Abstract
Parkinson hastalığı (PH) moleküler yollar incelemek ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi amacıyla, bilimsel araştırmacılar hayvan modellerinde güveniyor. PD-ilişkili genlerin belirlenmesi, genetik PD modelini geliştirilmesine yol açmıştır. En transgenik α-SYN fare modelleri kademeli α-SYN patolojiyi geliştirmek ama net dopaminerjik hücre kaybı ve dopamin-bağımlı davranış açıkları görüntülemek için başarısız. Bu engel PD-ilişkili genleri fazla sentezleyen viral vektörlerin ile substantia nigra doğrudan hedefleme ile üstesinden oldu. viral vektörler kullanılarak yerli gen dağıtım merkezi sinir sisteminde transgenleri ifade için çekici bir yol sağlar. Spesifik beyin bölgelerinde (örneğin, substantia nigra) hedeflenebilir, sentezleme yetişkin ortamda indüklenebilir ve yüksek ekspresyon seviyeleri elde edilebilir. Bundan başka, çeşitli virüsler ile ilgili olarak farklı vektör sistemleri kullanılabilir. protokol bir viral vektör gerçekleştirmek için bütün önemli adımlar özetlenirSıçan substantia nigra enjeksiyon Parkinson hastalığı için bir viral vektör bazlı alfa-sinüklein hayvan modeli geliştirmek için.
Introduction
PD patofizyolojisini incelemek ve yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi amacıyla, yakından insan PH nöropatoloji, fizyoloji ve motor semptomları benzer hayvan modellerinde için acil bir ihtiyaç vardır. yüksek öngörü değeri, daha iyi biz hastalara hayvan modellerinde yeni tedaviler çevirebilir.
1997 yılında ilk PARK geninde gibi alfa-sinüklein keşfi (α-sin) ilk genetik PD modelini gelişmesine yol açmıştır. İnsan doğal tip (WT) veya mutant (A30P, A53T) aşırı ifade eden transjenik farelerin, bir çok α-EŞZ son on yıl içinde oluşturulmuştur. α-EŞZ aşırı ifadesinin düzeyleri patoloji gelişiminde çok önemli olduğu kanıtlanmıştır. Ayrıca fare suşu, endojen α-sin ve tam uzunlukta veya kesik bir şekilde ifade edilip varlığı veya yokluğu, (Magen ve Chesselet 1 ile ayrıntılı bir inceleme) rol oynar. WT ve insan çeşitli klinik mutantlar hem aşırı ekspresyonu &# 945; transgenik farelerin -SYN α-SYN patolojik birikimi ve nöronal disfonksiyon 2-6 uyarır. Ancak, şimdi en transgenik α-SYN fare modelleri berrak dopaminerjik hücre kaybı ve dopamin-bağımlı davranış açıkları görüntülemek için başarısız kadar.
Bu engel α-SYN fazla sentezleyen viral vektörlerle substantia nigra (SN) doğrudan hedefleme ile üstesinden oldu. Viral vektörler kolayca hücreleri enfekte ev sahibi genoma genetik malzemeyi vermek ve yeni virüs parçacıklarının üretilmesi amacıyla viral genomu çoğaltmak için konakçı hücrenin zorlayabilir virüslerden türetilir. Virüsler hücrelerine girip genlerin katılmasıdır yeteneklerini muhafaza replike olmayan viral vektörler için tasarlanmış olabilir. Viral genomun parçalarını silme ve ilgi genleri tarafından değiştirmek suretiyle, vektör uygulanması genellikle "transdüksiyon" olarak adlandırılan bir konakçı hücre, replikasyon olmaksızın tek bir tur enfeksiyona neden olur. Viral vektörler CıBir aşırı ekspresyonu, gen susturma hem de kullanılabilir. Ifade transgen bir raportör protein (örneğin, yeşil fluoresan protein ya da ateşböceği lusiferaz) 7, bu yazıda üzerinde durulacak bir terapötik gen terapi uygulamaları 8-10 protein ya da olabilir, bir hastalıkla ilişkili proteinin hastalıkta modelleme 11 için kullanılan -14.
