. هناك ما يقرب من 41 الشعيرات الذوق في الذكور و 26 من الإناث الشعيرات في توزيعها على كل من اليدين. لكل من الذكور والإناث، وهناك 21 الشعيرات على midleg، وحوالي 22 الشعيرات على hindleg 13. الخلايا العصبية الذوقية المحاطة الشعيرات الذوق على الساقين هي أيضا جlassified إلى أنواع L1، L2، W و S.
واحد طريقة معيارية لقياس النشاط الكهربائي من الخلايا العصبية واحدة يستخدم أقطاب الخلية أو الخلايا لتسجيل تدفق أيون. تسمح قياسات الكهربائي وظيفة الخلايا العصبية التي يتعين دراستها في الكائنات غير النموذجية مثل الأنواع ذبابة الفاكهة، العث، والنحل التي تفتقر إلى أدوات جينية شاملة لوضع العلامات العصبية. ومع ذلك، في حين أن الطرق الكهربية استخدمت بشكل روتيني لقياس النشاط من ذبابة الفاكهة طعم الشعيرات 4،13،14، وتطبيق هذا النهج يقدم العديد من التحديات التقنية. أولا، تذوق الشعر الخشن لا بد من تحديد القائمة على التشكل والموقع المكاني. على تعريف وقياس الكهربية يمكن يعوقه حجم صغير من الشعيرات، وسهولة الوصول محدودة بسبب الموقف، وصعوبة في تطبيق مجلدات تسيطر على التحفيز الكيميائي لتذوق الشعر الخشن. أيضا، وتحفيز الشعيرات قد تولد إشارات من أكثر من واحدنوع الخلايا العصبية 15. الثانية، والكشف عن إشارات كهربائية يمكن أن تتغير نتيجة للضجيج في الخلفية الناتجة عن الاهتزازات الميكانيكية والضوضاء من المعدات الإلكترونية. ثالثا، استخدام القطب شحذ يمكن أن تلحق الضرر إعداد الطاير، إذا ما استخدمت بشكل غير صحيح (14). وأخيرا، وتجميع وتلاعب الكهربية يتطلب المكونات الإلكترونية المتخصصة لتقديم الحوافز، وتسجيل إشارة، وتحليل البيانات ويمكن أن يكون مكلفا.
في د. البطن، وقد سهلت توافر أدوات ترميز وراثيا لتطوير تقنيات التصوير التي تسمح ردود المجموعات الصغيرة من الخلايا العصبية التي يتعين دراستها. أحد هذه التوجهات هو استخدام لمراسل CaLexA 16. في هذه الطريقة، وتنصهر تسلسل الجينات التي تشفر عامل النسخ LexA-VP16 والكالسيوم حساسة NFAT البروتين معا. تفعيل الكالسيوم من الكالسينيورين بروتين الفوسفاتيز يحفز-الفسفرة دي من NFAT، وبدوره، facilitaقسم التدريب والامتحانات وارداتها إلى النواة. داخل النواة، يربط المجال LexA لعزر ملزمة LexAop الحمض النووي التي توجه التعبير مراسل الأخضر بروتين فلوري (GFP)، مما يتيح تحديد المستدام من الخلايا العصبية تنشيط وظيفيا. وقد استخدم النهج بنجاح لقياس استجابة من الكبيبات حاسة الشم محددة في الفص antennal بعد التعرض للذباب حية إلى الرائحة 16. مؤخرا، تم قياس الاستجابات الفسيولوجية للIR52c الخلايا العصبية المستقبلة الذوقية من الذباب الحية باستخدام CaLexA 7. ومع ذلك، من أجل هذه الدراسة، كان من الضروري أن الذباب العمر لمدة تصل إلى 6 أسابيع لتعزيز GFP النسخ. في حين المناعية مع الأجسام المضادة لمكافحة GFP يمكن استخدامها لتعزيز إشارة CaLexA، فإن هذا الأسلوب يتطلب تثبيت الأنسجة، مما يحول دون إمكانية التصوير الخلية الحية.
