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Artigo de método

Medindo respostas fisiológicas de

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DOI:

10.3791/53392

⸱

29 de abril de 2016

 ,  , 
1Temasek Life Sciences Laboratory, 2Department of Biological Science, National University of Singapore, 3Bioimaging and Biocomputing Facility, Temasek Life Sciences Laboratory, 4Histology and Light Microscopy Core, Gladstone Institutes, 5Pacific Biosciences Research Center, University of Hawai'i at Mānoa

Neste artigo

Resumo

As patas dianteiras e a tromba de Drosophila contêm um rico repertório de neurônios sensoriais gustativos. Aqui, apresentamos um método usando imagens de cálcio para medir as respostas fisiológicas de neurônios sensoriais na perna dianteira e na tromba de moscas vivas após a aplicação exógena de um feromônio gustativo.

Resumo

Ao contrário dos mamíferos, insetos, como Drosophila têm múltiplos órgãos gustativas. Os neurônios quimio nas pernas, tromba, asas e ovipositor de Drosophila expressam receptores gustativos 1,2, canais iônicos 3-6 e receptores ionotrópicos 7 que estão envolvidos na detecção de sinais sensoriais voláteis e não-voláteis. Esses neurônios contactar directamente tastants, como alimentos, substâncias nocivas e feromonas e, portanto, influenciar muitos comportamentos complexos, tais como alimentação, postura de ovos e acasalamento. gravações dos eléctrodos e imagem de cálcio têm sido largamente utilizados em insectos para quantificar as respostas neuronais evocados por estes saborizantes. No entanto, eletrofisiologia exige equipamento especializado e medições obtenção de um único sensillum gosto pode ser tecnicamente desafiador, dependendo do tipo de célula, tamanho e posição. Além disso, a única resolução neurônio em Drosophila pode ser difícil de alcançar, uma vez hou gosto sensillase mais de um tipo de neurônio quimio. O método de imagem de cálcio ao vivo descrito aqui permite respostas dos neurônios gustativas de solteiro em moscas ao vivo a ser medido. Este método é especialmente adequado para imagiologia de respostas neuronais a feromonas de lípidos e outros tipos de ligandos que têm baixa solubilidade em solventes à base de água.

Introdução

Animais confiar na informação olfativa e gustativa para mediar decisões essenciais para a sobrevivência e reprodução. Entender como pistas quimio são detectados e processados ​​pelo sistema nervoso exige a identificação do receptor sensorial (s) e os ligandos químicos correspondentes. Drosophila detectar uma variedade impressionante de compostos voláteis e não-voláteis e são um excelente modelo para estudar o fisiológica mecanismos subjacentes chemosensation. Enquanto os órgãos olfactivos perceber moléculas voláteis, os órgãos gustativas são especializados para detectar compostos de baixa volatilidade. Aqui, apresentamos um método para medir diretamente as respostas neuronais dos órgãos gosto de Drosophila melanogaster a baixa volatilidade, ligantes lipofílicos.

órgãos gustativos da mosca incluem os anteriores, tromba, e asas. Distribuído sobre a superfície dos órgãos gustativas são estruturas semelhantes a cabelos conhecidos como sensilas que respondem a sugars, bitters, sais, água e feromônios 8. O sensilla foram classificados morfologicamente em cerdas de gosto e sabor pinos 9. Há cerca de 31 cerdas gosto no labelo que são classificados em A longo (tipo L), curto (s-tipo) e morfologias intermediários (-tipo I). Sensilla casa 4 neurônios sensoriais Os 'L' e 'S' que respondem fisiologicamente ao açúcar (a célula S), baixo teor de sal (a célula L1), alta sal e compostos amargos (a célula L2) e água (a célula W) 10 , 11. O "eu" casa 2 neurônios sensilla sensoriais, uma das quais responde tanto à baixa sal e açúcar, enquanto que outro que responde à elevada de sal 12. Há aproximadamente 41 sensilas sabor em machos e fêmeas em 26 sensilas distribuídos em cada uma das pernas dianteiras. Para ambos os sexos masculino e feminino, há 21 sensilas na midleg, e cerca de 22 sensilas na hindleg 13. Os neurônios gustativos fechados pela sensilla gosto nas pernas também são classified em tipos de L1, L2, W e S.