Viral vektör aracılığıyla gen teslimi birçok avantaj CNS'de transgenleri ifade için alternatif bir yöntem sağlar. lokal transgen uygulama kullanıldığında spesifik beyin bölgelerinde hedeflenebilir. Dahası, transgen ifade gelişimi sırasında telafi mekanizmalarının riskinin azaltılması yetişkinlik döneminde teşvik edilebilir. Ayrıca, modeller farklı türler ve suşları oluşturulabilir. Ve son olarak, farklı transgenler kolaylıkla birleştirilebilir. viral vektörler kullanılarak yüksek transgen sentezleme seviyeleri hastalığın başlama ve şiddeti genellikle overexp düzeyine bağlı olduğundan çok önemli olabilir, elde edilebilirdışarı yansıması.
farklı virüsler dayalı çeşitli vektör sistemleri geliştirilmiştir. bir vektör sisteminin seçimi, ilgi konusu genin, gen ekspresyonu, hedef hücre ve biyo-güvenlik sorunları gerekli süre büyüklüğüne bağlıdır. bu kemirgen beyin etkili ve uzun vadeli gen ifadesini yol açacağından beyin, lentiviral (IV) 'de sabit gen transferinin ve rekombinant adeno-ilişkili viral, (rAAV), vektörler artık tercih edilen vektör sistemleri kabul edilmektedir. SN dopaminerjik nöronların (DN) özel hedeflemesi için rAAV vektörleri yavaş yavaş nedeniyle yüksek titreleri ve DN transdüksiyon verimliliği LV vektörleri outcompeted var.
Şu anda mevcut en iyi α-EŞZ göre kemirgen modelleri yeni AAV serotiplerinin kullanan bir birleşik yaklaşım adlı geliştirilmiştir (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) ve vektör yapıları, titerleri, ve saflık 15,16 optimize edilmiştir. vektör titresi yanı sıra vektör saflık doğrudan etkiliyorModelin fenotipik sonucu. Aşırı vektör titreleri ya da yeterli saflaştırılmış vektör toplu spesifik olmayan toksisite ile sonuçlanabilir. Bu nedenle, uygun kontrol vektörleri vazgeçilmezdir. Viral vektör üretimi, yükseltme ve saflaştırma işlemlerinde önemli zaman yatırımı da tekrarlanabilir ve yüksek kaliteli vektör toplu elde etmek için gerekli kanıtlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm hayvan deneyleri Leuven Üniversitesi Biyoetik Komitesi (Belçika) tarafından 24 Kasım 1986 (86/609 / EEC) Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi uyarınca yürütülen ve onaylanır.
1. Rekombinant AAV Üretimi ve Saflaştırılması
Not: Daha önce tarif edildiği gibi 17 rAAV vektör üretimi ve saflaştırılması Leuven Viral vektör çekirdek (LVVC) ile gerçekleştirilmiştir.
- Kısaca, transfeksiyonu konflüan düşük (<50) geçiş, 25kD, doğrusal polietilenimin 1 bir oranda 150 nM NaCI transfeksiyon solüsyonu ve üç farklı plazmitler ile yapışık HEK 293T hücreleri: DMEM ortamı,% 2 fetal sığır serumu içinde 1: 1 arasındadır. % 5 CO2 içinde 37 ° C'de inkübe edildikten 24 saat sonra, taze DMEM ortamı,% 2 fetal sığır serumu ile orta yerine.
Not: plazmidler AAV7 serotipi için konstruktlar arasında, CMVie kontrolünde-sin α insan A53T mutantını kodlayan AAV aktarım plazmid sinaps gelişmişin1 promotör ve pAdvDeltaF6 adenoviral yardımcı plazmid 17. - Geçici transfeksiyondan sonra orta 5 gün hasat ve teğetsel akış filtrasyonu 17 kullanılarak konsantre.
- Bir iyodiksanol basamaklı bir derece 17 kullanılarak konsantre ortamdan rAAV vektörü tanecikleri arındırın.
- genomik kopya (GC) tayini için real-time PCR standart teknikleri kullanın. Bu protokol, 3.0 E11 GC bir vektör titresi / ml PD 17 için bir α-SYN tabanlı sıçan modeli geliştirmek için kullanıldı.
rAAV a-SYN 2. Stereotaktik enjeksiyon Sıçan SN Vektör (Şekil 2)
- pelet haline yiyecek ve musluk suyu ücretsiz erişim ile normal 12 saat ışık / karanlık döngüsü altında yaklaşık 200-250 g ağırlığında Ev sekiz haftalık dişi Wistar rat.
