Abstract
För att studera de molekylära vägar vid Parkinsons sjukdom (PD) och att utveckla nya behandlingsstrategier, vetenskapliga utredare lita på djurmodeller. Identifieringen av PD associerade gener har lett till utvecklingen av genetiska PD-modeller. Mest transgena modeller α-SYN mus utvecklar gradvis α-SYN patologi men misslyckas med att visa klart dopaminerga cellförlust och dopaminberoende beteendestörningar. Detta hinder övervanns genom direkt inriktning på substantia nigra med virala vektorer som överuttrycker PD associerade gener. Lokal genöverföring med hjälp av virala vektorer ger ett attraktivt sätt att uttrycka transgener i det centrala nervsystemet. Specifika delar av hjärnan kan riktas (t.ex. substantia nigra), kan expression induceras i den vuxna inställningen och kan uppnås höga expressionsnivåer. Vidare kan olika vektorsystem baserade på olika virus användas. Protokollet beskriver alla viktiga steg för att utföra en virusvektorinjektion i substantia nigra hos råtta att utveckla en viral vektorbaserad alfa-synuklein djurmodell för Parkinsons sjukdom.
Introduction
För att studera patofysiologin av PD och att utveckla nya behandlingsstrategier, det finns ett brådskande behov av djurmodeller som nära liknar de neuropatologi, fysiologi och motoriska symtom av human PD. Ju högre det prediktiva värdet, desto bättre kan vi översätta nya terapier från djurmodeller till patienter.
Upptäckten av alfa-synuklein (α-SYN) som den första PARK genen i 1997 ledde till utvecklingen av de första genetiska PD-modeller. Många transgena möss som överuttrycker human vild-typ (WT) eller mutant (A30P, A53T) α-SYN har genererats under det senaste decenniet. Nivåerna av α-SYN överuttryck har visat sig vara avgörande för utvecklingen av patologi. Också musstam, närvaro eller frånvaro av endogen α-SYN och huruvida hela längden eller en stympad form uttrycks, spelar en roll (detaljerad genomgång av Magen och Chesselet 1). Överuttryck av både WT och flera kliniska mutanter av humant &# 945; -SYN i transgena möss inducerar patologisk ackumulering av α-SYN och neuronal dysfunktion 2-6. Men fram tills nu mest transgena modeller α-SYN mus misslyckats med att visa klart dopaminerga cellförlust och dopaminberoende beteendestörningar.
Detta hinder övervanns genom direkt inriktning på substantia nigra (SN) med virala vektorer som överuttrycker α-SYN. Virala vektorer är härledda från virus som lätt kan infektera celler, införa genetiskt material i deras värdgenomet och tvinga värdcellen att replikera det virala genomet för att producera nya viruspartiklar. Virus kan vara konstruerad för att icke-replikerande virala vektorer som bibehåller sin förmåga att komma in i celler och införa gener. Genom att ta bort delar av det virala genomet och ersätta dem genom de gener av intresse, kommer tillämpningen av vektorn resulterar i en enda runda infektionen utan replikation i värdcellen, som allmänt betecknas som "transduktion". Virala vektorer cen kan användas för både uttryck och geners uttryck. Den uttryckta transgen kan vara en reporter protein (t.ex. grönt fluorescerande protein eller eldflugeluciferas) 7, ett terapeutiskt protein för genterapitillämpningar 8-10 eller, som vi kommer att fokusera på i detta dokument, en sjukdomsrelaterad protein som används för sjukdom modellering 11 -14.
Viral vektor-medierad gentillförsel tillhandahåller ett alternativt sätt att uttrycka transgener i CNS med flera fördelar. Med hjälp av lokala transgen leverans, kan specifika områden i hjärnan riktas. Vidare kan transgenexpression induceras under vuxenlivet minskar risken för kompensationsmekanismer under utveckling. Dessutom kan modellerna skapas i olika arter och stammar. Och slutligen, olika transgenerna kan enkelt kombineras. Med hjälp av virala vektorer, kan höga transgenexpression nivåer uppnås, vilket kan vara avgörande eftersom sjukdomen bryter ut och svårighetsgrad ofta beror på graden av OVEREXPression.
Flera vektorsystem baserade på olika virus har utvecklats. Valet av vektorsystem beror på storleken av genen av intresse, den erforderliga varaktigheten av genuttryck, målcellen och biosäkerhetsaspekter. För stabil genöverföring i hjärnan, lentivirala (LV) och rekombinant adeno-associerad viral är (rAAV) -vektorer nu anses de vektorsystem av val eftersom de leder till en effektiv och långsiktig genuttryckning i gnagare hjärnan. För specifik inriktning av dopaminerga neuroner (DN) av SN har rAAV-vektorer successivt konkurreras LV vektorer på grund av deras högre titer och transduktion effektivitet DN.