كما استخدمت الكالسيوم البروتين مؤشر GCaMP المشفرة وراثيا على نطاق واسع لدراسة استجابات الخلايا العصبية في عدد منالأنواع 17. وGCaMP البروتين تتفلور مع كثافة منخفضة قبل لتحفيز الخلايا العصبية. تطبيق التحفيز يؤدي إمكانات العمل في الخلايا العصبية، مما أدى إلى تدفق الكالسيوم 2+. GCaMP، منضما إلى الكالسيوم 2+، يخضع لتغيير متعلق بتكوين، الامر الذي ادى الى يتألق مع كثافة أكثر إشراقا (الشكل 1). تم استخدام نهج التصوير الكالسيوم الخلايا العصبية واحدة وضعت مؤخرا لتحديد الجلوكوز كما يجند لالرجل الاماميه محددة الخلايا العصبية الذوقية Gr61a 18. في هذه الدراسة، تمت تغطية اليدين تشريح من ذبابة الفاكهة المعدلة وراثيا معربا عن GCaMP في الخلايا العصبية الذوقية Gr61a مع طبقة من الاغاروز قبل التصوير. ومع ذلك، فإن استخدام تشريح الأنسجة يمكن أن يسبب المتهدمة في نهاية المطاف التعبير GCaMP، مما يحد من قياس الوقت وحساسية الكشف. وبالإضافة إلى ذلك، الاغاروز يمكن أن تحد من حساسية بسبب مستويات خلفية عالية من مضان وخصائص تشتت الضوء فيها.
تس معالجة بعض من هذه العيوب، وصفنا استخدام التصوير الكالسيوم بوساطة GCaMP لتسجيل الاستجابات الفسيولوجية من الرجل الاماميه وخرطوم الخلايا العصبية الذوقية للحيوانات سليمة. نقدم لك مجموعة من الاستجابات الفسيولوجية للGr68a والخلايا العصبية ppk23 معربا عن المشفرة وراثيا GCaMP5G 19 إلى الدهن فرمون ذبابة الفاكهة، (3 R، 11 Z 19 Z) -3-acetoxy-11،19-octacosadien-1-را (CH503) 20، 21. يتم قياس الاستجابات العصبية عن طريق قياس الزيادة في مضان من إشارة GCaMP5G خلال التحفيز فرمون. في هذا البروتوكول، ويتم تصوير الخلايا العصبية لمدة إجمالية قدرها 120 ثانية، وهو ما يكفي لتمييز أنماط تفعيل الخلايا العصبية في الخلايا الفردية.
نحن هنا وصف طريقة لأداء التصوير الكالسيوم الحية من الخلايا العصبية الطرفية ذبابة الفاكهة في 2 مختلفة الحواس. كا 2+ -evoked الردود الفلورسنت GCaMP في Gr68a الخلايا العصبية الناجمة عن يجند فرمون كانت CH503 الجرعة التي تعتمد على والكمية. كان من الممكن أيضا أن نتبين مختلف …
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Singapore National Research Foundation (grant NRF-RF2010-06 to J.Y.Y.).
Gr68a-Gal4 | Gift from H. Amrein (Texas A&M Health Science Center, TX, USA) and J. Carlson (Yale University, CT, USA) | ||
ppk23-Gal4 | Gift from K. Scott (Univ. of California, Berkeley, CA, USA) | ||
UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Stock Center | |
0.17 mm coverslip (Gold-Seal coverslip) | Electron Microscopy Services | 63790-10 | |
Nail polish, "Hard as Nails Clear" | Sally Hansen | ||
PAP pen | Sigma-Aldrich | Z377821 | |
Paint brush | fine-tipped brush | ||
Tape | Scotch brand | ||
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
Ethanol, lab grade | Merck | 10094 | |
Hexane, HPLC grade | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 472301 | |
PBST | Recipe described in the protocol section | ||
CH503 | Synthesis described in Mori et al., 2010 | ||
sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | C11578-22U | |
Microscope (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
Spinning Disk Scan head | Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
Aquistion Software (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
Fiji software | open source | http://fiji.sc/Fiji |