- intraperitoneal sıçan sun (ip), bir ketamin (60 mg / kg) ve medetomidini (/ kg, 0.4 mg) ihtiva eden anestezi. sıçan anestezi ve tepki vermiyor kezFarklı pençeleri sıkma yaparken, bir mikro-Transponder IMPLANTER kullanarak daha fazla tanınması için sıçan arkasında bir mikro-Transponder subkutan yönetmek. Mikro-Transponder doğru konumlandırılmış ve okuma cihazı tarafından okunabilir olup olmadığını kontrol edin.
- Kafa derisinin üstünde saçlarını kesti. derisi ve kulakların hem bir lokal anestezik uygulayın. aseptik teknikler kullanılarak bir laminer akış altında cerrahi geri kalanını gerçekleştirin.
- İki kulak çubukları, bir ağız ve burun çubuğunu kullanarak bir stereotaktik kafa çerçevesi içinde sıçan yerleştirin. vücut ısısında bir düşüş önlemek için bir kağıt battaniye ile sıçan vücudu kaplar. kurutma gözleri önlemek için bir göz yağ sürün.
- izopropanol% 70 jodium% 1 ile saçlı deri dezenfekte ve kafa derisi orta hatta küçük bir kesi yapmak. Yavaşça kafatası membranlar kazınması ve tuzlu su ile durulayın. birkaç dakika kafatası kurumasını bekleyin. Bregma ile lambda: kranial sütürler ve iki referans noktaları dikkate alın. SN içine rAAV vektör enjekte, Bregma doğru koordinatları define (ön-arka: 5,3 mm; mediyolateral: 2.0 mm ve dorsoventral: dura hesaplanan 7.2 mm).
Not: her bir ilgi bölgesi için üç boyutlu koordinatlar, anatomik bir referans noktası olarak bregmadan uygulanması, sıçan beyninin bir stereotaksik Atlası kullanarak hesaplanabilir. - rAAV vektörü ile bir 10 ul mikroenjeksiyon şırınga (30 ölçer 20 mm) doldurun ve motorlu bir mikroenjeksiyon pompasına bağlı stereotaksik alet içine koyun. Vektör bir damla bırakarak ses düzeyini kontrol ve bir çok değerlikli temizlik deterjanı pH 9 (örneğin RBS) olarak ortadan kaldırır.
- Görme baş düz kafa çerçeveye sabit olup olmadığını kontrol edin ve sol-sağ eksen değerlendirir. Dikkatle görsel bregma ile lambda için ön-arka ve mediolateral koordinatlarını tanımlamak ve stereotaktik çerçevenin dorsoventral kolunda bir 30 ölçü 20 mm iğne kullanılarak onların yüksekliğini ölçmek.
- am izinBregma ile lambda arasındaki yükseklik 0.3 mm farkı edilen maksimum eğim. geri Bregma üzerinde iğne yerleştirin ve ön-arka ve stereotaktik çerçevenin mediyolateral kolunu hareket ettirerek ön-arka ve mediyolateral koordinatlarını geçerlidir.
- Enjeksiyon yerinde, kafatasının yüksekliğini ölçmek ve bregma yükseklikten fazla 0,3 mm farklılık olmamasını sağlamak. Yaklaşık 2 mm çaplı kafatasında bir delik delin. Dura yüksekliğini ölçmek, bu dorsoventral koordinat uygulamak için bir referans olarak hizmet verecek. Seçenek olarak kafatası (0.9 mm) sabit bir kalınlığı çıkarılır.
- 26 gauge iğne kullanılarak dura nüfuz ve steril bir doku ile kan emer. Tüm kanama devam etmeden önce durmasını bekleyin.
- Yavaş yavaş (koordinat dorsoventral) 10 ul mikroenjeksiyon şırınga önceden belirlenmiş bir derinlikte beyin içine vektörü çözeltisi ile önceden yüklenmiş yerleştirin. yerinde iğne ile 1 dakika bekleyin. 3 ul enjekte0.25 ul hacmi motorlu mikroenjeksiyon pompa kullanılarak (rAAV2 / 7 α-sin ya eGFP kontrol vektörü 3.0 E11 genom kopya / ml (orta vektör doz) ya da 1.0 E12 GC / ml (yüksek vektör doz)) vektörü çözeltisi / min.
