Abstract
Om de moleculaire wegen van de ziekte van Parkinson (PD) onderzoeken en om nieuwe therapeutische strategieën, wetenschappelijke onderzoekers afhankelijk diermodellen. De identificatie van PD-geassocieerde genen heeft geleid tot de ontwikkeling van genetische PD modellen. De meeste transgene α-SYN muismodellen te ontwikkelen geleidelijke α-SYN pathologie, maar niet om duidelijke dopaminerge cel verlies en dopamine-afhankelijke behavioral tekorten weer te geven. Deze hindernis werd overwonnen door directe targeting van de substantia nigra met virale vectoren overexpressie-PD-geassocieerde genen. Lokale genafgifte via virale vectoren verschaft een aantrekkelijke manier om transgenen in het centrale zenuwstelsel tot expressie. Specifieke hersengebieden kan worden getarget (bijvoorbeeld de substantia nigra) kan expressie worden geïnduceerd in het volwassen omgeving en hoge expressieniveaus kunnen worden bereikt. Verder kunnen verschillende vector op basis van verschillende virussen worden gebruikt. Het protocol beschrijft alle cruciale stappen om een virale vector uit te voereninjectie in de substantia nigra van de rat een virale vector gebaseerde alpha-synuclein diermodel voor de ziekte van Parkinson te ontwikkelen.
Introduction
Om de pathofysiologie van PD te bestuderen en om nieuwe therapeutische strategieën te ontwikkelen, is er een dringende behoefte aan diermodellen die sterk lijken op de neuropathologie, fysiologie en motorische symptomen van de menselijke PD. Hoe hoger de voorspellende waarde, hoe beter we nieuwe therapieën van diermodellen vertalen naar patiënten.
De ontdekking van alfa-synucleïne (α-SYN) als eerste PARK gen 1997 geleid tot de ontwikkeling van de eerste genetische PD modellen. Veel transgene muizen overexpressie menselijk wild-type (WT) of mutant (A30P, A53T) α-SYN zijn gegenereerd in het afgelopen decennium. De niveaus van α-SYN overexpressie hebben bewezen cruciaal in de ontwikkeling van de pathologie zijn. Ook de muizenstam, de aanwezigheid of afwezigheid van endogene α-SYN en of de volledige lengte of een afgeknotte vorm wordt uitgedrukt, speelt een rol (gedetailleerd overzicht van Magen en Chesselet 1). Overexpressie van zowel WT en verscheidene klinische mutanten van humaan &# 945; -SYN in transgene muizen leidt tot pathologische accumulatie van α-SYN en neuronale dysfunctie 2-6. Echter, tot nu toe de meeste transgene α-SYN muismodellen geen duidelijke dopaminerge cel verlies en dopamine-afhankelijke behavioral tekorten weer te geven.
Deze hindernis werd overwonnen door directe targeting van de substantia nigra (SN) met virale vectoren overexpressie α-SYN. Virale vectoren zijn afgeleid van virussen die gemakkelijk cellen kunnen infecteren, genetisch materiaal in hun gastheergenoom en dwingen de gastheercel het virale genoom repliceren om nieuwe virusdeeltjes produceren. Virussen kunnen worden gemanipuleerd om niet-replicerende virale vectoren op hun vermogen om in cellen en genen te introduceren behouden. Door schrapping delen van het virale genoom en te vervangen door de genen van belang, zal de toepassing van de vector tot een enkele ronde infectie zonder replicatie in de gastheercel, algemeen aangeduid als "transductie". Virale vectoren ceen worden gebruikt voor overexpressie en silencing. De expressie transgen kan een reporter proteïne (bv groen fluorescerend eiwit of vuurvlieg luciferase) 7, een therapeutisch eiwit voor gentherapie toepassingen of 8-10, zoals we zullen zich in dit papier, een ziekte gerelateerd eiwit dat voor ziektemodel 11 -14.