De bästa α-syn baserad gnagarmodeller för närvarande tillgängliga har utvecklats från ett kombinerat tillvägagångssätt med hjälp av nyare AAV serotyper (rAAV 1, 5, 6, 7, 8) och optimerad vektorkonstruktioner, titer och renhet 15,16. Vektorn titer samt vektor renhet direkt påverkarden fenotypiska resultatet av modellen. Överdriven vektor titer eller otillräckligt renade vektor partier kan resultera i icke-specifik toxicitet. Därför lämpliga styr vektorer är oumbärliga. Avsevärd tid investering i virusvektorproduktion, uppskalning och reningsprocedurer har också visat sig vara nödvändig för att erhålla reproducerbara och högkvalitativa vektor partier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök utförs i enlighet med Europeiska gemenskapernas rådets direktiv av den 24 november 1986 (86/609 / EEG) och godkännas av bioetiska kommitté vid universitetet i Leuven (Belgien).
1. Rekombinant AAV Produktion och rening
Notera: rAAV vektorproduktion och rening utfördes genom Leuven Viral vektor Kärna (LVVC) såsom tidigare beskrivits 17.
- Kortfattat, transfektera subkonfluent låg (<50) passage adherenta HEK 293T-celler med användning av en 25kD linjär polyetylenimin 150 nM NaCl transfektion lösning och tre olika plasmider i ett förhållande av 1: 1: 1 i DMEM-medium 2% fetalt bovint serum. Efter 24 h av inkubation vid 37 ° C i en 5% CO2, ersätta mediet med färskt DMEM-medium 2% fetalt bovint serum.
Notera: De plasmider innefattar konstruktionerna för AAV7 serotyp, AAV överförings plasmid som kodar för humant A53T mutanten α-SYN under kontroll av den CMVie förbättrade synapsin1 promotorn och pAdvDeltaF6 adenovirala hjälparplasmid 17. - Skörda medel 5 dagar efter övergående transfektion och koncentrera med hjälp av tangentiell flödesfiltrering 17.
- Rena rAAV vektorpartiklar från det koncentrerade mediet med hjälp av en iodixanol steggradient 17.
- Använd standardtekniker för realtids-PCR för genomisk kopia (GC) bestämning. I detta protokoll, en vektor titer av 3,0 E11 GC / ml användes för att utveckla en α-SYN baserad råttmodell för PD 17.
2. Stereotaktisk injektion av rAAV α-SYN vektor i SN Råttans (Figur 2)
- Hus åtta veckor gamla Wistar-råttor som vägde omkring 200 till 250 g under normal 12 h ljus / mörkercykel med fri tillgång till pelleterat mat och kranvatten.
- Lämna råttan att intraperitoneala (ip) anestesi innehållande en blandning av ketamin (60 mg / kg) och medetomidin (0,4 mg / kg). När råttan sövd och reagerar intenär klämma de olika tassar, administrera en mikro-transponder subkutant på baksidan av råtta för vidare erkännande med hjälp av en mikro-transponder implantatinjektorn. Kontrollera om mikro-transpondern är korrekt placerad och kan avläsas av avläsningsanordningen.
- Klippa håret på toppen av hårbotten. Tillämpa en lokalbedövning på både hårbotten och öronen. Utför resten av det kirurgiska ingreppet i dragskåp med aseptisk teknik.
- Placera råttor i en stereotaktisk huvudram med två örat barer, en mun och näsa bar. Täcka kroppen hos råttan med en pappersfilt för att undvika en nedgång i kroppstemperatur. Applicera en okulär smörjmedel för att förhindra att ögonen från torkning.
- Desinficera hårbotten med jodium 1% i isopropanol 70% och göra ett litet snitt i mittlinjen på hårbotten. Försiktigt skrapa bort membranen på skallen och skölj med saltlösning. Låt skallen torka under flera minuter. Beakta kraniala suturer och de två referenspunkterna: Bregma och Lambda. Att injicera rAAV vektorn i SN, definiera koordinaterna mot bregma (anteroposterior: 5,3 mm; mediolateral: 2,0 mm och dorsoventral: 7,2 mm räknat från dura).