- Enjeksiyondan sonra, yavaş yavaş çıkarmadan önce başka bir 5 dakika boyunca yerde iğne tutmak. kaplanmış örgülü polyester 3.0 kullanarak kafa derisi Dikiş,% 70 izopropanol içinde% 1 jodium ile dezenfekte ve yavaşça stereotaktik enstrüman hayvan kaldırmak. Öncelikle, daha sonra iki kulak çubukları burun ve ağız çubuğu gevşetin.
- Anestezi tersine çevirmek için, 0.5 mg / kg atipamezol ile intraperitoneal sıçan enjekte ve uyanır kadar 38 ° C'lik bir ısıtma plakası üzerinde temiz bir kafeste sıçan yerleştirin. vücut ısısında bir düşüş önlemek için bir kağıt battaniye ile sıçan örtün.
- İlk saat için yiyecek ve su kolay erişim sağlar. İlk birkaç gün sıçan izleyin. Gerekirse analjezi uygulanır.
Not: t dikiş kaldırmak için gerek yokturO kafatası. 1-2 hafta sonra kafatası tamamen tamir edilir ve stiches gevşemiş.
Non-invaziv PET Görüntüleme, Davranışsal Testler ve immünohistokimyasal Analizi 3. rAAV2 Değerlendirilmesi / 7 α-SYN Enjekte Sıçanlar
- (DAT) dopamin taşıyıcısı ölçmek küçük hayvan pozitron emisyon tomografisi (PET) ve DA Transporter, örneğin bir izleyici kullanarak bağlama, non-invaziv bireysel hayvanlarda zamanla nigrostriatal dopaminerjik nörodejenerasyon kinetiği takip etmek [18 F] -FECT 16 .
- dopaminerjik nörodejenerasyon seviyesi kendiliğinden ön ayakları kullanımını değerlendirmek, sıçanlarda motor bozukluk neden silindir testi fareler tabi yeterli olup olmadığını incelemek için.
- Bir arka sonrasında duvar ve iniş boyunca dikey hareketleri sırasında cam silindir ve video kaset davranışı geniş açık 20 cm sıçan yerleştirin. 20 toplam her forepaw tarafından yapılan kişilerin sayısını skorrehber. Puanlama kriterlerinin ayrıntılı bilgi için bkz Schallert ve ark., 18 toplam ön ayakları temas yüzdesi (sol artı sağ forepaw) olarak bozulmuş ön ayakları temas (örneğin sol forepaw) sayısını ifade eder.
Not: eşit iki pençeleri kullanarak Olmayan lezyonlu kontrol sıçanların bu teste yaklaşık% 50 puan olmalıdır.
- Bir arka sonrasında duvar ve iniş boyunca dikey hareketleri sırasında cam silindir ve video kaset davranışı geniş açık 20 cm sıçan yerleştirin. 20 toplam her forepaw tarafından yapılan kişilerin sayısını skorrehber. Puanlama kriterlerinin ayrıntılı bilgi için bkz Schallert ve ark., 18 toplam ön ayakları temas yüzdesi (sol artı sağ forepaw) olarak bozulmuş ön ayakları temas (örneğin sol forepaw) sayısını ifade eder.
- transgen ifade ve dopaminerjik hücre kaybı seviyesini değerlendirmek için immünohistokimyasal (İHK) analizi yapın.
- Farklı son aşamalarında, sodyum pentobarbital (60 mg / kg, ip) bir fazla dozu ile kurban fareleri ve PBS 19 içinde% 4 paraformaldehid, ardından, soğuk tuz ile intrakardiyak perfüzyon gerçekleştirin. gece boyunca 4 ° C 'de beyin sabitlemek ve titreşimli mikrotom kullanılarak 50 um kalınlığında koronal beyin kesitler halinde kesilmiştir.
- α-SYN ifade seviyelerini ve le analiz α-SYN ve tirozin hidroksilaz karşı antikorlar kullanılarak serbest yüzen bölümlerde İHK boyama gerçekleştirinnörodejenerasyon 16 vel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Deney genel şeması, Şekil 1 'de gösterilmektedir
A53T α-sin bölgesinin rAAV 2/7 aracılı aşırı dopamin bağımlı motor bozukluklar neden olmaktadır.
