Introduction
جدار الخلية النباتية هو بنية ديناميكية. ويحيط نمو الخلايا بجدار الخلية الأولية، وتنظيم التي تمكن خلايا لتوسيع. الخلايا التي تتوقف عن النمو إيداع جدار الثانوي أكثر جمودا أن يعزز الدعم الميكانيكي للمصنع. وتتكون كل من جدران الخلايا من السليلوز microfibrils جزءا لا يتجزأ من مصفوفة من السكريات هياكل مختلفة (على سبيل المثال، هيميسيلولوز والبكتين) التي تختلف باختلاف المرحلة التنموية المختلفة والأنسجة 1،2. ويتم تصنيع السليلوز كما سلاسل من (1،4) -β-D-جلوكان التي تتماشى بإحكام لتشكيل لييف مكروي من البنية البلورية. يشير السليلوز غير متبلور إلى المناطق التي هي أقل أمر سلاسل جلوكان. النسبة بين البلورية وغير متبلور المجالات هي معلمة واحدة يعتقد أنها تؤثر على الخواص الميكانيكية للجدار الخلية، من خلال توفير القوة الميكانيكية ومميزة اللزجة، على التوالي 3. وكانت العديد من الطرقوضعت لكشف وتحديد هذين الشكلين من ترتيب السليلوز، من بينها حيود الأشعة السينية والاستقطاب عبر / زاوية السحرية الغزل NMR الحالة الصلبة (4). حيود الأشعة السينية يمكن استخدامها لتحديد نسبة البلورية مقابل المجالات السليلوز غير متبلور في العينة 5. يستخدم أسلوب بديل تجزئة محتوى جدار الخلية إلى مواد غير قابلة للذوبان حمض وحمض القابلة للذوبان، للتمييز بين البلورية والسليلوز غير متبلور أو البوليمرات الأخرى، على التوالي. في هذا النهج، ويستخدم إدماج الجلوكوز المسمى ([14 C] الجلوكوز) لقياس 6،7 السليلوز. تتطلب هذه الأساليب كميات كبيرة من المواد النباتية لتحليل الجهاز كله، في أحسن الأحوال، وبالتالي، هي حساسة بشكل كاف لاختلاف الأنسجة محددة في هيكل جدار الخلية. تصور microfibrils السليلوز في قرار الخلوية يمكن أن يتحقق في دراسات التصوير الحية جنبا إلى جنب مع الأصباغ الفلورية 8،9، التي يمكن أن تحدد التغييرات فيتوجه microfibrils السليلوز. ومع ذلك، لا يتم استخدام هذه الأصباغ لتقدير، فهي ليست محددة لالبلورية السليلوز وقد تتداخل مع الهيكل الطبيعي للجدار الخلية 8. Polscope هو تقنية تصوير تعتمد على قدرة السليلوز البلورية لتقسيم أشعة الضوء وتؤخر جزء من ضوء 10. التخلف الضوئية هي أقوى لmicrofibrils التي تقع عموديا على اتجاه انتشار الضوء. لmicrofibrils مع توجه مماثل، وارتفاع درجة تبلور، أكبر ريتاردانس الخفيف 11. وبالتالي، يتم استخدام polscope لدراسة كل المستويات النسبية وتوجيه microfibrils السليلوز.
جذور المعرض النمو الخطي، خلال الخلايا التي تنتج في الخلايا الجذعية المتخصصة، في غيض من الجذر، والخضوع لسلسلة من الانقسامات الخلوية، قبل أن التوسع بسرعة 12. الخلايا التي تشكل جذور توسع في اتجاه واحد (متباين الخواص)الطريقة، وفقا لما تمليه جزيء يشير الهرمونات الصغيرة التي تؤثر على خصائص جدار الخلية 13. ردود الأفعال المختلفة للهرمونات، في الزمان والمكان، وتوفير وسيلة لضمان نمو متوازن الجهاز 14. وبالتالي، تحليل دقة عالية من هيكل جدار الخلية يمكن أن توفر معلومات هامة وضرورية لفهم أفضل للعلاقة بين الاستجابات نوع معين الخلية لنمو الجهاز كله. هنا، نحن تقرير تنفيذ polscope لدراسة تراكم الأنسجة محددة من السليلوز البلورية في جذور نبات الأرابيدوبسيس، كما لوحظ في أقسام التشريحية جودة عالية. هذه الطريقة كشفت مؤخرا نوع معين الخلية تراكم السليلوز البلورية ردا على اضطراب المكاني للنشاط الهرموني 15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. نمو النبات
- السطح تعقيم البذور.
