As patas dianteiras e a tromba de Drosophila contêm um rico repertório de neurônios sensoriais gustativos. Aqui, apresentamos um método usando imagens de cálcio para medir as respostas fisiológicas de neurônios sensoriais na perna dianteira e na tromba de moscas vivas após a aplicação exógena de um feromônio gustativo.
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Artigo de método
Medindo respostas fisiológicas de
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Resumo
Resumo
Ao contrário dos mamíferos, insetos, como Drosophila têm múltiplos órgãos gustativas. Os neurônios quimio nas pernas, tromba, asas e ovipositor de Drosophila expressam receptores gustativos 1,2, canais iônicos 3-6 e receptores ionotrópicos 7 que estão envolvidos na detecção de sinais sensoriais voláteis e não-voláteis. Esses neurônios contactar directamente tastants, como alimentos, substâncias nocivas e feromonas e, portanto, influenciar muitos comportamentos complexos, tais como alimentação, postura de ovos e acasalamento. gravações dos eléctrodos e imagem de cálcio têm sido largamente utilizados em insectos para quantificar as respostas neuronais evocados por estes saborizantes. No entanto, eletrofisiologia exige equipamento especializado e medições obtenção de um único sensillum gosto pode ser tecnicamente desafiador, dependendo do tipo de célula, tamanho e posição. Além disso, a única resolução neurônio em Drosophila pode ser difícil de alcançar, uma vez hou gosto sensillase mais de um tipo de neurônio quimio. O método de imagem de cálcio ao vivo descrito aqui permite respostas dos neurônios gustativas de solteiro em moscas ao vivo a ser medido. Este método é especialmente adequado para imagiologia de respostas neuronais a feromonas de lípidos e outros tipos de ligandos que têm baixa solubilidade em solventes à base de água.
Introdução
Animais confiar na informação olfativa e gustativa para mediar decisões essenciais para a sobrevivência e reprodução. Entender como pistas quimio são detectados e processados pelo sistema nervoso exige a identificação do receptor sensorial (s) e os ligandos químicos correspondentes. Drosophila detectar uma variedade impressionante de compostos voláteis e não-voláteis e são um excelente modelo para estudar o fisiológica mecanismos subjacentes chemosensation. Enquanto os órgãos olfactivos perceber moléculas voláteis, os órgãos gustativas são especializados para detectar compostos de baixa volatilidade. Aqui, apresentamos um método para medir diretamente as r....
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Protocolo
Preparação 1. Amostra
- Cruzar a linha de Gal4 3,22 motorista para UAS-GCaMP5G 19 moscas (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Permitir que a cruz de crescer a 25 ° C.
Nota: Generating voa com várias cópias dos transgenes Gal4 ou UAS-GCaMP pode ajudar a melhorar a intensidade do sinal fluorescente. Uma versão anterior do transgene UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) mostraram muito fraca intensidade de fluorescência quando expressa sob o controlo do condutor Gr68a-Gal4.- Coletar e separada por sexo recém-eclosed moscas adultas e levantar a 25 ° C.
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Resultados
O indicador de cálcio GCaMP foi geneticamente expressa usando drivers ppk23-Gal4 Gr68a-Gal4 ou. Populações distintas de neurónios e células perna dianteira de suporte não neurais são rotulados por cada controlador (Figura 3A-C). Respostas específicas do ligando ao CH503 feromona lipofílico foram observadas em Gr68a-Gal4 e células expressando Gal4-ppk23 GCaMP (Figura 3D). A mudança relativa na intensidade de fluorescência do sinal GCaMP5G (Af / F)<.......
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Discussão
Descrevemos aqui um método para realizar imagem de cálcio ao vivo de neurônios periféricos Drosophila em 2 órgãos sensoriais diferentes. O Ca 2+ -evoked respostas fluorescentes GCaMP em Gr68a-neurônios induzida pelo ligando feromônio CH503 foram dose-dependentes e quantitativa. Também foi possível discernir diferentes padrões de resposta neural, tais como fásicas e tônicas respostas.
Neurônios que mostram respostas fásicas são acreditados para permitir uma rápida adaptaçã.......
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Divulgações
Os autores declaram que não há interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela Singapore National Research Foundation (concessão NRF-RF2010-06 para J.Y.Y.).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Presente Gr68a-Gal4 | de H. Amrein (Texas A& M Health Science Center, TX, EUA) e J. Carlson (Universidade de Yale, CT, EUA) | ||
| ppk23-Gal4 | Presente de K. Scott (Univ. da Califórnia, Berkeley, CA, EUA) | ||
| UAS-GCaMP5 | 42037 | Bloomington Drosophila Centro de Estoque | |
| de 0,17 mm de lamínula (Selo de Ouro) Serviços de | Microscopia Eletrônica | 63790-10 | |
| Esmalte de unhas, "Hard as Nails Clear" | Caneta PAP Sally Hansen | ||
| Sigma-Aldrich | |||
| Pincel | de ponta fina | ||
| Fita | escocesa | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 13021 | |
| Etanol, grau de laboratório | Merck | 10094 | |
| Hexano, grau HPLC | Sigma-Aldrich | H303SK-4 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | ||
| PBST | descrita na seção do protocolo | ||
| CH503 | Síntese descrita em Mori et al., 2010 | ||
| sCMOS Camera (ORCA Flash4.0) | Hamamatsu | Microscópio C11578-22U | |
| (Ti-Eclipse) | Nikon | Ni-E | |
| Cabeça de varredura de disco giratório | Software de aquisição Yokogawa | CSU-X1-A1 | |
| (MetaMorph Premier) | Molecular Devices | 40002 | |
| Fiji software | de código | http://fiji.sc/Fiji |
Referências
- Clyne, P. J., Warr, C. G., Carlson, J. R. Candidate taste receptors in Drosophila. Science. 287, 1830-1834 (2000).
- Dunipace, L., Meister, S., McNealy, C., Amrein, H. Spatially restricted expression of candidate taste receptors in the Drosophila gustatory system. Curr. Biol.
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Reimpressões e permissões