Um método padrão para medir a atividade elétrica dos neurônios individuais utiliza eletrodos extracelulares ou intracelulares para gravar o fluxo de íons. Medições dos eléctrodos permitem função neuronal a ser estudado em organismos não-modelo como as espécies Drosophila, mariposas, abelhas e que não possuem extensas ferramentas genéticas para a rotulagem neural. No entanto, enquanto os métodos eletrofisiológicos têm sido rotineiramente usado para medir a atividade de Drosophila gosto sensilla 4,13,14, aplicando esta abordagem apresenta vários desafios técnicos. Primeiro, gosto cerdas precisam ser identificados com base na morfologia e localização espacial. Após a identificação, medidas eletrofisiológicas pode ser prejudicado pela pequena dimensão do sensilla, limitando a acessibilidade devido à posição e dificuldade em aplicar volumes controladas de um estímulo químico a um gosto de cerdas. Além disso, a estimulação de sensilas podem gerar sinais a partir de mais do que umneuronal tipo 15. Em segundo lugar, a detecção de sinais elétricos podem ser confundidos com o ruído de fundo resultantes das vibrações mecânicas e ruído de equipamentos eletrônicos. Em terceiro lugar, a utilização de um eléctrodo afiado pode danificar a preparação mosca, se utilizado incorrectamente 14. Finalmente, a montagem de uma plataforma de eletrofisiologia requer componentes eletrônicos especializados para a entrega de estímulo, gravação de sinal e análise de dados e pode ser caro.

Em D. melanogaster, a disponibilidade de ferramentas geneticamente codificados tem facilitado o desenvolvimento de técnicas de imagiologia que permitem que as respostas de pequenas populações de neurónios a ser estudado. Uma tal abordagem é a utilização do repórter CaLexA 16. Neste método, as sequências de gene que codifica o factor de transcrição VP16-LexA e uma proteína NFAT sensível ao cálcio são fundidos em conjunto. activação de cálcio da calcineurina fosfatase proteína catalisa a fosforilação de de-NFAT e, por sua vez, a FacilitaTES sua importação para o núcleo. No interior do núcleo, o domínio de LexA se liga a um motivo de ligação a DNA-LexAop que dirige a expressão de uma proteína fluorescente verde repórter (GFP), permitindo assim a identificação de neurónios sustentada funcionalmente activado. A abordagem tem sido utilizada com sucesso para medir a resposta de glomérulos olfactiva específica no lobo antenal após a exposição das moscas ao vivo a um odorante 16. Recentemente, as respostas fisiológicas de neurônios receptores gustativos IR52c foram medidos a partir moscas ao vivo usando CaLexA 7. No entanto, para este estudo, foi necessário moscas de idade para até 6 semanas para aumentar a transcrição GFP. Enquanto a imunocoloração com um anticorpo anti-GFP podem ser usadas para aumentar o sinal CaLexA, este método exige a fixação do tecido, evitando, assim, possibilidade de processamento de imagem de células vivas.

O cálcio GCaMP proteína indicadora geneticamente codificado também tem sido amplamente utilizado para estudar as respostas neuronais em váriosespécies 17. O GCaMP proteína fluorescente com baixa intensidade antes da estimulação neuronal. Aplicação de um estímulo desencadeia um potencial de acção no neurónio, resultando no influxo de Ca 2+. GCaMP, ligado ao Ca2 +, sofre uma alteração conformacional, fazendo com que a fluorescência com intensidade mais brilhante (Figura 1). Uma abordagem de imagem de cálcio para neurónios único recentemente desenvolvido foi utilizado para identificar a glicose como o ligando para os neurónios pata dianteira gustativos Gr61a específicos 18. Neste estudo, pernas dianteiras dissecados de Drosophila transgênicos expressando GCaMP em neurônios gustativos Gr61a foram cobertos com uma camada de agarose antes da imagem. No entanto, a utilização de tecido dissecado pode causar eventual degradação de expressão GCaMP, limitando, assim, o tempo de medição e detecção de sensibilidade. Além disso, agarose pode limitar a sensibilidade devido aos altos níveis de fundo de fluorescência e suas propriedades de dispersão de luz.

