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एक संयोजक एडिनो जुड़े वायरल वेक्टर के stereotactic इंजेक्शन के माध्यम से पार्किंसंस रोग के लिए एक अल्फा-synuclein आधारित चूहे मॉडल का विकास

Published: February 28, 2016 doi: 10.3791/53670
Automatic Translation
1, 2, 2, 3,4, 1,4, 1
1Laboratory for Neurobiology and Gene Therapy, Department of Neurosciences, KU Leuven, 2Division of Nuclear Medicine, Leuven University Hospital - KU Leuven, 3Laboratory for Molecular Virology and Gene Therapy, Department of Pharmaceutical and Pharmacological Sciences, KU Leuven, 4Leuven Viral Vector Core, KU Leuven

Abstract

पार्किंसंस रोग (पीडी) की आणविक मार्ग का अध्ययन करने और उपन्यास चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने के लिए, वैज्ञानिक जांचकर्ताओं पशु मॉडल पर भरोसा करते हैं। पीडी जुड़े जीन की पहचान आनुवंशिक पीडी मॉडल के विकास के लिए प्रेरित किया है। अधिकांश ट्रांसजेनिक α-SYN माउस मॉडल क्रमिक α-SYN विकृति विकसित लेकिन स्पष्ट डोपामिनर्जिक सेल नुकसान और डोपामाइन निर्भर व्यवहार घाटे को प्रदर्शित करने के लिए असफल। इस बाधा को पीडी जुड़े जीन overexpressing वायरल वैक्टर के साथ द्रव्य नाइग्रा का सीधा लक्ष्य-निर्धारण से दूर था। स्थानीय जीन वायरल वैक्टर का उपयोग वितरण केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में ट्रांसजीन व्यक्त करने के लिए एक आकर्षक हो गए हैं। विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों को निशाना बनाया जा सकता है (जैसे द्रव्य नाइग्रा), अभिव्यक्ति वयस्क सेटिंग में प्रेरित किया जा सकता है और उच्च अभिव्यक्ति के स्तर को हासिल किया जा सकता है। इसके अलावा, विभिन्न वेक्टर विभिन्न वायरस के आधार पर प्रणाली का इस्तेमाल किया जा सकता है। प्रोटोकॉल एक वायरल वेक्टर प्रदर्शन करने के लिए सभी महत्वपूर्ण कदम की रूपरेखाचूहे के द्रव्य नाइग्रा में इंजेक्शन पार्किंसंस रोग के लिए एक वायरल वेक्टर आधारित अल्फा synuclein पशु मॉडल विकसित करने के लिए।

Introduction

पीडी के pathophysiology अध्ययन करने के लिए और उपन्यास चिकित्सकीय रणनीति विकसित करने, पशु मॉडल है कि निकट मानव पीडी के तंत्रिकाविकृति विज्ञान, शरीर विज्ञान और मोटर लक्षणों के समान के लिए एक तत्काल आवश्यकता है। उच्च भविष्य कहनेवाला मूल्य, बेहतर है कि हम रोगियों के लिए पशु मॉडल से नए उपचारों अनुवाद कर सकते हैं।

अल्फा synuclein की खोज (α-SYN) 1997 में पहली PARK जीन के रूप में पहली आनुवंशिक पीडी मॉडल के विकास के लिए नेतृत्व किया। कई ट्रांसजेनिक चूहों मानव जंगली प्रकार (डब्ल्यूटी) या उत्परिवर्ती (A30P, A53T) overexpressing α-SYN पिछले एक दशक से अधिक उत्पन्न कर दिया है। α-SYN overexpression के स्तर में विकृति विज्ञान के विकास में महत्वपूर्ण साबित किया है। इसके अलावा माउस तनाव, उपस्थिति या अंतर्जात α-SYN की और क्या पूरी लंबाई या एक छोटा रूप में व्यक्त किया जाता अभाव, (Magen और Chesselet 1 से विस्तृत समीक्षा) एक भूमिका निभाता है। दोनों WT और मानव के कई नैदानिक ​​म्यूटेंट की overexpression &# 945; ट्रांसजेनिक चूहों में -SYN α-SYN के रोग संचय और neuronal रोग 2-6 लाती है। हालांकि, अब तक सबसे ट्रांसजेनिक α-SYN माउस मॉडल स्पष्ट डोपामिनर्जिक सेल नुकसान और डोपामाइन निर्भर व्यवहार घाटे को प्रदर्शित करने में विफल रहा है।

इस बाधा को द्रव्य नाइग्रा (एस एन) overexpressing α-SYN वायरल वैक्टर के साथ का सीधा लक्ष्य-निर्धारण से दूर था। वायरल वैक्टर वायरस है कि आसानी से कोशिकाओं को संक्रमित उनके मेजबान जीनोम में आनुवांशिक सामग्री को लागू करने और आदेश में नए वायरस कणों का उत्पादन करने में वायरल जीनोम को दोहराने के लिए मजबूर कर सकते हैं मेजबान सेल से निकाली गई है। वायरस गैर नकल वायरल वैक्टर कि कोशिकाओं में प्रवेश और जीन शुरू करने की उनकी क्षमता बनाए रखने के लिए इंजीनियर हो सकता है। वायरल जीनोम के कुछ हिस्सों को हटाने और उन्हें ब्याज की जीन द्वारा की जगह तक, वेक्टर के आवेदन मेजबान सेल, आम तौर पर 'पारगमन' के रूप में नामित में प्रतिकृति बिना एक भी गोल संक्रमण में परिणाम होगा। वायरल वैक्टर गएक दोनों overexpression और जीन मुंह बंद करने के लिए इस्तेमाल किया जाएगा। व्यक्त ट्रांस्जीन एक संवाददाता प्रोटीन (जैसे हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन या जुगनू luciferase) 7, जीन थेरेपी अनुप्रयोगों 8-10 के लिए एक चिकित्सकीय प्रोटीन या, के रूप में हम इस पत्र में पर ध्यान दिया जाएगा, हो सकता है एक बीमारी से संबंधित प्रोटीन रोग मॉडलिंग 11 के लिए इस्तेमाल किया -14।