Virale vector gemedieerde genafgifte verschaft een alternatieve manier om transgenen in het CNS tot expressie met een aantal voordelen. Met behulp van lokale transgene levering kunnen specifieke hersengebieden worden gericht. Verder kunnen transgene expressie worden geïnduceerd tijdens de volwassenheid minder kans op compensatiemechanismen tijdens de ontwikkeling. Ook kunnen modellen worden gemaakt in verschillende soorten en rassen. En ten slotte, verschillende transgenen kan gemakkelijk gecombineerd worden. Gebruik virale vectoren, kunnen hoge transgenexpressie niveaus worden bereikt, die cruciaal zou kunnen zijn aangezien het begin van de ziekte en de ernst vaak afhangen van de mate van OVEREXPression.
Verschillende vectorsystemen basis van verschillende virussen ontwikkeld. De keuze van de vector is afhankelijk van de grootte van het gen van belang, de gewenste duur van de genexpressie, de doelcel en bioveiligheidsimplicaties. Voor stabiele genoverdracht in de hersenen, lentivirale (LV) en recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) vectoren worden nu beschouwd als de vectorsystemen gekozen aangezien ze de efficiënte en langdurige genexpressie in de hersenen van knaagdieren. Voor specifieke targeting van de dopaminerge neuronen (DN) van de SN, hebben rAAV vectoren geleidelijk weggeconcurreerd LV vectoren vanwege hun hogere titers en transductie efficiëntie van DN.
De beste α-SYN gebaseerde knaagdiermodellen momenteel beschikbaar zijn ontwikkeld vanuit een gecombineerde benadering, waarbij nieuwere AAV serotypes (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) en geoptimaliseerde vector constructen titers en zuiverheid 15,16. De vector titer evenals de vector zuiverheid directe invloedde fenotypische uitkomst van het model. Overmatig vector titers of onvoldoende gezuiverd vector partijen kan leiden tot niet-specifieke toxiciteit. Daarom passende controlevectoren onontbeerlijk. Geruime tijd investeringen in de virale vector productie, opschaling en procedures zuivering hebben ook bewezen dat het essentieel om reproduceerbare en hoge kwaliteit vector batches te verkrijgen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierproeven worden uitgevoerd in overeenstemming met de Europese Gemeenschappen richtlijn van de Raad van 24 november 1986 (86/609 / EEG) zijn goedgekeurd door de bio-ethische commissie van de Universiteit van Leuven (België).
1. Recombinant AAV productie en zuivering
Opmerking: rAAV vector productie en zuivering werd uitgevoerd door Leuven Viral Vector Core (LVVC) zoals eerder beschreven 17.
- In het kort transfecteren subconfluente laag (<50) doorgang hechtende HEK 293T cellen met een 25kD lineaire polyethyleenimine 150 nM NaCl transfectieoplossing en drie verschillende plasmiden in een verhouding van 1: 1: 1 in DMEM medium 2% foetaal runderserum. Na 24 uur incubatie bij 37 ° C in een 5% CO 2 Vervang het medium met vers DMEM medium 2% foetaal runderserum.
Noot: De plasmiden bevatten de constructen voor AAV7 serotype, de AAV transferplasmide codeert voor de menselijke mutant A53T α-SYN onder de controle van de versterkte CMVie synapsin1 promotor en de pAdvDeltaF6 adenovirale helper plasmide 17. - Oogst de drager 5 dagen na transiënte transfectie en concentraat via tangentiële flow filtratie 17.
- Zuiver het rAAV vectordeeltjes in het geconcentreerde medium met behulp van een stapsgewijze gradiënt 17 iodixanol.
- Gebruik standaard technieken van real-time PCR voor genomische kopie (GC) bepaling. In dit protocol, een vector titer van 3,0 E11 GC / ml werd gebruikt om een α-SYN gebaseerde rattenmodel ontwikkeld voor PD 17.
2. stereotactische injectie van rAAV α-SYN vector in de SN van de rat (figuur 2)
- House acht weken oud vrouwelijke Wistar-ratten met een gewicht van ongeveer 200-250 g onder een normale 12 uur licht / donker cyclus met vrije toegang tot gepelleteerde voedsel en water uit de kraan.