- تعقيم البذور (تصل إلى 30 ملغ) عن طريق أسلوب الرطب أو الجاف. وكمثال على ذلك، لطريقة التعقيم الجاف، إضافة 1 مل الجليدية حمض الهيدروكلوريك 37٪ في 50 مل التبييض، في كوب زجاجي في مجفف مغلق لمدة 4 على الأقل ساعة وحتى ليلة وضحاها. تنفيذ هذه الخطوة في غطاء الكيميائية.
- نشر بذور عقيمة على لوحات مع 0.8٪ أجار مصنع في 0.5X Murashige وسكوغ (MS) متوسطة. التفاف لوحات مع بارافيلم أو الشريط يسهل اختراقها ويغطى بورق الألومنيوم.
- تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة 1-4 أيام لتعزيز إنبات موحدة.
- نقل لوحات لغرفة نمو مناسبة لزراعة شتلات نبات الأرابيدوبسيس. وضع لوحات عموديا للحفاظ على نمو الجذور على رأس المتوسطة أجار ومنع الاختراق.
- الشتلات نقل إلى تثبيتي 7 أيام بعد الإنبات (داج).
2. التثبيت
- تجهيز 50 مل محلول ريتشاردسونن من خلال الجمع بين كميات متساوية من 1٪ البوراكس (وكيل عازلة)، 1٪ الميثيلين الأزرق و 1٪ أزور (الأصباغ النسيجية) في الماء المقطر المزدوج. تصفية عن طريق الحقنة مدفوعة 0.22 ميكرون وحدة PVDF تصفية قبل الاستخدام.
- تجهيز 50 مل من تثبيتي: 1.25٪ غلوتارالدهيد في 0.05 M الصوديوم كاكوديلات (وكيل التخزين المؤقت).
ملاحظة: هذه المواد السامة ويجب التعامل في غطاء الكيميائية. - إضافة 100 ميكرولتر من حل ريتشاردسون (انظر 2.1) إلى حل التثبيت (انظر 2.2) للحصول على حل التثبيت النهائي.
- علامة كل بئر من لوحة 6 جيدا مع اسم عينة المقابلة.
- ضع 2-3 مل من محلول التثبيت النهائي (انظر 2.3) في الآبار، بحيث الشتلات، مرة واحدة نقل، سيتم تغطيتها بالكامل في السائل.
- نقل بعناية، وذلك باستخدام ملقط، تصل إلى 10 شتلة إلى كل بئر. ختم لوحات به Parafilm. تخزينها في 4 درجة مئوية، في الظلام، ليلة واحدة على الأقل، وتصل إلى أسبوع واحد.
3. الجفاف
- <لى> يذوى الشتلات. نقلها بين الآبار من 6 لوحات جيدا جديدة، تحتوي على تركيزات متزايدة من الايثانول، على النحو الوارد هنا: 10٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة. 30٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة. 50٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة. 70٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة. 85٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة. 95٪ من الإيثانول لمدة 15 دقيقة. 95٪ من الإيثانول في 4 درجات مئوية، بين عشية وضحاها، في الحد الأدنى. التعامل مع الشتلات عن طريق الامساك بها بعناية من قبل النبتات، ويفضل مع ملقط البلاستيكية.
4. تسلل
- إعداد المتوسطة تسلل. خلط محتويات 1 كيس من historesin عدة المنشط مع 50 مل عدة الراتنج السائل بسيطة في زجاجة صغيرة. اثارة مع المغناطيس لمدة 20 دقيقة. يجوز إبقاء المتوسطة التسلل عند 4 درجة مئوية لمدة بضعة أسابيع.
- علامة كل بئر من لوحة 6 جيدا جديدة مع اسم عينة المقابلة وملء مع 2-3 مل من المتوسط تسلل.
- نقل الشتلات من الحل الايثانول 95٪ إلى متوسطة تسلل باستخدام ملقط. تأكد من الشتلات هي فوغطت LLY من المتوسط.
- تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة 4 أيام على الأقل، لضمان أقصى قدر من الاختراق في الأنسجة النباتية.
5. إعداد بلوك
- وضع الملصقات الصغيرة، وتميز قلم رصاص مع اسم العينة، داخل كل بئر من تضمين القوالب.
- إعداد تضمين المتوسطة وذلك بإضافة 1 مل تصليب إلى 15 مل المتوسطة تسلل (انظر 4.1). لا تحاول إعداد حجم أصغر من 15 مل، لتجنب المشاكل البلمرة.
- ملء نصف كل بئر في القالب مع 200 ميكرولتر تضمين المتوسطة، وتغطي مع قطعة فيلم علوي قطع لشكل القالب، ولكن لحجم 1 مم أكبر على كل جانب. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة على الأقل، للسماح للبلمرة. لا تتجاوز 5 ساعة.
- إعداد دفعة إضافية من تضمين المتوسطة (انظر 5.2) والحفاظ على الجليد، لتجنب البلمرة بينما يجري ترتيب نصائح الجذرية في القالب.
- قطع كل طرف الجذر تحت نطاق تشريح باستخدام مشرط ووضع بعناية فائقة ط ر: عموديا لمقاطع عرضية أو أفقيا لمقطع طولي، في حوالي 2-3 ملم من العفن المحيط. ملء القالب تماما مع عرقلة الحل والغطاء مع فيلم سماء المنطقة. لاحظ أن عرقلة الحل سوف يتقلص قليلا مرة واحدة تتم بلمرة ذلك.
- الحفاظ على درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة، في الحد الأدنى.
- لتجفيف كتل، ووضع في صندوق مع هلام السيليكا الجافة وترك في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها، في الحد الأدنى.
6. باجتزاء
- إعداد السكاكين الزجاجية من قضبان الزجاج مع صانع سكين. استخدام السكاكين الزجاجية لباجتزاء الأنسجة. قطع قضيب الزجاج في الساحة ومن ثم قطع مربع قطريا لإنتاج سكينين، وذلك باستخدام أداة الماس التهديف.
- كتل القسم إلى 2-3 ميكرون شرائح العرض، وذلك باستخدام آلة باجتزاء. شرائح مكان على شريحة زجاجية، وعلى رأس من قطرات الماء المقطر ووضع الشريحة على كتلة الحرارة المقرر أن حرارة منخفضة (50-60 درجة مئوية)، حتى يتبخر الماء.
الحمار = "jove_title"> 7. الشريحة التحضير للالمستقطبة مجهر
- تمييع الحل ريتشاردسون (انظر 2.1) إلى 0.2٪ من الحل الأصلي واستخدام 1 مل منه لتغطية شرائح. وضع على كتلة الحرارة لمدة 5 ثوان ثم يغسل بالماء المقطر.
- تجف الشريحة على طبق ساخن. مراقبة تحت نطاق تشريح وعلامة الجزء الخلفي من الشريحة مع علامة، للإشارة إلى موقف شرائح من الفائدة، لتسهيل التعرف في وقت لاحق من تحت المجهر.
- إضافة 100 ميكرولتر من تصاعد المتوسطة والغطاء مع زلة غطاء.
8. الحصول على الصور
- ضع الشريحة مغطاة تحتوي على أقسام الجذر تحت مجهر الضوء مجهزة بنظام Polscope مناسبة للحصول على معلومات ريتاردانس ومرشح المستقطب / تدخل البصرية (الشكل 1 م).
- حدد التكبير التي تسمح التصور الواضح للالعينة بأكملها (على سبيل المثال، 40X في هذه الدراسة) وتركيز مجهره على حقل فارغ الذي يحتوي القسم كتلة ولكن لا قسم الجذر. محاولة للعثور على منطقة نظيفة مع عدم وجود العيوب. استخدام هذه المنطقة لضبط الخلفية.
- تعيين نظام التصوير والمعلمات البرنامج: تعيين مجموعة إلى 17 نانومتر. تطبيق "التعرض للسيارات" والحصول على صورة الخلفية من حقل فارغ (انظر 8.2). وتستخدم صورة خلفية واحدة في التجربة.
9. تحليل Polscope من السليلوز لييف مكروي التوجيه
- تحليل المقاطع الطولية.