वायरल वेक्टर की मध्यस्थता जीन डिलीवरी कई फायदे के साथ सीएनएस में ट्रांसजीन व्यक्त करने के लिए एक वैकल्पिक तरीका प्रदान करता है। स्थानीय ट्रांस्जीन वितरण का उपयोग करना, विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्रों को निशाना बनाया जा सकता है। इसके अलावा, transgene अभिव्यक्ति वयस्कता के विकास के दौरान प्रतिपूरक तंत्र के जोखिम को कम करने के दौरान प्रेरित किया जा सकता है। इसके अलावा, मॉडल विभिन्न प्रजातियों और दबाव में बनाया जा सकता है। और अंत में, अलग-अलग ट्रांसजीन आसानी से जोड़ा जा सकता है। वायरल वैक्टर का उपयोग, उच्च transgene अभिव्यक्ति के स्तर को हासिल किया जा सकता है, महत्वपूर्ण हो सकता है जिसके बाद से रोग की शुरुआत और गंभीरता अक्सर overexp के स्तर पर निर्भरression।

कई वेक्टर अलग वायरस पर आधारित सिस्टम विकसित किया गया है। वेक्टर सिस्टम के विकल्प ब्याज की जीन, जीन अभिव्यक्ति, लक्ष्य सेल और जैव सुरक्षा के मुद्दों की आवश्यकता है अवधि के आकार पर निर्भर करता है। मस्तिष्क, lentiviral (एल.वी.) में स्थिर जीन स्थानांतरण और पुनः संयोजक एडिनो से जुड़े वायरल के लिए (rAAV) वैक्टर अब चुनाव के वेक्टर प्रणालियों के बाद से वे कृंतक मस्तिष्क में कुशल और लंबी अवधि के जीन अभिव्यक्ति के लिए नेतृत्व माना जाता है। एसएन के डोपामिनर्जिक न्यूरॉन्स (डी.एन.) के विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए, rAAV वैक्टर धीरे-धीरे क्योंकि उनके उच्च titers और डी.एन. के पारगमन दक्षता के एल.वी. वैक्टर outcompeted है।

सबसे अच्छा α-SYN आधारित कृंतक मॉडल वर्तमान में उपलब्ध एक संयुक्त दृष्टिकोण नए एएवी सीरमप्रकारों का उपयोग करने से विकसित किया गया है (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) और अनुकूलित वेक्टर निर्माणों, titers, और पवित्रता 15,16। वेक्टर अनुमापांक के साथ ही वेक्टर पवित्रता सीधे प्रभावित करती हैमॉडल के प्ररूपी परिणाम। अत्यधिक वेक्टर titers या अपर्याप्त शुद्ध वेक्टर बैचों गैर विशिष्ट विषाक्तता में परिणाम हो सकता है। इसलिए, उचित नियंत्रण वैक्टर अपरिहार्य हैं। काफी समय वायरल वेक्टर उत्पादन, बढ़ाने, और शुद्धि प्रक्रियाओं में निवेश भी प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और उच्च गुणवत्ता वेक्टर बैचों प्राप्त करने के लिए आवश्यक साबित किया है।

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Protocol

सभी पशु प्रयोगों लोवेन विश्वविद्यालय के जैवनैतिक समिति (बेल्जियम) द्वारा 24 नवम्बर 1986 (86/609 / EEC) के यूरोपीय समुदाय परिषद निर्देशक के अनुसार बाहर किया जाता है और मंजूरी दे दी।

1. संयोजक एएवी उत्पादन और शोधन

नोट: rAAV वेक्टर उत्पादन और शोधन के रूप में पहले 17 में वर्णित लोवेन वायरल वेक्टर कोर (LVVC) द्वारा किया गया था।

  1. संक्षेप में, transfect subconfluent कम (<50) पारित होने के पक्षपाती HEK 293T एक 25kD रेखीय पॉलीएथिलएमीन 150 एनएम NaCl अभिकर्मक समाधान और 1 के अनुपात में तीन अलग-अलग plasmids का उपयोग कोशिकाओं: DMEM मध्यम 2% भ्रूण गोजातीय सीरम में 1: 1। एक 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन के 24 घंटे के बाद, ताजा DMEM मध्यम 2% भ्रूण गोजातीय सीरम के साथ मध्यम जगह।
    नोट: plasmids AAV7 सीरोटाइप के लिए निर्माणों में शामिल हैं, एएवी हस्तांतरण प्लाज्मिड CMVie के नियंत्रण में α-SYN मानव A53T उत्परिवर्ती एन्कोडिंग बढ़ाया synapsin1 प्रमोटर और pAdvDeltaF6 adenoviral सहायक प्लाज्मिड 17।
  2. क्षणिक अभिकर्मक के बाद मध्यम 5 दिनों फसल और स्पर्शरेखा प्रवाह निस्पंदन 17 का उपयोग ध्यान केंद्रित।
  3. केंद्रित मध्यम से rAAV वेक्टर कण एक iodixanol कदम ढाल 17 उपयोग कर शुद्ध।
  4. जीनोमिक प्रतिलिपि (जीसी) निर्धारण के लिए वास्तविक समय पीसीआर के मानक तकनीक का प्रयोग करें। इस प्रोटोकॉल, 3.0 E11 जीसी का एक वेक्टर अनुमापांक में / एमएल पीडी 17 के लिए एक α-SYN आधारित चूहे मॉडल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था।