- Verzend rat intraperitoneale (ip) anesthesie met een mengsel van ketamine (60 mg / kg) en medetomidine (0,4 mg / kg). Zodra de rat wordt verdoofd en reageert nietwanneer knijpen de verschillende poten, toedienen van een micro-transponder subcutaan op de rug van de rat voor verdere erkenning behulp van een micro-transponder implantaatinjector. Controleer of de micro-transponder juist gepositioneerd en kunnen door de leesinrichting worden gelezen.
- Snijd het haar bovenop de hoofdhuid. Breng een plaatselijke verdoving zowel de hoofdhuid en oren. Voer de rest van de chirurgische procedure onder een laminaire stroming behulp van aseptische technieken.
- Plaats de ratten in een stereotactische hoofd frame met behulp van twee oor bars, een mond en een neus bar. Bedek het lichaam van de rat met een papieren deken op een daling van de lichaamstemperatuur voorkomen. Pas een oculair smeermiddel om te voorkomen dat de ogen uitdrogen.
- Ontsmet de hoofdhuid met jodium 1% in isopropanol 70% en een kleine incisie in de middellijn van de hoofdhuid. Voorzichtig schrapen weg de membranen op de schedel en spoel met een zoutoplossing. Laat de schedel drogen gedurende enkele minuten. Let op de schedelnaden en de twee referentiepunten: Bregma en Lambda. Om de rAAV vector in de SN te injecteren, bepalen de coördinaten in de richting van Bregma (achterwaartse: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm en dorsoventral: 7,2 mm berekend op basis van de dura).
Opmerking: De driedimensionale coördinaten van elk gebied van belang kan worden berekend met een stereotaxische atlas van de rattenhersenen, toepassing Bregma met anatomisch referentiepunt. - Vul een 10 ul micro-injectie spuit (30 gauge 20 mm) met rAAV vector en plaats het in de stereotaxische instrument verbonden met een gemotoriseerde micro-injectie pomp. Regel het volume door het vrijgeven van een daling van de vector en te elimineren in een polyvalent schoonmaakmiddel pH 9 (bijv RBS).
- Visueel controleren of de kop is bevestigd recht in het hoofd frame en evalueren van de links-rechts as. Zorgvuldig visueel bepalen de achterwaartse en mediolateral coördinaten voor Bregma en Lambda en meet de hoogte met behulp van een 30 gauge 20 mm naald in de dorsoventral arm van de stereotactische frame.
- laat amaximale van 0,3 mm verschil in hoogte tussen Bregma en Lambda. Plaats de naald terug op Bregma en de achterwaartse en mediolateral coördinaten toe te passen door het bewegen van de achterwaartse en de mediolateral arm van de stereotactische frame.
- Op de plaats van de injectie, het meten van de hoogte van de schedel en ervoor zorgen dat het verschilt niet meer dan 0,3 mm van de hoogte van Bregma. Boor een gat in de schedel met een diameter van ongeveer 2 mm. Meet de hoogte van de dura, zal dit dienen als referentie gelden de dorsoventral coördineren. Als alternatief aftrekken vaste dikte van de schedel (0,9 mm).
- Doordringen in de dura met behulp van een 26 gauge naald en te absorberen het bloed met een steriele. Wacht totdat alle bloeden is gestopt voordat u verder gaat.
- Langzaam steek de micro-injectie 10 pl injectiespuit vooraf gevuld met vector oplossing in de hersenen naar de vooraf bepaalde diepte (dorsoventral coördinaat). Wacht 1 min met de naald op zijn plaats. Injecteer 3 ulvector oplossing (3,0 E11 genoom kopieën / ml (gemiddeld vector dosis) of 1,0 E12 GC / ml (hoog vector dosis) rAAV2 / 7 α-SYN of eGFP controlevector) met de gemotoriseerde micro-injectie pomp met een debiet van 0,25 pl / min.