To abordar alguns destes inconvenientes, descrevemos o uso de imagem de cálcio GCaMP mediada para gravar as respostas fisiológicas de pata dianteira e tromba neurônios gustativas de animais intactos. Mostramos as respostas fisiológicas de Gr68a e neurónios que expressam ppk23 geneticamente codificado GCaMP5G 19 a uma feromona de lípidos de Drosophila, (3R, 11 Z, 19, Z) -3-acetoxi-11,19-octacosadien-1-ol (CH503) 20, 21. respostas neuronais são medidos por quantificação do aumento na fluorescência do sinal GCaMP5G durante a estimulação de feromonas. Neste protocolo, os neurônios são gravadas para uma duração total de 120 segundos, o que é suficiente para diferenciar padrões de ativação neuronal em células individuais.

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Protocolo

Preparação 1. Amostra

  1. Cruzar a linha de Gal4 3,22 motorista para UAS-GCaMP5G 19 moscas (w 1118; P {20XUAS-IVS-GCaMP5G} attP40). Permitir que a cruz de crescer a 25 ° C.
    Nota: Generating voa com várias cópias dos transgenes Gal4 ou UAS-GCaMP pode ajudar a melhorar a intensidade do sinal fluorescente. Uma versão anterior do transgene UAS-GCaMP (UAS-GCaMP3) mostraram muito fraca intensidade de fluorescência quando expressa sob o controlo do condutor Gr68a-Gal4.
    1. Coletar e separada por sexo recém-eclosed moscas adultas e levantar a 25 ° C.
      Nota: O nível básico de GCaMP5G florescimento é o ideal em moscas com idade entre 14-28 dias. Isolando moscas por sexo exclui a possibilidade de interações sociais que podem influenciar as respostas neurais.
  2. Anestesiar uma mosca sob uma corrente suave de CO 2.
  3. Fixe a fly a uma lamela de vidro, colocando primeiro uma pequena gota de unha polonês no centro de uma lamela de 0,17 mm. Suavemente colocar uma mosca no seu lado sobre a gota de unhas polonês claro e assegurar que toda a queda é coberto pela mosca.
  4. Execute os passos 1.5 e 1.6 sob um microscópio estereoscópico de dissecação, usado em 8x ampliação.
  5. Use um pincel molhado para estender uma pata dianteira da mosca. Fixar a pata dianteira em posição pela colocação de duas tiras delgadas de fita ao longo dos primeiro e quinto segmentos do tarso (Figura 2A). Isto irá expor segmentos do tarso T2-T4 para imagiologia (Figura 2B).
  6. Para neurônios imagem na tromba, coloque uma fina tira de fita adesiva sobre a tribuna das tromba para expor o labelo (Figura 2C, D).
  7. Desenhar uma barreira hidrofóbica ao redor da mosca com uma caneta PAP para evitar solução de fluir sobre a superfície da lamela. Fazer medições no prazo de 30 min de montagem.

2. Preparação de EstímuloSolução

  1. Diluir ligandos lipofílicos (tais como CH503, utilizada neste estudo) em uma solução de PBST: 137 mM de NaCl, 2,7 mM de KCl, 10 mM de Na 2 HPO 4, 1,8 mM de KH 2 PO 4, 0,1% de Triton X-100 (v / v ); pH 7,4.
    1. Produzir uma solução stock de 1 mg / ml de ligando utilizando PBST. Prepare todas as diluições posteriores da solução utilizando PBST.
      Nota: Dependendo da solubilidade do ligando de interesse, podem ser necessários diferentes solventes para dissolver o ligante. A solubilidade do CH503 em vários solventes é descrita na Tabela 1. Ao contrário de outros solventes, PBST não produzir um aumento na fluorescência.