2. rAAV α-SYN के stereotactic इंजेक्शन चूहा के एसएन में वेक्टर (चित्रा 2)

  1. हाउस आठ सप्ताह पुराने महिला Wistar चूहों pelleted भोजन और पानी के नल के लिए स्वतंत्र पहुँच के साथ एक सामान्य 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र के तहत 200-250 ग्राम वजन के बारे में।
  2. intraperitoneal को चूहे जमा करें (आईपी) एक (60 मिलीग्राम / किग्रा) ketamine के मिश्रण और medetomidine (0.4 / किलो मिलीग्राम) युक्त संज्ञाहरण। एक बार जब चूहे anesthetized है और प्रतिक्रिया नहीं करताजब विभिन्न पंजे फैलाएंगे, एक माइक्रो ट्रांसपोंडर implanter का उपयोग कर आगे की मान्यता के लिए चूहे की पीठ पर एक माइक्रो ट्रांसपोंडर subcutaneously प्रशासन। यदि सूक्ष्म ट्रांसपोंडर सही ढंग से तैनात है और पठन डिवाइस से बाहर पढ़ा जा सकता है की जाँच करें।
  3. खोपड़ी के शीर्ष पर बाल कट। दोनों खोपड़ी और कान पर एक स्थानीय संवेदनाहारी लागू करें। सड़न रोकनेवाला तकनीक का उपयोग कर एक लामिना का प्रवाह के तहत शल्य प्रक्रिया के बाकी प्रदर्शन करना।
  4. दो कान सलाखों, एक मुंह और नाक एक बार का उपयोग कर एक स्टीरियोटैक्टिक सिर फ्रेम में चूहों रखें। एक कागज कंबल के साथ चूहे के शरीर को कवर शरीर के तापमान में एक बूंद से बचने के लिए। सुखाने से आंखों को रोकने के लिए एक आंख का स्नेहक लागू करें।
  5. isopropanol में 70% jodium 1% के साथ खोपड़ी कीटाणुरहित और खोपड़ी के midline में एक छोटा सा चीरा बनाते हैं। धीरे खोपड़ी पर झिल्ली दूर परिमार्जन और नमक के साथ कुल्ला। कई मिनट के लिए खोपड़ी सूखी। शीर्षस्थान और लैम्ब्डा: कपाल टांके और दो संदर्भ अंक का निरीक्षण करें। एसएन में rAAV वेक्टर इंजेक्षन करने के लिए, शीर्षस्थान की ओर निर्देशांक परिभाषित (अग्रपश्च 5.3 मिमी, mediolateral: 2.0 मिमी और dorsoventral 7.2 मिमी गणना की ड्यूरा से)।
    नोट: ब्याज की प्रत्येक क्षेत्र के लिए तीन आयामी निर्देशांक संरचनात्मक संदर्भ बिंदु के रूप में लागू करने के शीर्षस्थान चूहे के मस्तिष्क के एक stereotaxic एटलस उपयोग कर की गणना की जा सकती है।
  6. rAAV वेक्टर के साथ एक 10 μl microinjection सिरिंज (30 गेज 20 मिमी) भरें और एक मोटर चालित microinjection पंप के साथ जुड़ा हुआ stereotaxic साधन में जगह है। वेक्टर की एक बूंद को रिहा द्वारा मात्रा पर नियंत्रण और एक polyvalent सफाई डिटर्जेंट पीएच 9 (जैसे आरबीएस) में समाप्त।
  7. नेत्रहीन जाँच अगर सिर सीधे सिर फ्रेम में तय हो गई है और बाएँ सही अक्ष का मूल्यांकन। ध्यान से नेत्रहीन शीर्षस्थान और लैम्ब्डा के लिए अग्रपश्च और mediolateral निर्देशांक को परिभाषित करने और स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम के dorsoventral हाथ में एक 30 गेज 20 मिमी सुई का उपयोग अपनी ऊंचाई मापने।
    1. AM अनुमति दें0.3 मिमी शीर्षस्थान और लैम्ब्डा के बीच ऊंचाई में अंतर का aximum। सुई शीर्षस्थान पर वापस प्लेस और अग्रपश्च और स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम के mediolateral हाथ ले जाकर अग्रपश्च और mediolateral निर्देशांक लागू होते हैं।
  8. इंजेक्शन की जगह पर, खोपड़ी की ऊंचाई मापने के लिए और सुनिश्चित करें कि यह शीर्षस्थान की ऊंचाई से अधिक से अधिक 0.3 मिमी अलग नहीं है। लगभग 2 मिमी की एक व्यास के साथ खोपड़ी में एक छेद ड्रिल। ड्यूरा की ऊंचाई मापने, इस dorsoventral समन्वय स्थापित लागू करने के लिए एक संदर्भ के रूप में काम करेगा। वैकल्पिक रूप से खोपड़ी (0.9 मिमी) के लिए एक निश्चित मोटाई घटाना।
  9. एक 26 गेज सुई का उपयोग ड्यूरा घुसना और एक बाँझ ऊतक के साथ रक्त को अवशोषित। रुको जब तक सभी खून बह रहा है आगे बढ़ने से पहले बंद कर दिया है।
  10. धीरे-धीरे 10 μl microinjection सिरिंज पूर्व निर्धारित गहराई तक मस्तिष्क में वेक्टर समाधान के साथ पहले से लोड डालने (dorsoventral समन्वय)। जगह में सुई के साथ 1 मिनट रुको। 3 μl इंजेक्षन(RAAV2 / 7 α-SYN या EGFP नियंत्रण वेक्टर के 3.0 E11 जीनोम प्रतियां / एमएल (मध्यम वेक्टर खुराक) या 1.0 E12 जीसी / एमएल (उच्च वेक्टर खुराक)) वेक्टर समाधान 0.25 μl की एक throughput के साथ मोटर चालित microinjection पंप का उपयोग कर के / मि।
  11. इंजेक्शन के बाद, धीरे धीरे इसे हटाने से पहले एक और 5 मिनट के लिए जगह में सुई रखने के लिए। खोपड़ी लेपित पॉलिएस्टर लट 3.0 का उपयोग सिलाई, 70% isopropanol में 1% jodium साथ कीटाणुरहित और धीरे स्टीरियोटैक्टिक साधन से पशु हटा दें। सबसे पहले नाक और मुंह बार, फिर दो कान सलाखों ढीला।
  12. संज्ञाहरण उलटने के लिए, 0.5 मिलीग्राम / किग्रा atipamezole साथ intraperitoneally चूहा इंजेक्षन और 38 डिग्री सेल्सियस के एक गर्म थाली पर एक साफ पिंजरे में चूहे जगह जब तक यह उठता है। शरीर के तापमान में एक बूंद को रोकने के लिए एक कागज कंबल के साथ चूहे को कवर किया।
  13. पहले घंटे के लिए भोजन और पानी के लिए आसान पहुँच प्रदान करें। पहले कुछ दिनों के लिए चूहे की निगरानी। यदि आवश्यक हो पीड़ानाश लागू होते हैं।
    नोट: टी से टांके दूर करने के लिए कोई जरूरत नहीं हैवह खोपड़ी। 1-2 सप्ताह के बाद खोपड़ी पूरी तरह से मरम्मत की है और stiches ढीला आते हैं।