- Na injectie, houdt de naald op zijn plaats voor nog eens 5 minuten voordat langzaam te verwijderen. Steek de hoofdhuid met behulp van gecoate gevlochten polyester 3.0, desinfecteren met 1% jodium in 70% isopropanol en voorzichtig het dier uit het stereotactische instrument. draai eerst de neus en mond bar, waarna de twee oor bars.
- De anesthesie keren injecteren ratten intraperitoneaal met 0,5 mg / kg atipamezol en plaats de rat in een schone kooi op een verwarmingsplaat van 38 ° C tot ontwaakt. Bedek de rat met een papieren deken op een daling van de lichaamstemperatuur voorkomen.
- Zorg voor eenvoudige toegang tot voedsel en water voor de eerste uren. Bewaken van de rat voor de eerste paar dagen. Indien nodig passen analgesie.
Opmerking: Het is niet nodig om de steken uit t verwijderenHij schedel. Na 1-2 weken de schedel volledig is hersteld en de steken komen los.
3. Beoordeling van rAAV2 / 7 α-SYN geïnjecteerde ratten met behulp van niet-invasieve PET Imaging, gedragstesten en immunohistochemische analyse
- Om de opvolging van de kinetiek van nigrostriatale dopaminerge neurodegeneratie niet-invasief de loop der tijd bij individuele dieren, kwantificeren dopamine transporter (DAT) binding met behulp van kleine dieren positron emissie tomografie (PET) en een tracer van de DA Transporter bijvoorbeeld [18F] -FECT 16 .
- Om te onderzoeken of het niveau van dopaminerge neurodegeneratie is voldoende om motorische stoornissen in de ratten te induceren, onder voorbehoud van de ratten naar de cilinder test om spontaan voorpoot gebruik te evalueren.
- Plaats de rat in een 20 cm breed heldere glazen cilinder en videotape het gedrag tijdens de verticale bewegingen langs de muur en de landing na een achterste. Score het aantal contacten die door elke voorpoot voor een totaal van 20contacten. Voor een gedetailleerde beschrijving van de scoring criteria zie Schallert et al. 18 Druk het aantal verminderde voorpoot contacten (bijv linker voorpoot) als een percentage van de totale voorpoot contacten (links plus rechts voorpoot).
Let op: Niet-laesie controle ratten met beide poten in gelijke mate moet rond de 50% in deze test scoren.
- Plaats de rat in een 20 cm breed heldere glazen cilinder en videotape het gedrag tijdens de verticale bewegingen langs de muur en de landing na een achterste. Score het aantal contacten die door elke voorpoot voor een totaal van 20contacten. Voor een gedetailleerde beschrijving van de scoring criteria zie Schallert et al. 18 Druk het aantal verminderde voorpoot contacten (bijv linker voorpoot) als een percentage van de totale voorpoot contacten (links plus rechts voorpoot).
- Voer immunohistochemische analyse (IHC) om het niveau van transgenexpressie en dopaminerge celverlies beoordelen.
- Op verschillende eindfase, offeren de ratten met een overdosis van natriumpentobarbital (60 mg / kg, ip) en het uitvoeren van een intracardiale perfusie met koude zoutoplossing, gevolgd door 4% paraformaldehyde in PBS 19. Fixeer de hersenen gedurende de nacht bij 4 ° C en gesneden 50 pm dikke coronale hersensecties met een trillende microtoom.
- Voer IHC vlekken op vrij zwevende delen met behulp van antilichamen tegen α-SYN en tyrosine hydroxylase tot α-SYN expressie niveaus en de le analyserenvel van neurodegeneratie 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De opzet van het experiment is in Figuur 1
rAAV 07/02-gemedieerde overexpressie van A53T α-SYN induceert tekorten dopamine-afhankelijke motor.