Obs! Tredimensionella koordinaterna för varje region av intresse kan beräknas med hjälp av en stereotaktiska atlas av råtthjärna, tillämpa Bregma som anatomisk referenspunkt. - Fyll en mikroinjektion spruta 10 l (30 gauge 20 mm) med rAAV vektor och placera den i stereotaxic instrument i samband med en motordriven mikroinjektion pump. Styra volymen genom att släppa en droppe vektor och eliminera i en polyvalent rengöringsmedel pH 9 (t.ex. RBS).
- Kontrollera visuellt om huvudet är fast rakt i huvudet ram och utvärdera vänster-höger axel. Noga visuellt definiera anteroposterior och mediolateral koordinaterna för bregma och lambda och mäta deras höjd med hjälp av en 30 gauge 20 mm nål i dorsoventral arm stereotaktiska ramen.
- Tillåt amAximum av 0,3 mm i höjd mellan Bregma och lambda. Placera nålen tillbaka på bregma och tillämpa anteroposterior och mediolateral koordinater genom att flytta anteroposterior och mediolateral arm stereotaktiska ramen.
- Vid injektionsstället, mäta höjden av skallen och se till att det inte skiljer mer än 0,3 mm från höjden på bregma. Borra ett hål i skallen med en diameter av ca 2 mm. Mäta höjden på dura, kommer detta att fungera som en referens för att tillämpa dorsoventral koordinaten. Alternativt subtrahera en fast tjocklek för skallen (0,9 mm).
- Penetrera dura med hjälp av en 26 gauge nål och absorbera blodet med en steril vävnad. Vänta tills alla har slutat blöda innan du fortsätter.
- Långsamt in mikroinjektion spruta 10 l förinstallerade med vektor lösning i hjärnan till förutbestämt djup (dorsoventral koordinat). Vänta 1 min med nålen på plats. Injicera 3 plav vektor-lösning (3,0 E11 genom kopior / ml (medium vektor dos) eller 1,0 E12 GC / ml (hög vektor dos) av rAAV2 / 7 α-SYN eller EGFP kontrollvektor) med hjälp av motoriserade mikroinjektion pump med en kapacitet på 0,25 l / min.
- Efter injektion, hålla nålen på plats under ytterligare 5 minuter innan sakta ta bort den. Sy hårbotten med hjälp av belagda flätad polyester 3,0, desinficera med 1% jodium i 70% isopropanol och försiktigt bort djuret från stereotaktiska instrumentet. Lossa först näsan och munnen bar, sedan de två öron barer.
- För att vända den anestesi, injicera råtta intraperitonealt med 0,5 mg / kg atipamezol och placera råttan i en ren bur på en värmeplatta 38 ° C tills den vaknar. Täck råttan med en pappersfilt för att förhindra en nedgång i kroppstemperatur.
- Ger enkel tillgång till mat och vatten under de första timmarna. Övervaka råtta under de första dagarna. tillämpa smärtlindring vid behov.
Obs: Det finns ingen anledning att ta bort stygnen från than skalle. Efter 1-2 veckor skallen är helt repareras och stygn lossnar.
3. Bedömning av rAAV2 / 7 α-SYN injicerade råttor med hjälp av icke-invasiv PET Imaging, beteendetester och Immunhistokemisk analys
- För att följa upp kinetiken av nigrostriatala dopaminerga neurodegeneration icke-invasivt över tiden i enskilda djur, kvantifiera dopamintransportören (DAT) bindning med hjälp av små djur positronemissionstomografi (PET) och ett spårämne av DA Transporter t.ex. [18 F] -FECT 16 .
- För att undersöka huruvida nivån på dopaminerga neurodegeneration är tillräcklig för att framkalla motoriska försämringar i råttorna, utsätta råttorna till cylinder test för att utvärdera spontan forelimb användning.
- Placera råttan i en 20 cm bred klar glasampull och videoband beteende under vertikala rörelser längs väggen och landning efter en bak. Betyg antalet kontakter som varje tassarna för totalt 20kontakter. För detaljerad beskrivning av de kriterier poäng se Schallert et al. 18 Uttryck antalet osäkra forelimb kontakter (t.ex. vänster framtassarna) i procent av den totala forelimb kontakter (vänster plus höger framtass).
Obs: Icke-skadade kontrollråttor med båda tassarna lika bör poäng cirka 50% i detta test.