3. rAAV2 का आकलन / 7 α-SYN इंजेक्शन चूहे गैर इनवेसिव पीईटी इमेजिंग, व्यवहार परीक्षण और विश्लेषण का उपयोग Immunohistochemical

  1. गैर invasively व्यक्ति पशुओं में समय के साथ nigrostriatal डोपामिनर्जिक neurodegeneration के कैनेटीक्स ऊपर का पालन करने के लिए, डोपामाइन ट्रांसपोर्टर यों (डीएटी) छोटे जानवर पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) और डीए ट्रांसपोर्टर जैसे की एक दरियाफ्त का उपयोग कर बाध्यकारी [18 एफ] -FECT 16 ।
  2. जांच करने के लिए है कि क्या डोपामिनर्जिक neurodegeneration के स्तर पर, चूहों में मोटर impairments के लिए प्रेरित सहज forelimb उपयोग का मूल्यांकन करने के लिए सिलेंडर परीक्षण के लिए चूहों के अधीन करने के लिए पर्याप्त है।
    1. एक 20 सेमी चौड़ा स्पष्ट गिलास सिलेंडर और वीडियो टेप व्यवहार दीवार और लैंडिंग एक रियर के बाद साथ खड़ी आंदोलनों के दौरान में चूहे रखें। 20 के कुल स्कोर के लिए प्रत्येक forepaw द्वारा किए गए संपर्कों की संख्यासंपर्कों। स्कोरिंग मानदंड का विस्तृत विवरण के लिए देखें Schallert एट अल। 18 बिगड़ा forelimb संपर्कों (जैसे बाएं forepaw) कुल forelimb संपर्कों का एक प्रतिशत (बाएं प्लस सही forepaw) के रूप में की संख्या व्यक्त करें।
      नोट: गैर-lesioned नियंत्रण समान रूप से दोनों पंजे का उपयोग कर चूहों इस परीक्षा में लगभग 50% स्कोर करना चाहिए।
  3. प्रतिरक्षाऊतकरसायन (आईएचसी) विश्लेषण transgene अभिव्यक्ति और डोपामिनर्जिक सेल नुकसान के स्तर का आकलन करने के लिए प्रदर्शन करना।
    1. अलग अंत चरणों में, सोडियम pentobarbital (60 मिलीग्राम / किग्रा, आईपी) की अधिक मात्रा के साथ चूहों बलिदान और ठंड पीबीएस 19 में 4% paraformaldehyde के द्वारा पीछा नमक के साथ एक intracardial छिड़काव करते हैं। 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर दिमाग fixate और एक हिल microtome का उपयोग कर 50 माइक्रोन मोटी राज्याभिषेक मस्तिष्क वर्गों में कटौती।
    2. पर मुक्त अस्थायी वर्गों α-SYN और tyrosine hydroxylase खिलाफ एंटीबॉडी का उपयोग α-SYN अभिव्यक्ति के स्तर और ले विश्लेषण करने के लिए आईएचसी धुंधला प्रदर्शन करनाneurodegeneration 16 के वेल।

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Representative Results

प्रयोग की समग्र योजना चित्र 1 में दिखाया गया है

A53T α-SYN की rAAV 07/02 की मध्यस्थता overexpression डोपामाइन निर्भर मोटर घाटे लाती है।
चाहे वह α-SYN overexpression के स्तर चूहों में मोटर impairments के लिए प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है की जांच करने के लिए, हम सहज forelimb उपयोग (चित्रा 3 ए) का मूल्यांकन करने के सिलेंडर का परीक्षण करने के लिए चूहों अधीन है। 3 सप्ताह से इंजेक्शन के बाद, एक महत्वपूर्ण मोटर हानि चूहों कि एक खुराक 3.0 E11 जीसी / A53T α-SYN rAAV2 / 7 वेक्टर मिलीलीटर प्राप्त में देखा गया था। इंजेक्शन के बाद 4 सप्ताह में सहज contralateral (बाएं) forepaw उपयोग में 50% की कमी मनाया गया था, नियंत्रण इंजेक्शन EGFP rAAV2 / 7 जानवरों जबकि forepaw उपयोग (चित्रा 3 बी) में कोई विषमता दिखाया। चूहों कि एक उच्च A53T α-SYN rAAV2 / 7 वेक्टर खुराक प्राप्त एक और अधिक स्पष्ट impairm दिखाया29 दिनों में forepaw उपयोग (70%) के ईएनटी इंजेक्शन (चित्रा 3 सी) के बाद। साबित करने के लिए कि मनाया मोटर हानि डोपामाइन पर निर्भर था, हम चूहों एक उच्च वेक्टर खुराक के साथ इंजेक्शन के लिए एल-रासायनिक पदार्थ (6 मिलीग्राम / किग्रा आईपी) की एक खुराक दिलाई। जब हम एल Dopa उपचार, A53T में forepaw उपयोग की एक पूरी वसूली α-SYN इंजेक्शन rAAV2 / 7 जानवरों मनाया गया (चित्रा 3 सी) के बाद सिलेंडर परीक्षण 45 मिनट दोहराया।