3. Estimulação da Gustativa Neurônios e Aquisição de Imagem

  1. Utilizando um pipetador de 10 ul, 10 ul de colocar PBST para os segmentos do tarso.
    Nota: Esta etapa umedece a perna e impede que os segmentos do tarso de drifting.
  2. Use um sistema óptico que possui uma câmara de suvelocidade ficiente e sensibilidade para alcançar um bom sinal de fluorescência de resolução temporal alta.
    Nota: Para este estudo foi utilizado um microscópio confocal disco giratório e uma câmera scmos (veja Lista de Materiais).
  3. Escolha do segmento e neurônios tarsal específica a ser trabalhada. Adquirir três pré-estimulação confocal Z-stacks.
    1. Idealmente, as configurações de aquisição de uso que são rápidos o suficiente para permitir a resolução de tempo máximo enquanto ainda captar o volume da célula inteira. Configurações de aquisição de exemplo são: 200 exposição ms, binning 2 x 2 e 6 x 0,5 m 2 secções de óptica, capturados a cada 2 s.
      Nota: as pernas imobilizadas ter sido fotografados com sucesso para até 10 minutos, em intervalos de 30 seg, sem branqueamento discernível do sinal GCaMP. Para maiores tempos de gravação, verifique se as pernas são mantidas firmemente no lugar na lamela.
    2. Optimizar a potência do laser para a mais alta relação sinal-ruído possível com fotodegradação mínima durante toda a imaging regime. Para os experimentos aqui descritos, usar um 491 nm diodo laser (100 mW) a transmissão de 30% para exames ambos os neurônios Gr68a e gustativos ppk23 nas pernas e tromba. Use 2 x 2 binning para permitir tempos de exposição mais curtos enquanto ainda alcançar resolução espacial suficiente.
      Nota: As configurações de energia do laser foram otimizados para permitir a detecção da mudança fluorescente que vão desde um aumento de 1,2 a 4,5 vezes.
  4. Pipetar 10 ml da solução para o estímulo segmentos do tarso. Para experiências de controle, adicionar mais 10 mL de PBST. imediatamente adquirir 117 imagens pós-estimulação.
    Nota: o número de imagens de pós-estimulação é adquiridos com base na quantidade de tempo em que foi alcançado alteração máxima na fluorescência (aproximadamente 2 min).
    1. Passo crítico: Enquanto pipetando solução sobre a preparação, não para tocar a mosca com a ponta da pipeta uma vez que este fará com que a pata dianteira para mover fora de posição.
      Nota: Como alternativa, useum micromanipulador para posicionar com precisão um capilar de vidro contendo estímulo perto do segmento tarsal a ser trabalhada. Fornecer volumes controlados de estímulo, utilizando um dispensador de microinjecção intracelular de acordo com as instruções do fabricante.