Α-EŞZ aşırı ekspresyonu seviyesi sıçanlarda motor bozukluk uyarılması için yeterli olup olmadığını incelemek için, kendiliğinden ön ayakları kullanımı (Şekil 3A) değerlendirmek için silindir testi için sıçanlar tabi tutuldu. 3 hafta enjeksiyonundan sonra, önemli bir motor bozukluk bir doz A53T a-EŞZ rAAV2 / 7 vektörünün 3.0 E11 GC / ml alınan sıçanlarda görülmüştür. Enjeksiyondan 4 hafta sonra spontan karşı (sol) ön pençe kullanımında% 50 azalma eGFP rAAV2 / 7 enjeksiyon yapılan hayvanlar kontrol ise ön pençe kullanımı (Şekil 3B) herhangi bir asimetri gösteren gözlenmiştir. Daha yüksek A53T α-SYN RAAV2 / 7 vektör doz alan sıçanlar daha belirgin impairm gösterdi29 gün forepaw kullanımı (% 70) ent enjeksiyonu (Şekil 3C) sonra. gözlenen motor bozukluğu dopamin bağımlı olduğunu kanıtlamak için, bir yüksek vektör dozu enjekte sıçanlara L-DOPA (6 mg / kg ip) bir tekli dozu. L-DOPA ile tedavi gözlendi rAAV2 / 7 enjeksiyon yapılan hayvanlar α-sin A53T bölgesindeki ön pençe kullanımı tam bir iyileşme (Şekil 3C) sonra silindir testi 45 dakika tekrar zaman.
PET görüntüleme α-SYN kaynaklı ilerici nörodejenerasyon non-invaziv görüntüleme sağlar.
Non-invaziv bireysel hayvanlarda zamanla nigrostriatal dopaminerjik nörodejenerasyon kinetiği takip etmek, biz radyoligand olarak [18F] -FECT ile küçük hayvan pozitron emisyon tomografisi (PET) kullanarak bağlama dopamin taşıyıcısı (DAT) sayısal. DAT anlamlı A53T ipsilateral kaudat-putamen azalma bağlanma a-EŞZ rAAV2 / 7 injected zamanla sıçan ama eGFP kontrol hayvanda sabit kalmıştır (Şekil 4A - 4B). DAT RAAV2 / 7 hayvanlar enjekte α-SYN A53T bağlanmasının kantifikasyonu enjeksiyonundan sonra günde 7 ve 21 arasında nigrostriatal dopaminerjik dejenerasyon maksimal hızı gösterdi. 32 gün sonra, en fazla% 85 bağlayıcı DAT bir azalma (Şekil 4C) gözlenmiştir. Bir pozitif kontrol olarak, nörotoksinin SN 6-OHDA enjeksiyonu 7 gün (- 4C Şekil 4B) içinde bağlayıcı DAT% 90 kayıp indüklemiştir.
Sıçan SN RAAV2 / 7 A53T α-SYN stereotaktik enjeksiyon nigral dopaminerjik hücre ölümünü ve çözünmez α-SYN pozitif agrega oluşumunu uyarır.
α-SYN aşın ve dopaminerjik hücre kaybının düzeyini analiz etmek biz farklı zaman noktalarında hayvanların kurban. IHC bir antikor ag, kullanılarak serbest yüzen bölümleri üzerinde gerçekleştirilmiştirainst α-sinüklein (tavşan poliklonal 1: 5,000). Bu antikor algılayabilir insan ve sıçan iki α-sinüklein, ancak bunlar, sıçan α-sinüklein endojen seviyelerinin sinaptik membranlarındaki baskın yerleşim nedeniyle nigral hücre somata olan algılama limitlerinin altında kalmıştır. eşek hücre kaybı biz TH karşı bir antikor (: 1,000 tavşan poliklonal 1) kullanılır.