पीईटी इमेजिंग α-SYN प्रेरित प्रगतिशील neurodegeneration के गैर इनवेसिव इमेजिंग की अनुमति देता है।
गैर invasively व्यक्ति पशुओं में समय के साथ nigrostriatal डोपामिनर्जिक neurodegeneration के कैनेटीक्स ऊपर का पालन करने के लिए, हम डोपामाइन ट्रांसपोर्टर (डीएटी) के साथ [18 एफ] के रूप में radioligand -FECT छोटे जानवर पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) का उपयोग बाध्यकारी मात्रा। डैट काफी बंधन A53T के ipsilateral पूंछवाला-putamen में कमी आई α-SYN rAAV2 / 7 injecसमय के साथ टेड चूहों लेकिन EGFP नियंत्रण जानवर में स्थिर बने रहे (चित्रा -4 ए - 4 बी)। डैट A53T α-SYN इंजेक्शन rAAV2 / 7 जानवरों के बंधन की मात्रा इंजेक्शन के बाद दिन 7 और 21 के बीच nigrostriatal डोपामिनर्जिक अध: पतन का एक अधिक से अधिक दर से पता चला है। 32 दिनों के बाद, डैट में कमी अप करने के लिए 85% के बंधन (चित्रा 4C) मनाया गया। एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, न्यूरोटॉक्सिन एसएन में 6 OHDA के इंजेक्शन 7 दिन (- 4C चित्रा 4 बी) के भीतर बाध्यकारी डैट के 90% के नुकसान प्रेरित किया।

चूहे के एसएन में rAAV2 / 7 A53T α-SYN के stereotactic इंजेक्शन nigral डोपामिनर्जिक कोशिका मृत्यु और अघुलनशील α-SYN सकारात्मक समुच्चय के गठन लाती है।
α-SYN overexpression और डोपामिनर्जिक सेल नुकसान के स्तर का विश्लेषण करने के लिए हम अलग अलग समय बिंदुओं पर जानवरों के बलिदान कर दिया। आईएचसी पर मुक्त अस्थायी वर्गों एक एंटीबॉडी एजी उपयोग किया गया थाainst α-synuclein (खरगोश पॉलीक्लोनल 1: 5000)। इस एंटीबॉडी का पता लगा सकते दोनों मानव और चूहे α-synuclein, लेकिन चूहे α-synuclein की अंतर्जात स्तर nigral सेल somata के भीतर का पता लगाने सीमा से नीचे थे, synaptic झिल्ली में अपनी प्रमुख स्थानीयकरण के कारण। गधे सेल घटाने के लिए हम वीं के खिलाफ एक एंटीबॉडी (: 1,000 खरगोश पॉलीक्लोनल 1) का इस्तेमाल किया।

चूहों के - चार दिनों rAAV वेक्टर इंजेक्शन के बाद, α-SYN या EGFP अभिव्यक्ति एसएन (5C चित्रा 5 ए) में पाया गया था। डी.एन. के बहुमत (> 90%) कुशलतापूर्वक transduced किया गया था और दोनों ट्रांसजेनिक प्रोटीन कोशिका निकायों और एक्सोन में अनुवादित किया गया। 29 दिनों के बाद में इंजेक्शन (पीआई) α-SYN अभिव्यक्ति में पर्याप्त कमी SNpc में मनाया गया, जबकि यह अभी भी एसएन (चित्रा 5 ब - 5C) के आसपास के क्षेत्रों में detectable था। अगला, हम nigral सेल नुकसान के स्तर का विश्लेषण किया। एक तेजी से और प्रगतिशील हानि ओवें पॉजिटिव न्यूरॉन्स की एफ ऊपर से 80% के साथ इंजेक्शन चूहों में 29 दिनों से अधिक का पता चला था A53T α-SYN rAAV2 / 7 (चित्रा 5 डी - 5H)। ध्यान से, जंगली प्रकार के बजाय A53T α-SYN समान डोपामिनर्जिक neurodegeneration के परिणामस्वरूप की overexpression (डेटा) नहीं दिखाया। एसएन में डी.एन. के नुकसान स्ट्रिएटम (एसटीआर) (चित्रा 5F) में वें पॉजिटिव तंत्रिका टर्मिनलों के एक मजबूत कमी से समानांतर था। विशिष्ट वेक्टर बैच प्रभाव शासन से बाहर करने के लिए, अलग-α SYN वेक्टर तैयारियों इसी तरह के परिणाम के साथ एसएन में परीक्षण किया गया। वें धुंधला में कोई कमी नहीं एसएन में मनाया गया था या EGFP rAAV2 / 7 के एसटीआर इंजेक्शन नियंत्रण जानवरों (चित्रा 5E-5H)। डोपामिनर्जिक neurodegeneration के आगे, α-synucleinopathy की उपस्थिति पीडी का एक दूसरा महत्वपूर्ण बानगी है। हमारे मॉडल (चार सप्ताह) के कम समय के पाठ्यक्रम के बावजूद, हम एसटीआर (चित्रा 5I में एसएन में दोनों α-SYN पॉजिटिव cytoplasmic समुच्चय और dystrophic neurites मनाया ओंग>)। Ubiquitin immunoreactivity मानव मस्तिष्क में 20-22 Lewy शरीर विकृति की एक अलग विशेषता है। हम α-SYN nigral न्यूरॉन्स व्यक्त (चित्रा 5J) का एक अंश (± 20%) में 29 दिनों में गड़बड़ी α-SYN के सह स्थानीयकरण और यूबीक्यूटिन मनाया। Α-SYN समुच्चय के तंतुमय प्रकृति Thioflavin एस (Thio एस) 23 धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया गया था। Thio सकारात्मक कोशिकाओं 17 दिनों के बाद (चित्रा 5J) से एसएन में पाया गया।