- ضع شريحة تحتوي على المقاطع الطولية تحت المجهر والحصول على صورة ريتاردانس منه. تركيز المجهر على جزء الجذر من الفائدة. توفير اسم ملف جديد.
- التقاط صورة abrio (صورة مع المعلومات التخلف) من خلال نافذة "لايف Abrio". تأكد من التقاط المقطع الذي يتضمن جدار الخلية، والتي يمكن تحديدها من قبل السليلوز الملون على طول المحيط الخارجي للخلية، كما هو مبين في الشكل 2C.
- تحليل الصور.
- انقر نقرا مزدوجا على الصورة ذات الصلة في كومة الصورة. حدد "لون التوجيه الزائفة" في علامة التبويب "إعدادات العرض".
- لتقدير زاوية السليلوز لييف مكروي، تتناسب مع الظل المماثل من جدار الخلية لأنه في عجلة الألوان.
ملاحظة: عجلة الألوان في الشكل 2C تعكس محور بطيئة من ضوء الكذب على طول ييف مكروي مما يدل على الاتجاه على طول محور طويل من microfibrils. زاوية microfibrils السليلوز هي الزاوية التي أشار إليها اللون والمحور الطويل للخلية. على سبيل المثال، الخلية التطويل في أقحم توضح اللون سماوي، يميل بنحو 90 درجة على محور طويل من الخلايا. - لتحديد متوسط زاوية ييف مكروي في جدار الخلية، واستخدام أداة "ريتاردانس والسمت ختم" من شريط أدوات البرنامج. في حين اختيار الأداة، نقطة وانقر على المنطقة من اهتمام في الصورة التي تم الحصول عليها.
ملاحظة: هذا فيلنتيجة لتر في عرض الزوايا (السمت) في درجة (الشكل 2C). - في الوصول المفتوح الاستقطاب صورة ضوء برامج التحليل البديل والغداء "بول محلل" المساعد من القائمة المساعد. في إطار جديد فتح، حدد "الانكسار" علامة التبويب وفتح ثم حفظ الملف الخلفية وملف الصورة.
- في إطار الصورة، حدد "المواصفات". وضبط "العائد على الاستثمار حجم بكسل" (استخدام 5 بكسل لهذه الدراسة). في "المواصفات". نافذة، حدد "القيم تظهر في الجدول النتيجة".
- استخدام أداة المضلع للاحتفال المنطقة من اهتمام في إطار الصورة. حدد "خطوط التوجيه" للحصول على التوجه للييف مكروي السليلوز.
ملاحظة: سوف ينتج عن هذا العرض من الزوايا (السمت) في درجة.
ملاحظة: متوسط زاوية تحسب واحدة من طريقتين يجب ثم تطبيع لتحديد المواقع من قسم الجذر على طول الشريحة. لتصحيح الانحراف عنالمواقع الأفقي للقسم الجذر كله على طول الشريحة، قياس متوسط زاوية ييف مكروي من جدار الخلية المرافقة الخلية على طول محوره الطويل (أي، عمودي على الباب وعلى طول محور نمو الجذور، الشكل 2C). هذه الزاوية هي 180 ° عندما يتم وضع القسم الجذر بدقة على طول الشريحة. لحساب زاوية لييف مكروي، طرح متوسط قياس زاوية ييف مكروي من جدار الخلية المرافقة من 180 درجة. إضافة الفرق أدى إلى متوسط قياس زاوية ييف مكروي من جدار الخلية التي تقع الشقة على الشريحة.
10. تحليل Polscope من بلوري السليلوز تراكم
- استخدام مستعرض (عبر) أقسام. لاحظ أن تراكم بلوري السليلوز لا يمكن إلا أن تقارن بين الخلايا عندما يتم محاذاة microfibrils السليلوز بها في زاوية مماثلة (كما هو محدد في 9).
- انقر نقرا مزدوجا على الصورة ذات الصلة في كومة الصورة. حدد "Pseudo اللون "في" "علامة التبويب إعدادات العرض.
- لقياس ريتاردانس. التكبير في على الصورة. حدد "منطقة" وعلامة جميع المناطق المثيرة للاهتمام. الانتقال إلى "القياسات" علامة التبويب و"نسخ إلى الحافظة" كل القيم.