- Placera råttan i en 20 cm bred klar glasampull och videoband beteende under vertikala rörelser längs väggen och landning efter en bak. Betyg antalet kontakter som varje tassarna för totalt 20kontakter. För detaljerad beskrivning av de kriterier poäng se Schallert et al. 18 Uttryck antalet osäkra forelimb kontakter (t.ex. vänster framtassarna) i procent av den totala forelimb kontakter (vänster plus höger framtass).
- Utför immunohistokemisk (IHC) analys för att bedöma nivån på transgen expression och dopaminerga cellförlust.
- Vid olika slutsteg, offra råttorna med en överdos av natriumpentobarbital (60 mg / kg, ip) och utföra en intrakadriell perfusion med kall saltlösning följt av 4% paraformaldehyd i PBS 19. Fixera hjärnor över natten vid 4 ° C och skär 50 um tjocka koronala hjärnan sektioner med hjälp av en vibrerande mikrotom.
- Utför IHC färgning på fritt flytande sektioner med användning av antikroppar mot α-SYN och tyrosinhydroxylas att analysera α-SYN uttrycksnivåer och level av neurodegeneration 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den övergripande planen för experimentet visas i figur 1
rAAV 2/7-medierad överuttryck av A53T α-SYN inducerar dopaminberoende motoriken.
För att undersöka huruvida nivån på α-SYN uttryck är tillräcklig för att framkalla motoriska försämringar i råttorna, vi utsattes råttorna för cylinder test för att utvärdera spontan forelimb användning (figur 3A). Från 3 veckor efter injektion, var en betydande motorisk försämring hos råttor som fick en dos 3,0 E11 GC / ml A53T α-SYN rAAV2 / 7 vektor. Vid 4 veckor efter injektion en 50% minskning av spontan kontralateralt (vänster) framtassarna användning observerades, medan kontroll EGFP rAAV2 / 7 injicerade djur uppvisade ingen asymmetri i framtassarna användning (figur 3B). Råttor som fick en högre A53T α-SYN rAAV2 / 7 vektor dos uppvisade en mer uttalad impairment av framtassarna användning (70%) vid 29 dagar efter injektion (Figur 3C). För att bevisa att den observerade motorisk försämring var dopaminberoende, vi administrerade en enda dos av L-DOPA (6 mg / kg ip) till råttorna som injicerats med en hög vektor dos. När vi upprepade cylindertestet 45 minuter efter L-DOPA behandling, en fullständig återhämtning av framtassarna användning i A53T α-SYN rAAV2 / 7 injicerade djur observerades (Figur 3C).
PET imaging tillåter icke-invasiv avbildning av α-SYN inducerade progressiva neurodegeneration.
För att följa upp kinetiken av nigrostriatala dopaminerga neurodegeneration icke-invasivt över tiden i enskilda djur, kvantifieras vi dopamintransportören (DAT) bindning med hjälp av små djur positronemissionstomografi (PET) med [18 F] -FECT som radioligand. DAT bindning minskat betydligt i den ipsilaterala caudatus-putamen av A53T α-SYN rAAV2 / 7 injected råttor över tiden men förblev stabil i EGFP kontrolldjuret (Figur 4A - 4B). Kvantifiering av DAT bindning av A53T α-SYN rAAV2 / 7 injicerade djuren uppvisade en maximal hastighet av nigrostriatala dopaminerga degeneration mellan dag 7 och 21 efter injektion. Efter 32 dagar, observerades en minskning i DAT bindning av upp till 85% observerades (Figur 4C). Som en positiv kontroll, injektion av neurotoxinet 6-OHDA i SN inducerade 90% förlust av DAT-bindning inom 7 dagar (Figur 4B - 4C).
Stereotaktisk injektion av rAAV2 / 7 A53T α-SYN i SN hos råttan inducerar nigral dopaminerga celldöd och bildning av olösliga α-SYN positiva aggregat.
För att analysera nivån av α-SYN uttryck och dopaminerga cellförlust vi offrade djuren vid olika tidpunkter. IHC utfördes på fritt flytande sektioner med hjälp av en antikropp against α-synuklein (kanin polyklonal 1: 5000). Denna antikropp kan upptäcka både människa och råtta α-synuklein, men endogena nivåer av rått α-synuklein låg under detektionsgränser inom nigral cell somata, på grund av sin dominerande lokalisering vid synaptiska membran. Att bedöma cellförlust vi använt en antikropp mot TH (kanin polyklonal 1: 1000).