आकृति 1
चित्रा 1:। प्रगतिशील neurodegeneration में rAAV2 / 7 α-SYN वेक्टर परिणामों के stereotactic इंजेक्शन चूहे के एसएन में rAAV2 / 7 α-SYN वेक्टर के stereotactic इंजेक्शन डोपामिनर्जिक neurodegeneration व्यवहार विश्लेषण (सिलेंडर परीक्षण), गैर इनवेसिव पीईटी के माध्यम से मापा लाती इमेजिंग और आईएचसी विश्लेषण।डी / 53,670 / 53670fig1large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2: चूहे के एसएन में rAAV2 / 7 वेक्टर एन्कोडिंग α-SYN के stereotactic इंजेक्शन। (ए, बी, ई) चूहा खोपड़ी पर कपाल टांके, दो संदर्भ बिंदु को परिभाषित: शीर्षस्थान और लैम्ब्डा। (सी) एक चूहे के मस्तिष्क अर्थात् एसएन इंजेक्शन के क्षेत्र पेश करने की stereotaxic एटलस। (डी) एक Wistar चूहे दो कान सलाखों, एक मुंह और नाक एक बार का उपयोग कर एक स्टीरियोटैक्टिक सिर फ्रेम में तैनात हैं। (एफ) 30 गेज वेक्टर के साथ भरा सुई द्रव्य नाइग्रा के लिए स्थिति में रखा गया है। (छ) एक छोटे से पूरे इंजेक्शन के स्थल पर drilled है और सुई की स्थिति में रखा गया है। (एच) इंजेक्शन के बाद खोपड़ी एसटीआई हैtched और कीटाणुरहित। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: rAAV A53T के 2/7-मध्यस्थता overexpression α-SYN डोपामाइन निर्भर मोटर घाटे लाती है (ए, बी) सिलेंडर rAAV2 / 7 A53T α-SYN के इंजेक्शन के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर परीक्षण।। (एसडी मतलब ± * पी <0.05 बनाम 17 दिन, # पी <एनोवा और Tukey पोस्ट अस्थायी परीक्षण से 0.05 EGFP नियंत्रण, एन = 5)। (सी) सिलेंडर rAAV2 / 7 A53T α-SYN (उच्च वेक्टर खुराक) के इंजेक्शन के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर परीक्षण। (मतलब ± एसडी, * पी <0.05 4 दिनों 29 बनाम एनोवा और Tukey द्वारा दिन पोस्ट अस्थायी परीक्षण, एन = 5)। परीक्षण के साथ या Levodopa (एल रासायनिक पदार्थ) के प्रशासन के बिना किया गया था। (एसडी मतलब ± * <पी 0।05 एनोवा और Tukey पोस्ट अस्थायी परीक्षण द्वारा इलाज जानवरों बनाम गैर इलाज, एन = 5)। उम्र बढ़ने के तंत्रिका जीव विज्ञान, खंड से पुनर्प्रकाशित। 36, वान डेर Perren एट अल।, एडिनो से जुड़े वायरल वैक्टर, 1,543-1,558, (2015), Elsevier से अनुमति के साथ साथ अल्फा synuclein की overexpression के आधार पर पार्किंसंस रोग के लिए अनुदैर्ध्य अनुवर्ती और एक मजबूत चूहे मॉडल की विशेषता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। A53T के गैर इनवेसिव इमेजिंग α-SYN प्रेरित डोपामिनर्जिक कोशिका मृत्यु डैट पीईटी इमेजिंग (ए - बी) का उपयोग चित्रण मतलब striatal डैट के बंधन क्षैतिज और राज्याभिषेक स्लाइस की श्रृंखला (ए) rAAV2 / 7 A53T α-SYN इंजेक्शन पशुओं एडवेंचर्स परटी समय अंक इंजेक्शन (एन = 7) और (बी) के बाद rAAV2 / 7 EGFP इंजेक्शन (एन = 1) या 6 OHDA नियंत्रण जानवरों का इलाज किया (एन = 1) 79 दिनों के इंजेक्शन के बाद। रंग सलाखों डैट के लिए बाध्यकारी क्षमता का संकेत मिलता है। (सी) डैट की मात्रा rAAV2 / 7 A53T के बंधन α-syn, rAAV2 / 7 EGFP और 6 OHDA इंजेक्शन अलग अलग समय बिंदुओं पर मापा जानवरों (डेटा एसडी ± मतलब प्रतिनिधित्व करते हैं)। उम्र बढ़ने के तंत्रिका जीव विज्ञान, खंड से पुनर्प्रकाशित। 36, वान डेर Perren एट अल।, एडिनो से जुड़े वायरल वैक्टर, 1,543-1,558, (2015), Elsevier से अनुमति के साथ साथ अल्फा synuclein की overexpression के आधार पर पार्किंसंस रोग के लिए अनुदैर्ध्य अनुवर्ती और एक मजबूत चूहे मॉडल की विशेषता। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: rAAV 07/02 की मध्यस्थता A53T की overexpression α-SYN डोपामिनर्जिक कोशिका मृत्यु और अघुलनशील α-SYN सकारात्मक समुच्चय के गठन लाती है। (ए - बी) आईएचसी धुंधला का प्रदर्शन α-SYN overexpression 4 दिन और 29 दिनों में rAAV मध्यस्थता हस्तांतरण के बाद चूहे एस.एन.। इंसर्ट के चयनित क्षेत्र के आवर्धन दिखा। स्केल बार = 400 माइक्रोन (अवलोकन के चित्र बाएं), 70 माइक्रोन और 200 माइक्रोन (सम्मिलित दाएं)। (सी) आईएचसी धुंधला EGFP overexpression का प्रदर्शन 4 दिन और चूहे एसएन में rAAV मध्यस्थता हस्तांतरण के बाद 29 दिनों के लिए। स्केल बार = 400 माइक्रोन। (डी - जी) आईएचसी एसएन में (ई, जी) rAAV2 / 7 EGFP के इंजेक्शन के बाद (डी, एफ) rAAV2 / 7 α-SYN या 29 दिनों के इंजेक्शन के बाद अलग अलग समय बिंदुओं पर एस.एन. और एसटीआर में वीं के लिए धुंधला । स्केल पट्टी ए, सी = 400 माइक्रोन, बी, डी = 1,000 माइक्रोन। (एच) सुन्न की मात्रा का ठहराव stereologicalसमय के साथ एसएन वें पॉजिटिव न्यूरॉन्स की एर rAAV2 / 7 A53T α-SYN इंजेक्शन या rAAV2 / 7 EGFP नियंत्रण वेक्टर (मतलब ± एसडी के बाद, * पी <0.05 बनाम 8 दिन, # पी <0.05 बनाम एनोवा द्वारा EGFP नियंत्रण और Tukey पोस्ट अस्थायी परीक्षण, एन = 5)। (मैं) आईएचसी धुंधला α-SYN विकृति का प्रदर्शन, एसटीआर में एसएन में cytoplasmic समुच्चय और dystrophic और उभड़ा neurites सहित intranigral के बाद rAAV2 / 7 A53T α-SYN इंजेक्शन। (जे) α-SYN (हरा) और यूबीक्यूटिन (लाल) के लिए फ्लोरोसेंट डबल immunostainings के प्रतिनिधि confocal छवियों से अधिक समय (तीर) सह स्थानीयकरण में वृद्धि दिखा। स्केल पट्टी सी = 50 माइक्रोन। एसएन के Thioflavin एस धुंधला 29 दिनों rAAV2 / 7 A53T α-SYN के इंजेक्शन के बाद। स्केल पट्टी डी = 30 माइक्रोन। उम्र बढ़ने के तंत्रिका जीव विज्ञान, खंड से पुनर्प्रकाशित। 36, वान डेर Perren एट अल।, पार्किंसंस रोग के लिए अनुदैर्ध्य अनुवर्ती और एक मजबूत चूहे मॉडल के लक्षण वर्णन के विज्ञापन के साथ अल्फा synuclein की overexpression पर आधारितElsevier से वायरल वैक्टर, 1543-1558, (2015), अनुमति के साथ इनो जुड़े। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर कई महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं। वेक्टर अनुमापांक के साथ ही वेक्टर पवित्रता सीधे मॉडल की प्ररूपी परिणाम को प्रभावित करती है। अत्यधिक वेक्टर titers या अपर्याप्त शुद्ध वेक्टर बैचों गैर विशिष्ट विषाक्तता में परिणाम हो सकता है। इसलिए, उच्च गुणवत्ता वेक्टर बैचों और उचित नियंत्रण वैक्टर का उपयोग अपरिहार्य है। इसके अलावा, stereotaxic फ्रेम में चूहे के सिर की सही स्थिति और निर्देशांक का सही निर्धारण द्रव्य नाइग्रा को निशाना बनाने में आवश्यक है। इंजेक्शन के स्थल पर खोपड़ी में छेद ड्रिलिंग के बाद, यह किसी भी मार्जिन को छूने के बिना सीधे चूहे के मस्तिष्क में सुई डालने के लिए महत्वपूर्ण है। सुई धीरे-धीरे वेक्टर रिसाव को रोकने के वायरल वेक्टर इंजेक्शन लगाने के बाद हटा दिया जाना चाहिए। अन्त में, सिलाई के बाद, खोपड़ी 70% isopropanol में 1% jodium के साथ अन्य जानवरों द्वारा stiches के काटने से बचने के लिए कीटाणुरहित किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से अन्य एंटीसेप्टिक अभिकर्मकोंइस्तेमाल किया जा सकता है।