Sıçanların - Dört gün rAAV vektörü enjeksiyonundan sonra, α-syn veya EGFP ifade SN (5C Şekil 5A) 'de tespit edilmiştir. DN çoğunluğu (>% 90) verimli transduced ve her ikisi de transgenik proteinlerin hücre gövdeleri ve aksonlar lokalize edildi. Hala Sn (- 5C Şekil 5B) çevresinde tespit edilebilir iken, 29 gün post enjeksiyonu (PI) α-EŞZ ekspresyonunda bir azalma, SNpc gözlenmiştir. Sonra, nigral hücre kaybı düzeyini analiz. Bir hızlı ve ilerleyici kayıp oTH-pozitif nöronların f% 80'e varan enjekte sıçanlarda 29 gün boyunca tespit edildi A53T α-SYN RAAV2 / 7 (Şekil 5D - 5H). Not, SYN α-benzeri dopaminerjik nörodejenerasyon sonuçlandı yabani tip yerine A53T fazla sentezlenmesi (veriler gösterilmemiştir). SN DN kaybı striatum (STR) (Şekil 5F) TH-pozitif sinir terminalleri sağlam azalma ile paralel edildi. Belirli vektör toplu etkilerini ekarte etmek için, farklı α-SYN vektör hazırlıkları benzer sonuçlar ile SN test edildi. TH boyanma hiçbir azalma SN gözlendi veya eGFP rAAV2 / 7 STR kontrol hayvanları (Şekil 5E-5H) enjekte edilir. dopaminerjik nörodejenerasyon yanında, α-synucleinopathy varlığı PD ikinci önemli özelliğidir. Bizim modeli (dört hafta) kısa süre seyrine rağmen, biz STR (Şekil 5I'da α-SYN-pozitif SN sitoplazmik agrega ve distrofik neurites hem gözlenen ong>). Ubikitin immunoreaktivitesi insan beyninin 20-22 Lewy vücut patolojisi ayrı bir özelliğidir. Biz nigral nöronlar ifade α-SYN (Şekil 5J) bir kısmını (±% 20) 29 gün pi de α-SYN co-lokalizasyon ve ubikitini gözlendi. Α-SYN agrega fibriler yapısı 23 boyama Thioflavin S (Thio S) ile değerlendirildi. Tiyo pozitif hücreler itibaren 17 gün (Şekil 5J) den SN tespit edildi S.
Şekil 1:. Ilerici nörodejenerasyonunda RAAV2 / 7 α-SYN vektör sonuçlarının Stereotaktik enjeksiyon sıçan SN RAAV2 / 7 α-SYN vektör Stereotaktik enjeksiyon davranış analizi (silindir testi), non-invaziv PET üzerinden ölçülen dopaminerjik nörodejenerasyon indükler görüntüleme ve IHC analizi.d / 53670 / 53670fig1large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 2: sıçan SN RAAV2 / 7 vektör kodlama α-SYN Stereotaktik enjeksiyon. (A, B, E) iki referans noktaları tanımlayarak sıçan kafatası kafatası sütür: Bregma ve Lambda. (C), yani SN enjeksiyon bölgesini gösteren sıçan beyninin stereotaksik haritası. İki kulak çubukları, bir ağız ve burun çubuğunu kullanarak bir stereotaktik kafa çerçevesi içinde konumlandırılmış (D) Bir Wistar sıçan. (F) vektörü ile doldurulmuş 30 gauge iğne substantia nigra pozisyonunda yerleştirilir. (G) bir küçük bütün enjeksiyon bölgesinde delinir ve iğne pozisyonda yerleştirilir. Kafa derisi şti bir enjeksiyondan sonra (H)tched ve dezenfekte. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 3: A53T arasında rAAV 2/7 aracılı aşırı a-EŞZ dopamin bağımlı motor bozukluklar neden olmaktadır rAAV2 / 7 A53T a-sin enjeksiyonundan sonra farklı zaman noktalarında (A, B), silindir testi.. (Ortalama ± SD * p <0.05 17 karşı gün # p <ANOVA ve Tukey post hoc testi ile 0.05 eGFP kontrolleri, n = 5). RAAV2 / 7 A53T a-EŞZ (yüksek vektör doz) enjeksiyonundan sonra farklı zaman noktalarında (C) silindir testi. (Ortalama ± SD, * ANOVA ve Tukey p <0.05 4 gün 29 karşı gün post hoc testi, n = 5). Test ya da Levodopa (L-DOPA) uygulanması olmadan yapıldı. (Ortalama ± SD * p <0.05 ANOVA ve Tukey post hoc testi ile tedavi edilen hayvanlarda karşı muamele edilmemiş, n = 5). Yaşlanmanın Nörobiyoloji, Vol yayımlanmaktadır. 