Fyra dagar efter rAAV vektor injektion var α-SYN eller EGFP uttryck detekteras i SN (figur 5A - 5C) av råttorna. Majoriteten (> 90%) av DN var effektivt omvandlas och båda transgena proteiner lokaliserade i cellkropparna och axoner. Vid 29 dagar efter injektion (pi) en betydande minskning av α-SYN expression observerades i den SNPC, medan det fortfarande var detekterbart i områden som omger SN (figur 5B - 5C). Därefter analyserade vi nivån på nigral cellförlust. En snabb och progressiv förlust of upp till 80% av TH-positiva neuroner upptäcktes över 29 dagar hos råttor som injicerats med A53T α-SYN rAAV2 / 7 (Figur 5D - 5H). Notera överuttryck av vildtyp i stället för A53T α-SYN resulterade i liknande dopaminerg neurodegenerering (data visas ej). Förlusten av den DN i SN var parallellt med en robust minskning av TH-positiva nervterminaler i striatum (STR) (figur 5F). För att utesluta specifika vektor satseffekter, var olika α-SYN vektorberedningar testades i SN med liknande resultat. Ingen minskning av TH färgning observerades i SN eller STR av EGFP rAAV2 / 7 injicerade kontrolldjur (Figur 5E-5H). Bredvid dopaminerg neurodegenerering, är närvaron av α-synucleinopathy ett andra viktigt kännetecken för PD. Trots den korta tid under vår modell (fyra veckor), observerade vi både α-SYN-positiva cytoplasmiska aggregat i SN och dystrofa neuriter i STR (Figur 5I ong>). Ubiquitin immunoreaktivitet är en utmärker Lewy body patologi i den mänskliga hjärnan 20-22. Vi observerade sam-lokalisering av α-SYN och ubikitin vid 29 dagar pi på en bråkdel (± 20%) av α-SYN uttryck nigrala neuroner (figur 5J). Den fibrillära naturen hos α-SYN aggregat utvärderades genom Thioflavin S (Thio S) färgning 23. Thio S positiva celler detekterades i SN från 17 dagar framåt (figur 5J).
Figur 1:. Stereotaktisk injektion av rAAV2 / 7 α-SYN vektor resulterar i progressiv neurodegenerering Stereotaktisk injektion av rAAV2 / 7 α-SYN vektor i SN hos råttan inducerar dopaminerg neurodegenerering mäts via beteendeanalys (cylindertest), icke-invasiv PET avbildning och IHC-analys.d / 53670 / 53670fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Stereotaktisk injektion av rAAV2 / 7 vektor som kodar för α-SYN i SN hos råttan. (A, B, E) hjärn suturer på råtta skalle, som definierar de två referenspunkter: Bregma och Lambda. (C) en stereotaxisk atlas över råtthjärna presenter regionen av injektions nämligen SN. (D) En Wistar-råtta placeras i en stereotaktisk huvudram med två örat barer, en mun och näsa bar. (F) Den 30 gauge nål fylld med vektorn placeras i läge för substantia nigra. (G) En liten helhet är borrad vid stället för injektionen och nålens sätts på plats. (H) Efter injektion hårbotten är stitched och desinficeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: rAAV 2/7-medierad överexpression av A53T α-SYN inducerar dopaminberoende motoriken (A, B) Cylinder-test vid olika tidpunkter efter injektion av rAAV2 / 7 A53T α-SYN.. (Medelvärde ± sd, * p <0,05 jämfört med 17 dagar, # p <0,05 EGFP kontroller genom ANOVA och Tukey post hoc-test, n = 5). (C) Cylinder testet vid olika tidpunkter efter injektion av rAAV2 / 7 A53T α-syn (hög vektor dos). (Medelvärde ± sd, * p <0,05 4 dagar kontra 29 dagar genom ANOVA och Tukey post hoc-test, n = 5). Testet utfördes med eller utan administrering av levodopa (L-DOPA). (Medelvärde ± SD, * p <0.05 icke-behandlade kontra behandlade djur från ANOVA och Tukey post hoc-test, n = 5). Omtryckt från Neurobiology of aging, Vol. 36, Van der Perren et al., Långtidsuppföljning och karakterisering av en robust råttmodell för Parkinsons sjukdom baserat på överuttryck av alfa-synuklein med adenoassocierade virala vektorer, 1543-1558, (2015), med tillstånd från Elsevier. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4:. Icke-invasiv avbildning av A53T α-SYN inducerade dopaminerga celldöd med hjälp av DAT PET imaging (A - B) Serie av horisontella och koronala skivor som visar medel striatala DAT bindning av (A) rAAV2 / 7 A53T α-SYN injicerade djur vid different tidpunkter efter injektion (n = 7) och (B) rAAV2 / 7 EGFP injicerades (n = 1) eller 6-OHDA behandlade kontrolldjur (n = 1) 79 dagar efter injektion. Färgfälten indikerar bindande potential för DAT. (C) Kvantifiering av DAT bindningen av rAAV2 / 7 A53T α-SYN, rAAV2 / 7 EGFP och 6-OHDA injicerade djur som uppmäts vid olika tidpunkter (data representerar medelvärde ± sd). Omtryckt från Neurobiology of aging, Vol. 36, Van der Perren et al., Långtidsuppföljning och karakterisering av en robust råttmodell för Parkinsons sjukdom baserat på överuttryck av alfa-synuklein med adenoassocierade virala vektorer, 1543-1558, (2015), med tillstånd från Elsevier. klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: rAAV 2/7-medierad överexpression av A53T α-SYN inducerar döden dopaminerg cell och bildning av olösliga α-SYN positiva aggregat. (A - B) IHC-färgning visar α-SYN överuttryck 4 dagar och 29 dagar efter rAAV-medierad överföring i råtta SN. Skär visar förstoringar av det markerade området. Skalstreck = 400 pm (översiktsbild till vänster), 70 pm och 200 pm (skär höger). (C) IHC färgning visar EGFP uttryck 4 dagar och 29 dagar efter rAAV-medierad överföring i rått SN. Skalstreck = 400 | j, m. (D - G) IHC färgning för TH i SN och STR vid olika tidpunkter efter injektion av (D, F) rAAV2 / 7 α-SYN eller 29 dagar efter injektion av (E, G) rAAV2 / 7 EGFP i SN . Skalstock a, c = 400 | im, b, d = 1000 | j, m. (H) stereologisk kvantifiering av number av TH-positiva neuroner i SN med tiden efter rAAV2 / 7 A53T α-SYN injektion eller rAAV2 / 7 EGFP kontrollvektor (medelvärde ± sd, * p <0,05 jämfört med 8 dagar, # p <0,05 kontra EGFP kontroller ANOVA och Tukey post hoc-test, n = 5). (I) IHC färgning visar α-SYN patologi, inklusive cytoplasmiska aggregat i SN och dystrofisk och svällande neuriter i STR, efter intranigral rAAV2 / 7 A53T α-SYN injektion. (J) Representativa konfokala bilder av fluorescerande dubbla immunostainings för α-SYN (grön) och ubiquitin (röd) visar en ökning av samlokalisering med tiden (pilar). Skalstreck c = 50 pm. Thioflavin S färgning av SN 29 dagar efter injektion av rAAV2 / 7 A53T α-SYN. Skalstock D = 30 ^ m. Omtryckt från Neurobiology of aging, Vol. 36, Van der Perren et al., Långtidsuppföljning och karakterisering av en robust råttmodell för Parkinsons sjukdom baserat på överuttryck av alfa-synuklein med annonsEno-associerade virala vektorer, 1543-1558, (2015), med tillstånd från Elsevier. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det finns flera viktiga steg i protokollet. Vektorn titer samt vektorn renhet påverkar direkt den fenotypiska resultatet av modellen. Överdriven vektor titer eller otillräckligt renade vektor partier kan resultera i icke-specifik toxicitet. Därför är nödvändig att använda högkvalitativa vektor partier och lämpliga kontroll vektorer. Vidare är väsentligt att rikta substantia nigra den exakta positioneringen av råttans huvud i stereotaxisk ram och noggrann bestämning av koordinaterna. Efter borrning av hål i skallen på injektionsstället, är det viktigt att sätta in kanylen rakt in i råttans hjärna utan att röra några marginaler. Nålen bör avlägsnas långsamt efter injektion av virala vektorn, för att förhindra vektor läckage. Slutligen, efter sömnad, hårbotten bör desinficeras med 1% jodium i 70% isopropanol för att undvika bita av stygn av andra djur. Alternativt kan andra antiseptiska reagenskan användas.
Den metod som beskrivs kan också användas för att utveckla en rAAV2 / 7 α-SYN baserade möss modell för Parkinsons sjukdom 24. I möss injicera vi en volym av 2 jil rAAV vektor i SN. Jämfört med råttor, möss DN verkar vara något mindre känslig för a-SYN överuttryck, vilket resulterar i en fördröjd manifestation av neurodegeneration. Dessutom kan andra regioner i hjärnan (t.ex. striatum, hippocampus, cortex, etc.) riktas. Koordinaterna för de olika hjärnregioner kan hittas i stereotaxic atlas. Optimering av koordinaterna kan göras genom kinesisk bläck eller med hjälp av en virusvektor som kodar en reportergen (t.ex. EGFP). Olika vektorer system (rAAV, LV, etc.) kan användas beroende på användningsområde.