विधि वर्णित भी पार्किंसंस रोग 24 के लिए एक rAAV2 / 7 α-SYN आधारित चूहों मॉडल विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चूहों में हम एसएन में 2 μl rAAV वेक्टर के एक मात्रा इंजेक्षन। चूहों की तुलना में, चूहों डी.एन. कुछ हद तक कम करने के लिए α-SYN overexpression, neurodegeneration की देरी अभिव्यक्ति है, जिसके परिणामस्वरूप संवेदनशील होने लगते हैं। इसके अलावा, मस्तिष्क में अन्य क्षेत्रों (जैसे स्ट्रिएटम, हिप्पोकैम्पस, कोर्टेक्स, आदि) को निशाना बनाया जा सकता है। अलग मस्तिष्क क्षेत्रों के लिए निर्देशांक stereotaxic एटलस में पाया जा सकता है। निर्देशांक के अनुकूलन चीनी स्याही से या (जैसे EGFP) एक वायरल वेक्टर एक पत्रकार जीन एन्कोडिंग का उपयोग करके किया जा सकता है। विभिन्न वैक्टर सिस्टम (rAAV, एल.वी., आदि) के आवेदन के आधार पर किया जा सकता है।

इस तकनीक को सीमा प्रत्येक जानवर को व्यक्तिगत रूप से इंजेक्शन हो गया है कि है। इसलिए एक प्रशिक्षित व्यक्ति के क्रम में न्यूनतम करने के लिए इंजेक्शन प्रदर्शन करना चाहिएविभिन्न जानवरों के बीच imize विविधताओं। एक और सीमा विधि काफ़ी समय (जब एक प्रशिक्षित व्यक्ति द्वारा निष्पादित यह जानवर प्रति लगभग 45 मिनट लगते हैं) है। केवल आठ से दस पशुओं को एक ही दिन में इंजेक्ट किया जा सकता है।

वायरल वेक्टर की मध्यस्थता जीन डिलीवरी मस्तिष्क क्षेत्रों के विशिष्ट लक्ष्यीकरण के लिए अनुमति देता है। वायरल वैक्टर का उपयोग, उच्च transgene अभिव्यक्ति के स्तर प्राप्त किया जा सकता है, जो महत्वपूर्ण है, क्योंकि बीमारी शुरुआत और गंभीरता α-SYN अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर करता है। इसके अलावा, विभिन्न खुराक जो neurodegeneration की धीमी या तेज कैनेटीक्स दिखाने में कोई पशु मॉडल में परिणाम होगा लागू किया जा सकता है। अन्त में, इस तकनीक को विभिन्न जानवरों की प्रजातियों और दबाव से ही वेक्टर तैयारी का उपयोग करने में मॉडल बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

यह प्रक्रिया वायरल वैक्टर के रूप में अच्छी तरह से विषाक्त पदार्थों को वितरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (उदाहरण के 6 OHDA) brain.The transgene वेक्टर द्वारा इनकोडिंग के विभिन्न क्षेत्रों में एक संवाददाता प्रोटीन, एक चिकित्सकीय पी हो सकती हैजीन थेरेपी अनुप्रयोगों 8-10 या एक रोग से संबंधित प्रोटीन रोग मॉडलिंग 11-14 के लिए इस्तेमाल के लिए rotein। इस तकनीक उपन्यास पशु मॉडल जो preclinical दवा परीक्षण के लिए अनुमति विकसित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और पार्किंसंस रोग के साथ ही कई अन्य neurodegenerative विकारों के आणविक तंत्र का अध्ययन करने में फायदेमंद हो सकता है।

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Disclosures

लेखकों की घोषणा ब्याज की कोई वास्तविक या संभावित संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

लेखकों को उनके उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए जोरिस वान Asselberghs और एन वान Santvoort धन्यवाद। अनुसंधान, आईडब्ल्यूटी-व्लांडरन (आईडब्ल्यूटी SBO / 80020), FWO व्लांडरन (G.0768.10) द्वारा वित्त पोषित किया गया चुनाव आयोग FP6 कार्यक्रम 'dimi' (LSHB सीटी-2005-512146), FP7 सेवानिवृत्त परियोजना MEFOPA (स्वास्थ्य -2,009-241,791), FP7 कार्यक्रम 'INMiND' (स्वास्थ्य F2-2011-278850), यू लोवेन (IOF-केपी / 07/001, ओटी / 08 / 052A, IMIR पीएफ / 10/017), और MJFox फाउंडेशन (लक्ष्य सत्यापन 2010)। ए वान डेर Perren और सी Casteels वैज्ञानिक अनुसंधान के फ्लेमिश कोष के एक postdoctoral साथियों हैं। लालकृष्ण वान लाएरे वैज्ञानिक अनुसंधान के फ्लेमिश फंड के एक वरिष्ठ नैदानिक ​​साथी है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Female 8 weeks old Wistar rats Janvier / 200-250 g
Ketamine (Nimatek) Eurovet animal health 804132
Medetomidine (Dormitor) Orion-Pharma/ Janssen Animal Health 1070-499
 Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel Astrazeneca 0137-547
Terramycine Pfizer 0132-472
Buprénorphine (Vetergesic) Ecuphar 2623-627
Jodium 1% isopropanol VWR 0484-0100
stereotactic head frame Stoeling /
Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2) Hamilton/ Filter Service 7803-07
atipamezole (Antisedan) Orion-Pharma/Elanco 1300-185
rAAV A53T α-SYN vector LVVC, KU Leuven / https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/
sodium pentobarbital (Nembutal) Ceva Santé 0059-444
microtome Microm HM650
rabbit polyclonal synuclein Ab Chemicon 5038 1:5,000
rabbit polyclonal TH Ab Chemicon 152 1:1,000
Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph Siemens/ Concorde Microsystems /
radioligand: 18F-FECT In house /
L-dopa: Prolopa 125 Roche 6 mg/kg i.p.
DMEM, Glutamax Life Technologies N° 31331-093
Foetal bovine serum Life Technologies N° 10270-106
25 kD linear polyethylenimine (PEI) Polysciences /
OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol Sigma D1556-250ML
Optimen Life Technologies N° 51985-026
Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition Elsevier /

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References

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चिकित्सा अंक 108 rAAV वैक्टर पशु मॉडल पार्किंसंस रोग अल्फा synuclein स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्शन मस्तिष्क पारगमन
एक संयोजक एडिनो जुड़े वायरल वेक्टर के stereotactic इंजेक्शन के माध्यम से पार्किंसंस रोग के लिए एक अल्फा-synuclein आधारित चूहे मॉडल का विकास
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Van der Perren, A., Casteels, C., Van Laere, K., Gijsbers, R., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Development of an Alpha-synuclein Based Rat Model for Parkinson's Disease via Stereotactic Injection of a Recombinant Adeno-associated Viral Vector. J. Vis. Exp. (108), e53670, doi:10.3791/53670 (2016).

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