Om te onderzoeken of het niveau van de α-SYN overexpressie is voldoende om motorische stoornissen in de ratten te induceren, we onderworpen de ratten naar de cilinder test om spontaan voorpoot gebruik (figuur 3A) te evalueren. Van 3 weken na injectie, werd een enkele motorische stoornissen waargenomen bij ratten die een dosis 3,0 E11 GC / ml A53T α-SYN rAAV2 / 7 vector ontvangen. Op 4 weken na injectie van een 50% daling van spontane contralaterale (linker) voorpoot gebruik werd waargenomen, terwijl de controlegroep eGFP rAAV2 / 7 geïnjecteerde dieren geen asymmetrie voorpoot gebruikt (Figuur 3B) toonde. Ratten die een hogere A53T α-SYN rAAV2 / 7 vector dosis ontvingen toonden een meer uitgesproken impairment voorpoot gebruik (70%) en 29 dagen na injectie (Figuur 3C). Om te bewijzen dat de waargenomen motorische beschadiging was dopamine-afhankelijke, we toegediend een enkele dosis van L-DOPA (6 mg / kg ip) aan de ratten geïnjecteerd met een hoge dosis vector. Toen we herhaalde de cilinder-test 45 minuten na de L-DOPA behandeling, een volledig herstel van de voorpoot gebruik in de A53T α-SYN rAAV2 / 7 geïnjecteerde dieren waargenomen (Figuur 3C).
PET-beeldvorming maakt het mogelijk niet-invasieve beeldvorming van α-SYN-geïnduceerde progressieve neurodegeneratie.
Om de opvolging van de kinetiek van nigrostriatale dopaminerge neurodegeneratie niet-invasief de loop der tijd bij individuele dieren, gekwantificeerd we dopamine transporter (DAT) binding met behulp van kleine dieren positron emissie tomografie (PET) met [18F] -FECT als radioligand. DAT binding aanzienlijk gedaald in de ipsilaterale Spiegelse-putamen van A53T α-SYN rAAV2 / 7 injected ratten na verloop van tijd, maar bleef stabiel in de eGFP controle dier (Figuur 4A - 4B). Kwantificering van DAT binding van A53T α-SYN rAAV2 / 7 geïnjecteerde dieren vertoonden een maximale snelheid van nigrostriatale dopaminerge degeneratie tussen dag 7 en 21 na de injectie. Na 32 dagen, werd een afname in binding DAT tot 85% waargenomen (Figuur 4C). Als positieve controle, injectie van het neurotoxine 6-OHDA in de SN geïnduceerd 90% verlies van DAT binding binnen 7 dagen (Figuur 4B - 4C).
Stereotactische injectie van rAAV2 / 7 A53T α-SYN in het SN van de rat induceert nigrale dopaminerge celdood en de vorming van onoplosbare α-SYN positieve aggregaten.
Om het niveau van α-SYN overexpressie en dopaminerge celverlies analyseren we de dieren opgeofferd op verschillende tijdstippen. IHC werd uitgevoerd op vrij zwevende delen met behulp van een antilichaam against α-synucleïne (konijn polyklonaal 1: 5000). Dit antilichaam kan detecteren zowel mens en rat α-synucleïne, maar endogene niveaus van rat α-synucleïne waren beneden de detectielimieten in nigrale cel somata door zijn overheersende lokalisatie van synaptische membranen. Om ezels celverlies gebruikten we een antilichaam tegen TH (konijn polyklonaal 1: 1000).