Denna teknik har den begränsningen att varje djur måste injiceras individuellt. en utbildad person bör därför utföra injektionerna för till minimize variationer mellan olika djur. En annan begränsning är att metoden är tidskrävande (när den exekveras av en utbildad person som det tar ca 45 min per djur). Endast åtta till tio djur kan injiceras i en dag.
Viral vektormedierad genleverans tillåter särskild inriktning på områden i hjärnan. Med hjälp av virala vektorer, kan höga transgenexpression nivåer uppnås, vilket är avgörande eftersom sjukdomsdebut och svårighetsgrad beror på graden av α-SYN uttryck. Dessutom kan olika doser appliceras vilket kommer att resultera i en djurmodell som visar långsammare eller snabbare kinetik av neurodegeneration. Slutligen kan denna teknik användas för att skapa modeller i olika djurarter och stammar med användning av samma vektor beredning.
Detta förfarande kan användas för att leverera virala vektorer samt toxiner (t.ex. 6-OHDA) i olika regioner av brain.The transgenen som kodas av vektorn kan vara ett rapportprotein, en terapeutisk protein för genterapitillämpningar 8-10 eller en sjukdomsrelaterad protein som används för sjukdom modellering 11-14. Denna teknik kan användas för att utveckla nya djurmodeller som möjliggör för preklinisk drogtestning och kan vara fördelaktigt i att studera den molekylära mekanismen av Parkinsons sjukdom liksom många andra neurodegenerativa sjukdomar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att det inte finns någon faktisk eller potentiell intressekonflikt.
Acknowledgments
Författarna tackar Joris Van Asselberghs och Ann Van Santvoort för deras utmärkta teknisk assistans. Forskningen har finansierats av IWT-Vlaanderen (IWT SBO / 80020), den FWO Vlaanderen (G.0768.10), av EG-FP6 programmet Dimi "(LSHB-CT-2005 till 512.146), FP7 FoTU-projekt MEFOPA (HÄLSA -2.009-241.791), FP7 programmet InMind "(HEALTH-F2-2011-278850), KU Leuven (IOF-KP / 07/001, OT / 08 / 052A, IMIR PF / 10/017), och MJFox Foundation (Target validering 2010). A. Van der Perren och C. Casteels är en forskarassistenter i den flamländska fonden för vetenskaplig forskning. K. Van Laere är en erfaren klinisk kamrat av den flamländska fonden för vetenskaplig forskning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Female 8 weeks old Wistar rats | Janvier | / | 200-250 g |
| Ketamine (Nimatek) | Eurovet animal health | 804132 | |
| Medetomidine (Dormitor) | Orion-Pharma/ Janssen Animal Health | 1070-499 | |
| Local anesthetic for scalp and ears: Xylocaïne 2% gel | Astrazeneca | 0137-547 | |
| Terramycine | Pfizer | 0132-472 | |
| Buprénorphine (Vetergesic) | Ecuphar | 2623-627 | |
| Jodium 1% isopropanol | VWR | 0484-0100 | |
| stereotactic head frame | Stoeling | / | |
| Hamilton Syringe (30 gauge -20 mm -pst 2) | Hamilton/ Filter Service | 7803-07 | |
| atipamezole (Antisedan) | Orion-Pharma/Elanco | 1300-185 | |
| rAAV A53T α-SYN vector | LVVC, KU Leuven | / | https://gbiomed.kuleuven.be/english/research/50000715/laboratory-of-molecular-virology-and-gene-therapy/lvvc/ |
| sodium pentobarbital (Nembutal) | Ceva Santé | 0059-444 | |
| microtome | Microm | HM650 | |
| rabbit polyclonal synuclein Ab | Chemicon | 5038 | 1:5,000 |
| rabbit polyclonal TH Ab | Chemicon | 152 | 1:1,000 |
| Lutetium oxyorthosilicate detector-based FOCUS 220 tomograph | Siemens/ Concorde Microsystems | / | |
| radioligand: 18F-FECT | In house | / | |
| L-dopa: Prolopa 125 | Roche | 6 mg/kg i.p. | |
| DMEM, Glutamax | Life Technologies | N° 31331-093 | |
| Foetal bovine serum | Life Technologies | N° 10270-106 | |
| 25 kD linear polyethylenimine (PEI) | Polysciences | / | |
| OptiPrep Density Gradient Medium: Iodixanol | Sigma | D1556-250ML | |
| Optimen | Life Technologies | N° 51985-026 | |
| Paxinos 1 watston steretactic atlas, fourth Edition | Elsevier | / |
References
- Magen, I., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of Parkinson's disease The state of the art. Prog Brain Res. 183, 53-87 (2010).