36. Van der Perren et al., Elsevier izniyle adeno-ilişkili viral vektörler, 1543-1558, (2015), alfa-sinüklein aşırı ekspresyonu göre Parkinson hastalığı için sağlam bir fare modelinin uzunlamasına takip ve karakterizasyonu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 4:. A53T non-invaziv görüntüleme a-SYN DAT PET görüntüleme (A - B) kullanılarak oluşturulan dopaminerjik hücre ölümü ortalama striatal DAT bağlanmasını gösteren yatay ve koronal dilimleri Serisi (A) RAAV2 / 7 A53T α-SYN hayvanlar enjekte ayırıcı att zaman noktalarında enjeksiyon (n = 7) ve (B) / sonra 7 eGFP enjekte rAAV2 (n = 1), ya da 6-OHDA (n = 1), 79 gün enjeksiyonundan sonra kontrol hayvanları tedavi. Renk çubukları DAT için bağlayıcı potansiyeller gösterir. DAT (C) Niceleme RAAV2 / 7 A53T bağlayıcı a-SYN, RAAV2 / 7 EGFP ve 6-OHDA (veri sd ortalama ± temsil) farklı zaman noktalarında ölçülen hayvanların enjekte etti. Yaşlanmanın Nörobiyoloji, Vol yayımlanmaktadır. 36. Van der Perren et al., Elsevier izniyle adeno-ilişkili viral vektörler, 1543-1558, (2015), alfa-sinüklein aşırı ekspresyonu göre Parkinson hastalığı için sağlam bir fare modelinin uzunlamasına takip ve karakterizasyonu. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5: rAAV A53T yaklaşık 2/7-aracılı aşırı ekspresyonu a-SYN dopaminerjik hücre ölümü ve çözünmez α-SYN pozitif agrega oluşumunu uyarır. (A - B) İHK boyama gösteren α-SYN aşın 4 gün ve 29 gün içinde rAAV aracılı transferinden sonra sıçan SN. Ekler Seçilen alanın büyütme göstermektedir. Ölçek çubuğu = 400 mikron (genel resim solda), 70 mikron ve 200 mikron (ekler sağ). (C) İHK boyama eGFP aşırı ekspresyonu 4 gün ve sıçan SN rAAV aracılı transferinden sonra 29 gün gösteren. Ölçek çubuğu = 400 mikron. (D - G) SN (E, G), rAAV2 / 7 eGFP enjeksiyonundan sonra (D, F) rAAV2 / 7 α-sin ya da 29 günlük enjeksiyonundan sonra farklı zaman noktalarında SN ve STR TH IHC boyama . Ölçek çubuğu, c = 400 um, B, D = 1,000 um. (H) uyuşmuş stereolojik miktarzamanla SN TH pozitif nöronlarının er rAAV2 / 7 A53T α-EŞZ enjeksiyon veya rAAV2 / 7 eGFP kontrol vektörü (Ortalama ± SD sonra * p <0.05 8 karşılık gün # p <ANOVA ile eGFP kontrollere karşı 0.05 ve Tukey post hoc testi, n = 5). (I) İHK boyama intranigral sonra RAAV2 / 7 A53T α-SYN enjeksiyon, STR sitoplazmik SN agrega ve distrofik ve şişkin neurites dahil olmak üzere α-SYN patoloji gösteren. (J) α-SYN (yeşil) ve ubiquitin (kırmızı) için floresan çift immunostainings Temsilcisi konfokal görüntüleri zaman (oklar) üzerinden eş-lokalizasyon bir artış göstermektedir. Ölçek çubuğu c = 50 mm. SN Thioflavin S boyama 29 gün RAAV2 / 7 A53T α-SYN enjeksiyonundan sonra. Ölçek çubuğu D 30 mikron =. Yaşlanmanın Nörobiyoloji, Vol yayımlanmaktadır. 36. Van der Perren ve diğ., Reklamla alfa-sinüklein aşırı ekspresyonu göre Parkinson hastalığı için sağlam bir fare modelinin uzunlamasına takip ve karakterizasyonuElsevier izni ile viral vektörlerin, 1543-1558, (2015), eno ilişkili. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
protokolü içinde birkaç kritik adımlar vardır. vektör titresi yanı sıra vektör saflık doğrudan modelin fenotipik sonuçlarını etkiler. Aşırı vektör titreleri ya da yeterli saflaştırılmış vektör toplu spesifik olmayan toksisite ile sonuçlanabilir. Bu nedenle, yüksek kaliteli vektör gruplar ve uygun kontrol vektörlerin kullanılması kaçınılmazdır. Bundan başka, stereotaksik çerçeveye sıçan kafasının tam olarak konumlandırılması ve koordinatları doğru belirlenmesi substantia nigra hedefleme gereklidir. enjeksiyon yerinde kafatasında delik sonra, herhangi bir kenar boşluklarını dokunmadan düz sıçan beyninin içine iğneyi önemlidir. İğne yavaş yavaş vektör sızıntısını önlemek için, viral vektör enjekte sonra çıkarılmalıdır. Son olarak, dikiş sonra, kafa derisi diğer hayvanlar tarafından stiches ısırma önlemek için% 70 izopropanol içinde% 1 jodium ile dezenfekte edilmelidir. Alternatif olarak diğer antiseptik reaktiflerkullanılabilir.