Vier dagen na rAAV vector injectie, α-SYN of eGFP expressie werd gedetecteerd in de SN (Figuur 5A - 5C) van de ratten. De meerderheid (> 90%) van de DN werd getransduceerd en efficiënt zowel transgene eiwitten gelokaliseerd in de cellichamen en axonen. Op 29 dagen na de injectie (pi) een aanzienlijke vermindering van α-SYN expressie werd waargenomen in de SNpc, terwijl detecteerbaar in gebieden rond de SN (figuur 5B - 5C) nog. Vervolgens analyseerden we het niveau van nigrale cel verlies. Een snelle en progressief verlies of tot 80% van TH-positieve neuronen gedetecteerd op 29 dagen bij ratten geïnjecteerd met A53T α-SYN rAAV2 / 7 (Figuur 5D - 5H). Opmerkelijk overexpressie van wildtype plaats van A53T α-SYN resulteerde in vergelijkbare dopaminergische neurodegeneratie (gegevens niet getoond). Het verlies van de DN in de SN ging gepaard met een sterke daling van TH-positieve zenuwuiteinden in het striatum (STR) (Figuur 5F). Om uit te sluiten specifieke vector partij effecten werden verschillende α-SYN vector voorbereidingen getest in de SN met vergelijkbare resultaten. Geen verlaging TH kleuring werd waargenomen in de SN of STR van eGFP rAAV2 / 7 geïnjecteerde controledieren (Figuur 5E-5H). Naast dopaminergische neurodegeneratie, de aanwezigheid van α-synucleïnopathie is een tweede belangrijk kenmerk van PD. Ondanks de korte tijdsverloop van ons model (vier weken), zagen we zowel α-SYN-positieve cytoplasmatische aggregaten in de SN en dystrofische neurieten in de STR (figuur 5I ong>). Ubiquitine immunoreactiviteit is een duidelijk kenmerk van Lewy body pathologie in de hersenen 20-22. We zagen co-lokalisatie van α-SYN en ubiquitine bij 29 dagen pi in een fractie (± 20%) van de α-SYN expressie nigrale neuronen (Figuur 5J). De fibrillaire aard van de α-SYN aggregaten werd geëvalueerd door Thioflavine S (Thio S) 23 kleuring. Thio S positieve cellen werden in de SN van 17 dagen verder (figuur 5J) gedetecteerd.
Figuur 1:. Stereotactische injectie van rAAV2 / 7 α-SYN vector leidt tot progressieve neurodegeneratie stereotactische injectie van rAAV2 / 7 α-SYN vector in de SN van de rat induceert dopaminergische neurodegeneratie gemeten via gedragsanalyse (cilinderproef), niet-invasieve PET beeldvorming en IHC-analyse.d / 53670 / 53670fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: stereotactische injectie rAAV2 / 7 die codeert voor α-SYN in de SN van de rat. (A, B, E) De schedelnaden op de rat schedel, het definiëren van de twee referentiepunten: Bregma en Lambda. (C) Een stereotaxische Atlas van de rattenhersenen presentatie regio injectie namelijk de SN. (D) een Wistar rat geplaatst in een stereotactische hoofd frame met behulp van twee oor bars, een mond en een neus bar. (F) De 30 gauge naald gevuld met vector wordt in positie gebracht voor de substantia nigra. (G) Een klein geheel wordt geboord op de plaats van injectie en de naald in positie wordt geplaatst. (H) Na de injectie van de hoofdhuid is stitched en ontsmet. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: rAAV 2/7 gemedieerde overexpressie van A53T α-SYN induceert tekorten dopamine-afhankelijke motor (A, B) Cilinder test op verschillende tijdstippen na injectie van rAAV2 / 7 A53T α-SYN.. (Gemiddelde ± SD, * p <0,05 versus 17 dagen, # p <0,05 eGFP controles door ANOVA en Tukey post hoc test, n = 5). (C) Cilinder test op verschillende tijdstippen na injectie van rAAV2 / 7 A53T α-SYN (vector hoge dosis). (Gemiddelde ± SD, * p <0,05 versus 4 dagen 29 dagen door ANOVA en Tukey post hoc test, n = 5). De test werd uitgevoerd met of zonder toediening van Levodopa (L-DOPA). (Gemiddelde ± SD, * p <0.05 niet-behandelde versus behandelde dieren door ANOVA en Tukey post hoc test, n = 5). Overgenomen uit Neurobiologie van veroudering, Vol. 36 Van der Perren et al. Longitudinale opvolging en karakterisatie van een robuuste rat model voor de ziekte van Parkinson op basis van overexpressie van alfa-synucleine met adeno geassocieerde virale vectoren, 1543-1558, (2015), met toestemming van Elsevier. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4:. Niet-invasieve beeldvorming van A53T α-SYN geïnduceerde dopaminerge celdood middels DAT PET beeldvorming (A - B) reeks horizontale en coronale plakjes beeltenis gemiddelde striatale DAT binding van (A) rAAV2 / 7 A53T α-SYN geïnjecteerde dieren bij different tijdstippen na injectie (n = 7) en (B) rAAV2 / 7 eGFP geïnjecteerd (n = 1) of 6-OHDA behandelde controledieren (n = 1) 79 dagen na injectie. Kleur balken geven bindende potentieel voor de DAT. (C) Kwantificering van de DAT-binding van rAAV2 / 7 A53T α-SYN, rAAV2 / 7 eGFP en 6-OHDA geïnjecteerde dieren gemeten op verschillende tijdstippen (gegevens representeren gemiddelde ± SD). Overgenomen uit Neurobiologie van veroudering, Vol. 36 Van der Perren et al. Longitudinale opvolging en karakterisatie van een robuuste rat model voor de ziekte van Parkinson op basis van overexpressie van alfa-synucleine met adeno geassocieerde virale vectoren, 1543-1558, (2015), met toestemming van Elsevier. klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: rAAV 2/7 gemedieerde overexpressie van A53T α-SYN induceert dopaminerge celdood en vorming van onoplosbare α-SYN positieve aggregaten. (A - B) IHC tonen α-SYN overexpressie 4 dagen en 29 dagen na rAAV gemedieerde overdracht in rat SN. Inserts tonen vergrotingen van het geselecteerde gebied. Schaal bar = 400 pm (overzicht foto links), 70 urn en 200 urn (inserts rechts). (C) IHC kleuring demonstreren eGFP overexpressie 4 dagen en 29 dagen na rAAV bemiddelde overdracht in rat SN. Schaal bar = 400 pm. (D - G) IHC kleuring voor TH in de SN en STR op verschillende tijdstippen na injectie van (D, F) rAAV2 / 7 α-SYN of 29 dagen na injectie van (E, G) rAAV2 / 7 eGFP in het SN . Schaalbalk a, c = 400 pm, b, d = 1000 micrometer. (H) Stereologische kwantificering van de gevoellooser van TH-positieve neuronen in de SN na verloop van tijd na rAAV2 / 7 A53T α-SYN injectie of rAAV2 / 7 eGFP controle vector (gemiddelde ± SD, * p <0,05 versus 8 dagen, # p <0,05 versus eGFP controles door ANOVA en Tukey post hoc test, n = 5). (I) IHC kleuring demonstreren α-SYN pathologie, met inbegrip van cytoplasmatische aggregaten in de SN en Dystrofe en uitpuilende neurieten in de STR, na intranigrale rAAV2 / 7 A53T α-SYN injectie. (J) Vertegenwoordiger confocale beelden van TL dubbele immunokleuring voor α-SYN (groen) en ubiquitine (rood) laten een toename in co-lokalisatie na verloop van tijd (pijlen). Schaal bar c = 50 pm. Thioflavin S kleuring van SN 29 dagen na injectie van rAAV2 / 7 A53T α-SYN. Schaal bar D = 30 micrometer. Overgenomen uit Neurobiologie van veroudering, Vol. 36 Van der Perren et al. Longitudinale opvolging en karakterisatie van een robuuste rat model voor de ziekte van Parkinson op basis van overexpressie van alfa-synucleine met adeno-geassocieerde virale vectoren, 1543-1558, (2015), met toestemming van Elsevier. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Er zijn verschillende kritische stappen in het protocol. De vector titer als de vector zuiverheid rechtstreeks welke fenotypische uitkomst van het model. Overmatig vector titers of onvoldoende gezuiverd vector partijen kan leiden tot niet-specifieke toxiciteit. Daarom is het gebruik van hoge kwaliteit vector series en geschikt controlevectoren onontbeerlijk. Verder is de exacte positionering van het hoofd van de rat in het stereotactische frame en de nauwkeurige bepaling van de coördinaten essentieel is gericht op de substantia nigra. Nadat het gat is geboord in de schedel op de injectieplaats, is het belangrijk om de naald ingezet recht in hersenen van de rat zonder marges raken. De naald moet langzaam worden verwijderd na het injecteren van de virale vector tot vector lekkage te voorkomen. Ten slotte, na het stikken, de hoofdhuid moet worden ontsmet met 1% jodium in 70% isopropanol te bijten van de hechtingen te vermijden door andere dieren. Als alternatief andere antiseptische reagentiakan worden gebruikt.