- Masliah, E., et al. Dopaminergic loss and inclusion body formation in alpha-synuclein mice: implications for neurodegenerative disorders. Science. 287, 1265-1269 (2000).
- Freichel, C., et al. Age-dependent cognitive decline and amygdala pathology in alpha-synuclein transgenic mice. Neurobiol Aging. 28, 1421-1435 (2007).
- Fleming, S. M., Fernagut, P. O., Chesselet, M. F. Genetic mouse models of parkinsonism: strengths and limitations. NeuroRx. 2, 495-503 (2005).
- Kahle, P. J., et al. Selective insolubility of alpha-synuclein in human Lewy body diseases is recapitulated in a transgenic mouse model. Am J Pathol. 159, 2215-2225 (2001).
- Chesselet, M. F., Richter, F.
- Deroose, C. M., Reumers, V., Debyser, Z., Baekelandt, V. Seeing genes at work in the living brain with non-invasive molecular imaging. Curr Gene Ther. 9, 212-238 (2009).
- Manfredsson, F. P., et al. rAAV-mediated nigral human parkin over-expression partially ameliorates motor deficits via enhanced dopamine neurotransmission in a rat model of Parkinson's disease. Exp Neurol. 207, 289-301 (2007).
- Vercammen, L., et al. Parkin protects against neurotoxicity in the 6-hydroxydopamine rat model for Parkinson's disease. Mol Ther. 14, 716-723 (2006).
- Winklhofer, K. F. The parkin protein as a therapeutic target in Parkinson's disease. Expert opinion on therapeutic targets. 11, 1543-1552 (2007).
- Kirik, D., et al. Parkinson-like neurodegeneration induced by targeted overexpression of alpha-synuclein in the nigrostriatal system. J Neurosci. 22, 2780-2791 (2002).
- Kirik, D., et al. Nigrostriatal alpha-synucleinopathy induced by viral vector-mediated overexpression of human alpha-synuclein: a new primate model of Parkinson's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 100, 2884-2889 (2003).
- Lauwers, E., et al. Neuropathology and neurodegeneration in rodent brain induced by lentiviral vector-mediated overexpression of alpha-synuclein. Brain pathology. 13, 364-372 (2003).
- Klein, R. L., King, M. A., Hamby, M. E., Meyer, E. M. Dopaminergic cell loss induced by human A30P alpha-synuclein gene transfer to the rat substantia nigra. Hum Gene Ther. 13, 605-612 (2002).
- Vander Perren, A., Van den Haute, C., Baekelandt, V. Viral Vector-Based Models of Parkinson's Disease. Curr Top Beh Neurosci. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Longitudinal follow-up and characterization of a robust rat model for Parkinson's disease based on overexpression of alpha-synuclein with adeno-associated viral vectors. Neurobiol Aging. , (2014).
- Van der Perren, A., et al. Efficient and stable transduction of dopaminergic neurons in rat substantia nigra by rAAV 2/1, 2/2, 2/5, 2/6.2, 2/7, 2/8 and 2/9. Gene Ther. , (2011).
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Soueid, J., Nokkari, A., Makoukji, J. Techniques and Methods of Animal Brain Surgery: Perfusion, Brain Removal, and Histological Techniques. Brain Neurotrauma: Molecular, Neuropsychological, and Rehabilitation Aspects. Frontiers in Neuroengineering. , (2015).
- Dale, G. E., et al. Relationships between Lewy bodies and pale bodies in Parkinson's disease. Acta Neuropathol. 83, 525-529 (1992).
- Dawson, V. L.
- Dawson, T., Mandir, A., Lee, M. Animal models of PD: pieces of the same puzzle? Neuron. 35, 219-222 (2002).
- LeVine, H. 3rd Quantification of beta-sheet amyloid fibril structures with thioflavin T. Methods Enzymol. 309, 274-284 (1999).
- Oliveras-Salva, M., et al. rAAV2/7 vector-mediated overexpression of alpha-synuclein in mouse substantia nigra induces protein aggregation and progressive dose-dependent neurodegeneration. Mol Neurodegener. 8, (2013).