Tarif edilen yöntem aynı zamanda Parkinson hastalığı 24 bir rAAV2 / 7 α-EŞZ göre bir fare modelinin geliştirilmesi için kullanılabilir. Farelerde biz SN 2 ul rAAV vektörü hacmi enjekte. sıçanlar ile karşılaştırıldığında, farelere DN nörodejenerasyonun gecikmeli tezahürü sonuçlanan aşırı ekspresyonu SYN a biraz daha az hassas olduğu görülmektedir. Ayrıca, beyin diğer bölgeleri (örneğin, striatum, hipokampus, korteks, vs.) hedeflenebilir. beynin farklı bölgeleri için koordinatları stereotaksik atlas bulunabilir. Koordinatları optimizasyonu Çin mürekkebi ile ya da (örneğin, EGFP) kodlayan bir haberci gen, bir viral vektör kullanılarak yapılabilir. Farklı vektörlerin sistemleri (rAAV, AG, vb), uygulamaya bağlı olarak kullanılabilir.
Bu teknik, her hayvan ayrı ayrı enjekte edilmesi gerekir sınırlama vardır. Bu nedenle eğitimli bir kişi min amacıyla enjeksiyonları yapmalıdırFarklı hayvanlar arasındaki hadde indirgenmesi varyasyonları. Başka bir sınırlama yöntemi zaman alıcı (eğitimli bir kişi tarafından çalıştırıldığında bu hayvan başına yaklaşık 45 dakika sürer) olmasıdır. Sadece sekiz ila on hayvan bir gün içinde enjekte edilebilir.
Viral vektör aracılığıyla gen teslimi beyin bölgelerinde spesifik hedefleme için izin verir. viral vektörler kullanılarak yüksek transgen sentezleme seviyeleri hastalığın başlama ve şiddeti α-EŞZ ekspresyon düzeyine bağlıdır çünkü önemli olan, elde edilebilir. Ayrıca, farklı doz nörodejenerasyon daha yavaş veya daha hızlı kinetiği gösteren bir hayvan modelinde sonuç olan uygulanabilir. Son olarak, bu teknik, aynı vektör preparatı kullanarak farklı hayvan türleri ve suşları modelleri oluşturmak için de kullanılabilir.
Bu işlem, viral vektörler gibi toksinleri dağıtmak için kullanılabilir vektör tarafından kodlanan brain.The transgen farklı bölgeye (örneğin, 6-OHDA) bir raportör protein, bir terapötik s olabilirGen terapisi uygulamalarında 8-10 veya hastalık modelleme 11-14 için kullanılan bir hastalık ile ilişkili protein için rotein. Bu teknik, klinik öncesi ilaç testi için izin yeni bir hayvan modeli geliştirmek için kullanılabilir ve Parkinson hastalığı gibi pek çok nöro-dejeneratif hastalıkların moleküler mekanizması incelenmesinde yararlı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar fiili ya da potansiyel bir çatışma olduğunu beyan ederim.
Acknowledgments
Yazarlar mükemmel teknik yardım için Joris Van Asselberghs ve Ann Van Santvoort teşekkür ederim. Araştırma AT-FP6 programı 'Dimi' (LSHB-CT-2005-512146), 7.ÇP RTD proje MEFOPA (SAĞLIK tarafından, IWT-Vlaanderen (/ 80020 IWT SBO), FWO Vlaanderen (G.0768.10) tarafından finanse edildi -2.009-241791), 7.ÇP programı 'Inmind' (SAĞLIK-F2-2011-278850), KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, İmir PF / 10/017), ve MJFox Vakfı (Hedef doğrulama 2010). A. Van der Perren ve C Casteels Bilimsel Araştırma Flaman Fonu doktora sonrası adamlar vardır. K. Van Laere Bilimsel Araştırma Flaman Fonu üst düzey bir klinik üyesidir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5,000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1,000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6 mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
References
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., Richter, F.
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
- Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L.
- Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle? Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H. 3rd Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).