4. Processamento de Imagem e Análise: Quantificação da resposta

  1. Abra uma série de Z-pilhas confocal usando Fiji ( http://fiji.sc/Fiji ) 23 ou ImageJ ( http://imagej.nih.gov/ij/ software) análise e processamento de imagem 24.
  2. Adicione uma projecção soma de intensidade de todas as seis fatias Z para cada um dos 120 pontos de tempo.
    1. Selecione a opção "Pilha" em "Imagem". Além disso, selecione a opção "Z projecção" e digite "1" como a fatia de início e "4", como fatia stop. Para o tipo de projeção, selecione R20; fatias sum "no menu suspenso e escolha" Todos os prazos ".
  3. Definir a região de interesse (ROI) usando a ferramenta de seleção à mão livre para desenhar um limite em torno de um corpo celular ou projeção neuronal. Clique na etiqueta "Analisar" e selecione a opção "Gerenciador de ROI" em "Ferramentas".
  4. Quantificar a fluorescência do ROI selecionando a opção "Definir medidas", no menu "Analisar" e marcando as caixas para a densidade integrada, área, valor médio e valor máximo de cinza e etiqueta. Em seguida, selecione a opção "Mais" no menu gerenciador de ROI e selecione ainda a opção "medida Multi".
    Nota: Isto vai gerar uma caixa pop-up com valores para cada um dos parâmetros seleccionados.
  5. Verificar os valores de cinzento máximos para assegurar que nenhum dos pixels ter atingido a saturação (por exemplo, 65535 para uma câmara de 16 bits).
    NOTA: Para as experiências mostradas na tseus papel, as respostas foram medidas quer a partir de corpos celulares ou projecções neuronais, dependendo de onde foi observado o aumento máximo em Af / F.
  6. Calcula-se a alteração máxima na fluorescência relativa (Af / F) no ponto de tempo t é o seguinte:
    figure-protocol-1
    1. Subtrair o fundo de fluorescência a partir de cada valor de F (célula). Para quantificar a fluorescência de fundo, medir a densidade integrada de uma ROI de tamanho e forma equivalente a partir de uma área da pata dianteira (ou tromba) destituída de neurónios detectáveis.
    2. Para quantificar a pós-estimulação de fluorescência, F (célula) t, medir a densidade integrada do ROI do corpo da célula ou processo no ponto de tempo "t", após a estimulação.
    3. Para quantificar a fluorescência pré-estimulação, F (célula) t = 0, análise de imagens pré-estímulo do corpo da célula ou processo da mesma forma comoo sinal pós-estimulação. Use a densidade integrada média de 3 imagens para determinar F (celular) t = 0.

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Resultados

O indicador de cálcio GCaMP foi geneticamente expressa usando drivers ppk23-Gal4 Gr68a-Gal4 ou. Populações distintas de neurónios e células perna dianteira de suporte não neurais são rotulados por cada controlador (Figura 3A-C). Respostas específicas do ligando ao CH503 feromona lipofílico foram observadas em Gr68a-Gal4 e células expressando Gal4-ppk23 GCaMP (Figura 3D). A mudança relativa na intensidade de fluorescência do sinal GCaMP5G (Af / F)<...

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Discussão

Descrevemos aqui um método para realizar imagem de cálcio ao vivo de neurônios periféricos Drosophila em 2 órgãos sensoriais diferentes. O Ca 2+ -evoked respostas fluorescentes GCaMP em Gr68a-neurônios induzida pelo ligando feromônio CH503 foram dose-dependentes e quantitativa. Também foi possível discernir diferentes padrões de resposta neural, tais como fásicas e tônicas respostas.

Neurônios que mostram respostas fásicas são acreditados para permitir uma rápida adaptaçã...

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Divulgações

Os autores declaram que não há interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado pela Singapore National Research Foundation (concessão NRF-RF2010-06 para J.Y.Y.).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Presente Gr68a-Gal4de H. Amrein (Texas A& M Health Science Center, TX, EUA) e J. Carlson (Universidade de Yale, CT, EUA)
ppk23-Gal4Presente de K. Scott (Univ. da Califórnia, Berkeley, CA, EUA)
UAS-GCaMP5 42037Bloomington Drosophila  Centro de Estoque
de 0,17 mm de lamínula (Selo de Ouro) Serviços deMicroscopia Eletrônica63790-10
Esmalte de unhas, "Hard as Nails Clear" Caneta PAP Sally Hansen
Sigma-Aldrich 
Pincelde ponta fina
Fitaescocesa
Triton X-100Sigma-Aldrich 13021
Etanol, grau de laboratórioMerck10094
Hexano, grau HPLCSigma-Aldrich H303SK-4
DMSOSigma-Aldrich 
PBSTdescrita na seção do protocolo
CH503Síntese descrita em Mori et al., 2010
sCMOS Camera (ORCA Flash4.0)Hamamatsu Microscópio C11578-22U
(Ti-Eclipse)NikonNi-E
Cabeça de varredura de disco giratório Software de aquisição YokogawaCSU-X1-A1
(MetaMorph Premier)Molecular Devices40002
Fiji softwarede códigohttp://fiji.sc/Fiji
Z377821 de pincelMarca 472301Receita aberto

Referências

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