- نقل البيانات إلى Excel واستخراج المعلومات المطلوبة (يعني منطقة ريتاردانس). تطبيع البيانات.
ملاحظة: لمراعاة الفروق في سماكة بين شرائح، والتعبير عن القيم النسبية إلى حافة جدار الخلية المحددة في الشريحة. لتطبيع، تقسيم متوسط ريتاردانس المقابلة لجدار الخلية من الفائدة على المتوسط ريتاردانس من جدار الخلية مختلفة في نفس الصورة. على سبيل المثال، تم تطبيع جدار الخلية البشرة الخارجي إلى الداخلي جدار الخلية القشرية في دراستنا.
- نقل البيانات إلى Excel واستخراج المعلومات المطلوبة (يعني منطقة ريتاردانس). تطبيع البيانات.
- تكرار القياسات لا يقل عن 3 أقسام في الجذر، مع ما لا يقل عن 3 جذور في العينة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ندرس تأثير ردود نوع معين الخلية إلى brassinosteroids (BRS)، وذلك باستخدام جذر نبات الأرابيدوبسيس كجهاز نموذج 15-17. عندما يتم استهداف مستقبلات BRI1 BR، في خلفية متحولة bri1، إلى مجموعة فرعية من خلايا البشرة تسمى الخلايا غير الشعر (الشكل 2A، B)، وهو يحول دون توسيع الخلية أحادي الاتجاه من الخلايا المجاورة، ونمو كامل الجذر 15. تم إجراء تحليل Polscope للكشف عن آلية الكامنة وراء هذا تثبيط. فقط، وأظهرت المقاطع الطولية من الجذر تم الحصول عليها من النوع البري ومن خطوط التعبير BRI1 في الخلايا غير الشعر التوجه نحو مماثل من microfibrils السليلوز (الشكل 2C، D، وكما هو موضح في 9.2.3)، مما يتيح مقارنة تراكم النسبي البلورية السليلوز في الخلايا بارضي والتمطيط، وذلك باستخدام المقاطع العرضية التي اتخذت من هذه المناطق (الشكل 2E، F). وأظهر هذا التحليل correlatأيون بين التعبير BRI1 في الخلايا غير الشعر وتراكم المحلي من السليلوز البلورية. وأظهرت متابعة التجارب أن تثبيط خفيف من سينسيز السليلوز من تركيزات منخفضة من isoxaben خفض مستوى السليلوز البلورية في هذه الخلايا، وهذا بدوره، استعادة جزئيا تثبيط النمو، من خلال تشجيع توسيع الخلية أحادي الاتجاه وطول الجذر 15.
الشكل 1: الضوء المستقطب المجهري نظام يتكون النظام Polscope من المجهر الضوئي (A)، ومجهزة بكاميرا CCD الرقمية (B)، محلل والكريستال السائل الخضراء تقع على قمة مصدر الضوء (C) (D). تم استخدام برنامج Abrio لاقتناء الصور وتحليلها. الرجاء انقر هنا رس عرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: تحليل Polscope خلية وول التركيب. (A) قطاعا عريضا من الجذر الرئيسي نبات الأرابيدوبسيس تظهر منظمة شعاعي من الأنسجة المكونة لها. من هذه، وخلايا البشرة غير الشعر (N)؛ وتتميز خلايا الشعر (H) والقشرة (C). بار، 10 ميكرون. (ب) متحد البؤر الصور المجهري جذور التعبير عن BRI1-GFP تستهدف خلايا غير الشعر. الأبيض، PI تلطيخ الذي يصادف الخلايا، أخضر، والتعبير عن BRI1 GFP. بار، 20 ميكرون (C) أقسام طولية من الجذور تم الحصول عليها من النوع البري ومن النباتات معربا عن BRI1 في الخلايا غير الشعر. زاوية microfibrils السليلوز (أي الزاوية بين اللون وخلية محور طويل، مما يعكس محور طويل من الجذر) مشابهة بين الخطين. جدار الخلية المرافقة الخلية على طول ل لوطوقت محور اونج. علامة زاوية تمثل جدار الخلية المظللة التي يقاس. بار، 50 ميكرومتر (D) الكمي من السليلوز زاوية ييف مكروي في جدران الخلايا البشرة. لاحظ التغيرات الشديدة في الزوايا الموجودة في خلايا بارضي (أي منطقة بارضي، MZ) بالمقارنة