Die vorgestellten Protokolle beschreiben zwei enzymgekoppelte Immunsorbentassays (ELISA) basierende Techniken zur schnellen Untersuchung von Ligand-Rezeptor-Interaktionen: Der erste Assay ermöglicht die Bestimmung der Dissoziationskonstante zwischen Ligand und Rezeptor. Der zweite Assay ermöglicht eine schnelle Überprüfung von blockierenden Peptiden für Ligand-Rezeptor-Interaktionen.
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Methodenartikel
Ein ELISA-basierte Bindung und Wettbewerbsverfahren zu schnell zu bestimmen, Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Ein umfassendes Verständnis von Signalwegen erfordert detailliertes Wissen über die Ligand-Rezeptor-Interaktion. Dieser Artikel beschreibt zwei schnelle und zuverlässige punktuelle Protokolle von enzymgekoppelten Immunadsorptionstests (ELISAs) zur Untersuchung von Ligand-Rezeptor-Interaktionen: den direkten Ligand-Rezeptor-Interaktionstest (LRA) und den kompetitiven LRA. Als Fallstudie wird die ELISA-basierte Analyse der Interaktion zwischen verschiedenen Lambda-Interferonen (IFNLs) und der Alpha-Untereinheit ihres Rezeptors (IL28RA) vorgestellt: Der direkte LRA wird zur Bestimmung der Dissoziationskonstanten (KD-Werte) zwischen Rezeptor und IFN-Liganden verwendet, und der kompetitive LRA zur Bestimmung der inhibitorischen Kapazität eines Oligopeptids, das entwickelt wurde, um mit den IFNLs an ihrer Rezeptorbindungsstelle zu konkurrieren. Analytische Schritte zur Schätzung von KD- und halbmaximaler inhibitorischer Konzentration (IC50)-Werten werden beschrieben. Schließlich hebt die Diskussion die Vor- und Nachteile der vorgestellten Methode hervor und erläutert, wie die Ergebnisse ein besseres molekulares Verständnis von Ligand-Rezeptor-Interaktionen ermöglichen.
Einleitung
Ein umfassendes Verständnis der Signalwege erfordert detailliertes Wissen über die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung. Die meisten Methoden zur Beurteilung der Wechselwirkung eines bestimmten Liganden mit seinem spezifischen Rezeptor sind teuer, zeitaufwendig, arbeitsintensiv und erfordern eine spezielle Ausrüstung und Know - how 1.
Dieser Artikel beschreibt zwei schnelle und zuverlässige Punkt-für-Punkt-Protokolle den Liganden-Rezeptor-Interaktion an ein Enzym linked immunosorbent assay (ELISA) basieren, zu untersuchen: den direkten Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung-Assay (LRA) und den Wettbewerb LRA. ELISA ist ein sehr empfindlich....
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Protokoll
1. Vorbereitung der Reagenzien
- Zur Herstellung von Karbonat Beschichtungspuffer, lösen sich 0,36 g Na 2 CO 3 und 0,84 g NaHCO 3 in 100 ml destilliertem Wasser; Sterilfilter der Puffer durch ein Vakuum von 0,22 um Polyethersulfon (PES) Membranfilter und lagern bei RT bis zur Verwendung angetrieben werden.
- Bereiten Waschlösung durch Zugabe von 0,05% v / v Tween 20 in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS).
- Bereiten Sie eine 5% Rinderserumalbumin (BSA) (Blocking-Lösung) in PBS-Lösung durch Auflösen von 5 g BSA (≥98%) in 100 ml PBS und lagern bei 4 ° C.
- Rekombinante Rezeptor, Liganden und Blocking Pe....
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Ergebnisse
Die Dissoziationskonstanten zwischen INFL1-3 und deren Rezeptor alpha-Untereinheit IL28RA wurden unter Verwendung des direkten LRA bestimmt. Die Ergebnisse sind in Abbildung 3: Der Anteil an besetzten Bindungsstellen aufgetragen gegen den Logarithmus der jeweiligen IFN - Konzentration. Die Scatchard-Plot der Daten wird in der rechten unteren Ecke des Bildschirms angezeigt. Die Ergebnisse zeigen , dass die direkte LRA eine Bindungskurve ergibt, was die K D -Wer.......
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Diskussion
ELISA ist ein Standard und gut etablierte Methode für viele Laboratorien. Wir haben weiter modifiziert und verbessert eine zuvor Methode 5,7 veröffentlicht. Die aufgezeigte Schritt- für -Schritt - Protokoll zeigt , wie es in einfacher Weise verwendet werden können , um die K d -Werte von Ligand-Rezeptor - Wechselwirkungen zu bestimmen. Darüber hinaus ist die IC50 eines Blockierungspeptid, das bestimmt werden kann, mit dem Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung stört.
Wesentli.......
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Offenlegungen
A.E. wurde durch Forschungsstipendien des Programms „SNSF Ambizione Score“ (PZ00P3_154709), „Forschungsfond, Förderung strategischer Projekte“ der Universität Basel, der Stiftung Infektionskrankheiten Basel und der Bangeter Rhyner Stiftung unterstützt. J.L. dankt für die Unterstützung durch ein iPhD-Stipendium der SystemsX.ch-Initiative im Systemsbiologie-Programm (9. Ausschreibung).
Danksagungen
Wir danken Prof. J. Stelling (Department of Biosystems Science and Engineering, ETH Zürich und Swiss Institute for Bioinformatics, Basel, Schweiz) für seine kritische Überprüfung des Manuskripts.
....Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.
Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Nunc-Immunoplate (F96 Maxi sorp) | Thermo Scientific | 442404 | ELISA-Platte |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Merck | 497-19-8 | Für ELISA-Platten-Beschichtungspuffer |
| Sodium hydrogen carbonat(NaHCO3) | Merck | 144-55-8 | Für ELISA-Platten-Beschichtungspuffer |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030-100G | 5% BSA in PBS zum Blockieren |
| rhIL-28Rα/IFNλR1 | R&D systems | 5260-MR | Rekombinanter humaner Interleukin-28-Rezeptor alpha |
| rhIL-29/IFNλ1 | R&D systems | 1598-IL/CF | Rekombinantes humanes Interleukin-29/Trägerfrei/C-terminal 10-His-Tag |
| rhIL-28A/IFNλ2 | R&D systems | 1587-IL/CF | Rekombinantes humanes Interleukin-28A/Trägerfrei/C-terminal 6-His-Tag |
| rhIL-28B/IFNλ3 | R&D systems | 5259-IL/CF | Rekombinantes humanes Interleukin-28B/Trägerfrei/C-terminal 6-His-Tag |
| 6x His Monoklonaler Antikörper (Maus) | Clontech | 631212 | Primärantikörper zum Erfassen von His-markierten Liganden |
| Goat anti-Mouse igG (H+L) | Jackson Immuno Research | 115-035-166 | Pferde-Radieschen-Peroxidase-konjugiertes Sekundärantikörper |
| BDoptEIA TMB-Reagenz-Set | BD Biosciences | 555214 | ELISA-TMB-Substratlösung |
| Schwefelsäure (H2SO4) | Fulka | 84720 | 5 N H2SO4 (Enzymreaktionsstopplösung) |
| Synergy/H1 - Mikroplatten-Reader | BioTeK | ELISA-Platten-Reader |
Referenzen
- Schneider, P., Willen, L., Smulski, C. R. Tools and techniques to study ligand-receptor interactions and receptor activation by TNF superfamily members. Methods in enzymology. 545, 103-125 (2014).
- Rossi, G., et al.
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Nachdrucke und Genehmigungen