De beschreven werkwijze kan ook worden gebruikt om een rAAV2 / 7 α-SYN gebaseerde muismodel voor de ziekte van 24 Parkinson te ontwikkelen. Bij muizen injecteren we een volume van 2 pl rAAV vector in de SN. In vergelijking met ratten, muizen DN lijken enigszins minder gevoelig voor a-SYN overexpressie, waardoor een vertraagde manifestatie van neurodegeneratie is. Bovendien kunnen andere delen van de hersenen (bv striatum, hippocampus, cortex, etc.) worden gericht. De coördinaten voor de verschillende hersengebieden kunnen worden gevonden in de stereotaxische atlas. Optimalisatie van de coördinaten kan worden uitgevoerd door Chinese inkt of met een virale vector die codeert voor een reportergen (bijv eGFP). Systemen verschillende vectoren (rAAV, LV, etc.) kunnen worden gebruikt afhankelijk van de toepassing.
Deze techniek heeft de beperking dat elk dier afzonderlijk worden geïnjecteerd. Daarom moet een persoon met de injecties om de min te voerenimize verschillen tussen verschillende dieren. Een andere beperking is dat de methode is tijdrovend (wanneer deze wordt uitgevoerd door een ervaren persoon duurt het ongeveer 45 minuten per dier). Slechts acht tot tien dieren worden geïnjecteerd in één dag.
Virale vector gemedieerde genafgifte zorgt voor specifieke targeting van hersengebieden. Gebruik virale vectoren, kunnen hoge transgenexpressie niveaus worden bereikt, wat cruciaal is sinds begin van de ziekte en de ernst afhankelijk van het niveau van α-SYN expressie. Ook kunnen verschillende doses worden toegepast die resulteert in een diermodel tonen langzamere of snellere kinetiek van neurodegeneratie. Tenslotte kan deze techniek worden gebruikt om modellen in verschillende diersoorten en stammen met dezelfde vectorbereiding maken.
Deze procedure kan worden gebruikt om virale vectoren en toxines (bijvoorbeeld 6-OHDA) in verschillende gebieden van de brain.The transgen gecodeerd door de vector kan een reporter proteïne, een therapeutisch pProtein voor gentherapie toepassingen 8-10 of een ziekte gerelateerd eiwit dat voor ziektemodel 11-14. Deze techniek kan worden gebruikt om nieuwe diermodellen die het mogelijk maken preklinische drug beproeving en kan nuttig bestuderen van de moleculaire mechanisme van de ziekte van Parkinson en vele andere neurodegeneratieve aandoeningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen reëel of potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
De auteurs danken Joris Van Asselberghs en Ann Van Santvoort voor hun uitstekende technische bijstand. Onderzoek werd gefinancierd door het IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80.020), het FWO Vlaanderen (G.0768.10), van het EG-FP6 programma 'Dimi' (LSHB-CT-2005-512146), het KP7 OTO-project MEFOPA (GEZONDHEID -2.009-241.791), het KP7-programma 'Inmind' (HEALTH-F2-2011-278850), de KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, Imir PF / 10/017), en de MJFox Foundation (Target validatie 2010). A. Van der Perren en C. Casteels zijn een postdoctorale bursalen van het Vlaams Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek. K. Van Laere is senior klinisch fellow van het Vlaams Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5,000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1,000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6 mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
References
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., Richter, F.
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
- Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L.
- Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle? Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H. 3rd Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).