مع الخلايا في المنطقة الانتقالية (TZ)، التي تتجلى في مؤامرة مربع. متوسط زاوية السليلوز لييف مكروي مماثلة بين نوع البرية والنباتات معربا عن BRI1 في الخلايا غير الشعر تمكن المقارنة من تراكم السليلوز البلورية في خلايا منطقة تنموية المقابلة. يشار إلى متوسط زاوية في كل عينة عن طريق خط أحمر. أقسام (EF) مستعرض الجذرية لهذه الخلفيات محطة نفسها، التي تظهر في وضع ريتاردانس خفيفة. يمثل مقياس اللون ريتاردانس ضوء 0-17 نانومتر. أقسام الموافق النسيج الإنشائي (E) واستطالة تظهر (F) المناطق. بار، 50 ميكرون. على الجدار الخارجي للخلية البشرة والداخليةوطوقت جدار الخلية القشرية. (G) الكمي للقيم ريتاردانس كما تحسب من الصور polscope. يتم التعبير عن القيم كنسبة من ريتاردانس بين جدار الخلية البشرة الخارجي والداخلي جدار الخلية القشرية. لاحظ أن ترسب عالية من السليلوز البلورية في الخلايا غير الشعر في خطوط معربا عن BRI1 في هذه الخلايا فقط. يعني + SE. 40 <ن <600؛ (**) P <0.01. (***) P <0.001 في الذيل اثنين اختبار (ت). اعتمد الرقم وتعديلها من 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، فإننا نقدم وسيلة لتحديد تراكم السليلوز البلورية في الأنسجة المختلفة تتكون جذور نبات الأرابيدوبسيس، مع الحفاظ على المعلومات التشريحية. على هذا النحو، فإنه يوفر خطوة إضافية نحو فهم عمليات النمو في النباتات في قرار الخلوية. هذه الطريقة يمكن تطبيقها أيضا لدراسة الأنواع النباتية إضافية وأجهزة.
ويجب النظر في عدد من النقاط عند تطبيق هذه الطريقة. الأول، تراكم بلوري السليلوز في قسم جذر معين يمكن أن تقارن بين الأنسجة، بين مقاطع من التراكيب الوراثية المختلفة وبين العلاجات إذا توجه microfibrils السليلوز بها مشابه. يتم تحديد التوجه microfibrils السليلوز في المقطع الطولي تحتوي على وجها واحدا من جدار الخلية 18. وبالتالي، فإن سلسلة من المقاطع الطولية، التي تغطي الأنسجة متميزة من الجذور، من الخارجي إلى الداخلي معظم منها، تمكين محللة بياناتهو التوجه microfibrils السليلوز في الأنسجة المختلفة، في مرحلة تنموية معينة. في المثال الموضح هنا، فإن الخلايا الإنشائية في البشرة لديها مجموعة واسعة من microfibrils السليلوز التوجهات بمتوسط microfibrils السليلوز زاوية 140 درجة، في حين أن خلايا التمطيط من البشرة لديها بنية أكثر تنظيما، بمتوسط microfibrils السليلوز زاوية 120 درجة. وكانت هذه القياسات مشابهة بين النوع البري ومتحولة من الفائدة، مما يتيح مقارنة واثقة من تراكم بلوري السليلوز النسبي، في أنواع الخلايا المقابلة والمنطقة التنموية.
ثانيا، وتقلب في عرض المقاطع المختلفة التي يمكن أن تؤثر على مستويات ضوء ريتاردانس قياسها. والتحايل هذا هنا عن طريق تطبيع القياسات ريتاردانس الخام من الأنسجة من الاهتمام (خلايا البشرة) لقياس ريتاردانس من الأنسجة المختلفة (خلايا القشرة). قيم تطبيع عثم قارن ه (انظر الشكل 2E-G).
وأخيرا، المقاطع العرضية على طول الجذر، القبض على مناطق تنموية مختلفة. تحديد هذه المناطق في المقطع العرضي مهم لتفسير البيانات. فقدان الجانبية طبقة الخلايا قلنسوة الجذر الأبعد في القسم يضم علامة منطقة واضحة. بشكل عام، تبدأ الخلايا التوسع السريع الخاصة بهم عندما أقدم خلية من قلنسوة الجذر الوحشي يخضع لبرمجة موت الخلايا، وبعد ذلك، والبشرة غير المحمية تصبح الأنسجة الأبعد 19.
حاليا، الطرق التي توفر قدرا قرار الخلوي من نسبة البلورية مقابل المجالات السليلوز غير متبلور تفتقر. في الواقع، وهذا هو أيضا واحد الحد من الطريقة المعروضة هنا. ومع ذلك، وقدرتها على التواصل تراكم السليلوز البلورية في حد ذاته يمثل تقدما كبيرا، ومستويات عالية نسبيا اعتبارا من السليلوز البلورية المرجح يجعل أكثرجدار الخلية قوية مع زيادة قوة الشد. تطوير أدوات عالية الدقة لتحديد بالضبط تكوين جدار الخلية إلى جانب خصائصه الميكانيكية لا يزال يشكل تحديا في المستقبل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22 mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100 µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
- Cosgrove, D. J.
- Wolf, S., Hematy, K., Hofte, H. Growth control and cell wall signaling in plants. Annu Rev Plant Biol. 63, 381-407 (2012).
- Mazeau, K., Heux, L. Molecular Dynamics Simulations of Bulk Native Crystalline and Amorphous Structures of Cellulose. J. Phys. Chem. B. 107, 2394-2403 (2003).
- Zhao, H., et al. Studying cellulose fiber structure by SEM, XRD, NMR and acid hydrolysis. Carbohydr Polym. 68, 235-241 (2007).
- Fujita, M., et al. Cortical microtubules optimize cell-wall crystallinity to drive unidirectional growth in Arabidopsis. Plant J. 66, 915-928 (2011).
- Peng, F., et al. Fractional separation and structural features of hemicelluloses from sweet sorghum leaves. Bioresources. 7, (2012).
- Xu, S. L., Rahman, A., Baskin, T. I., Kieber, J. J. Two leucine-rich repeat receptor kinases mediate signaling, linking cell wall biosynthesis and ACC synthase in Arabidopsis. Plant Cell. 20, 3065-3079 (2008).
- Anderson, C. T., Carroll, A., Akhmetova, L., Somerville, C. Real-Time Imaging of Cellulose Reorientation during Cell Wall Expansion in Arabidopsis Roots. Plant Physiol. 152, 787-796 (2010).
- Baskin, T. I., Beemster, G. T., Judy-March, J. E., Marga, F. Disorganization of cortical microtubules stimulates tangential expansion and reduces the uniformity of cellulose microfibril alignment among cells in the root of Arabidopsis. Plant Physiol. 135, 2279-2290 (2004).
- Iyer, K. R. K., Neelakantan, P., Radhakrishnan, T. Birefringence of native cellulosic fibers. I. Untreated cotton and ramie. J. Polym. Sci. A-2: Polymer Physics. 6, 1747-1758 (1968).
- Abraham, Y., Elbaum, R. Quantification of microfibril angle in secondary cell walls at subcellular resolution by means of polarized light microscopy. New Phytol. 197, 1012-1019 (2013).
- Petricka, J. J., Winter, C. M., Benfey, P. N.
- Vanstraelen, M., Benkova, E. Hormonal Interactions in the Regulation of Plant Development. Annu Rev Cell Dev Biol. , (2012).
- Singh, A. P., Savaldi-Goldstein, S. Growth control: brassinosteroid activity gets context. J Exp Bot. 66, 1123-1132 (2015).
- Fridman, Y., et al. Root growth is modulated by differential hormonal sensitivity in neighboring cells. Genes Dev. 28, 912-920 (2014).
- Vragovic, K., et al. Translatome analyses capture of opposing tissue-specific brassinosteroid signals orchestrating root meristem differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 923-928 (2015).
- Hacham, Y., et al. Brassinosteroid perception in the epidermis controls root meristem size. Development. 138, 839-848 (2011).
- Gu, Y., et al. Identification of a cellulose synthase-associated protein required for cellulose biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 12866-12871 (2010).
- Fendrych, M., et al. Programmed cell death controlled by ANAC033/SOMBRERO determines root cap organ size in Arabidopsis. Curr Biol. 24, 931-940 (2014).
