Introduction
La paroi de la cellule végétale est une structure dynamique. les cellules en croissance sont entourées d'une paroi cellulaire primaire, dont l'organisation permet aux cellules de se développer. Les cellules qui cessent de croître dépôt d'une paroi secondaire plus rigide qui améliore le support mécanique de la plante. Les deux parois cellulaires sont composées de microfibrilles de cellulose noyées dans une matrice de polysaccharides de structures différentes (par exemple, l' hémicellulose et la pectine) qui varient selon les différents stades de développement et des tissus 1,2. La cellulose est synthétisée sous la forme de chaînes (1,4) -β-D-glucane qui sont étroitement alignées pour former la microfibrilles d'une structure cristalline. cellulose Amorphous fait référence aux régions où les chaînes glucane sont moins ordonnés. Le rapport entre les domaines cristallins et amorphes , est un paramètre pensé à affecter les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire, en offrant une résistance mécanique et les caractéristiques viscoélastiques, respectivement 3. Plusieurs méthodes ont étédéveloppé pour détecter et quantifier les deux formes d'arrangement de cellulose, dont la diffraction des rayons X et de polarisation croisée / l' angle magique RMN du solide 4. Diffraction des rayons X peut être utilisée pour déterminer la proportion des domaines cristallins par rapport à la cellulose amorphe dans l'échantillon 5. Une méthode alternative utilise le fractionnement du contenu de la paroi cellulaire en matière insoluble en milieu acide et soluble dans l'acide, de faire la distinction entre le cristallin et la cellulose amorphe ou d'autres polymères, respectivement. Dans cette approche, l' incorporation de glucose marqué ([14 C] glucose) est utilisé pour quantifier le 6,7 de cellulose. Ces procédés nécessitent de grandes quantités de matériel végétal pour l'analyse d'organes entiers, au mieux, et, par conséquent, ne sont pas suffisamment sensibles à une variation spécifique au tissu dans la structure de la paroi cellulaire. Visualisation des microfibrilles de cellulose à une résolution cellulaire peut être obtenue dans les études d'imagerie en temps réel associées à des colorants fluorescents 8,9, qui peuvent identifier les changements dansl'orientation des microfibrilles de cellulose. Cependant, ces colorants ne sont pas utilisés pour la quantification, ils ne sont pas spécifiques à la cellulose cristalline et peuvent interférer avec la structure normale de la paroi cellulaire 8. Polscope est une technique d'imagerie qui repose sur la capacité de cellulose cristalline pour diviser les faisceaux lumineux et à retarder une partie de la lumière 10. un retard de lumière est la plus forte pour les microfibrilles qui se situent perpendiculairement à la direction de propagation de la lumière. Pour microfibrilles avec une orientation similaire, plus le degré de cristallinité, plus la lumière retardance 11. Par conséquent, polscope est utilisé pour étudier à la fois les niveaux et l'orientation des microfibrilles de cellulose relative.
Roots présentent une croissance linéaire, au cours de laquelle les cellules provenant à la niche de cellules souches, à la pointe de la racine, subir une série de divisions cellulaires, avant de se développer rapidement 12. Les cellules comprenant la racine se développer dans un unidirectionnel (anisotrope)Ainsi, comme dicté par les petites molécules de signalisation des hormones qui ont une incidence sur les propriétés de la paroi de la cellule 13. Réponses différentielles aux hormones, dans le temps et l' espace, constituent un moyen d'assurer une croissance équilibrée de l' organe 14. Par conséquent, l'analyse à haute résolution de la structure de la paroi cellulaire peut fournir des informations importantes nécessaires pour mieux comprendre le lien entre les réponses spécifiques de type cellulaire à la croissance organe entier. Nous rapportons ici la mise en œuvre de polscope pour étudier l' accumulation spécifique de tissu de cellulose cristalline dans les racines d' Arabidopsis, comme observé dans les sections anatomiques de haute qualité. Cette méthode a récemment découvert la cellule accumulation de cellulose cristalline spécifique de type en réponse à une perturbation spatiale de l' activité hormonale 15.
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Protocol
1. Croissance des végétaux
- Stériliser la surface des graines.
- Stériliser les graines (jusqu'à 30 mg) par voie humide ou sèche. A titre d'exemple, pour la méthode de stérilisation à sec, ajouter HCl 1 ml glacial 37% dans 50 ml eau de Javel, dans un récipient en verre dans un dessiccateur fermé pendant au moins 4 heures et jusqu'à la nuit. Effectuez cette étape dans une hotte chimique.
- Etaler les semences stériles sur des plaques avec la gélose végétale de 0,8% en 0.5x Murashige & Skoog (MS). Envelopper les plaques avec Parafilm ou ruban poreux et couvrir de papier d'aluminium.
- Stocker les plaques à 4 ° C pendant 1 - 4 jours pour favoriser la germination uniforme.
- Transférer les plaques dans une chambre convenable pour la culture de plants d'Arabidopsis de croissance. Placer les plaques verticalement afin d'assurer la croissance des racines sur du milieu d'agar et d'empêcher la pénétration.
- plantules de transfert à fixateur 7 jours après la germination (DAG).
2. Fixation
- Préparer 50 ml Richardson Solution en combinant des volumes égaux de 1% Borax (agent tampon), 1% de bleu de méthylène et 1% Azure (colorants histologiques) dans de l'eau distillée deux fois. Filtrer à travers un Seringue Driven 0,22 um PVDF filtre Unité avant utilisation.
- Préparer 50 ml de fixatif: 1,25% de glutaraldéhyde dans du cacodylate de sodium 0,05 M (agent tampon).
Remarque: Ces matériaux sont toxiques et doivent être manipulés dans une hotte chimique. - Ajouter 100 pi de solution Richardson (voir 2.1) à la solution de fixation (voir 2.2) pour obtenir la solution finale de fixation.
- Mark chaque puits d'une plaque à 6 puits avec le nom de l'échantillon correspondant.
- Placez 2 - 3 ml solution finale de fixation (voir 2.3) dans les puits, de sorte que les semis, une fois transférés, seront entièrement couverts en liquide.
- transférer avec précaution, en utilisant une pince, jusqu'à 10 plants à chaque puits. Sceller les plaques à l'aide de Parafilm. Conserver à 4 ° C, dans l'obscurité, pendant au moins une nuit, et jusqu'à une semaine.
3. déshydratation
- <li> déshydrater semis. Transférez entre les puits de nouvelles plaques de 6 puits, contenant des concentrations croissantes d'éthanol, comme indiqué ici: 10% d'éthanol pendant 15 min; 30% d'éthanol pendant 15 min; éthanol à 50% pendant 15 min; éthanol à 70% pendant 15 min; éthanol à 85% pendant 15 min; éthanol à 95% pendant 15 min; 95% d'éthanol à 4 ° C pendant une nuit, au minimum. Traiter les semis en les saisissant avec soin par leurs cotylédons préférables avec des pinces en plastique.
4. infiltration
- Préparer le milieu d'infiltration. Mélanger le contenu de 1 sachet de la historesin kit activateur avec 50 ml Kit de base de résine liquide dans une petite bouteille en verre. Remuer avec aimant pour 20 min. support d'infiltration peut être conservé à 4 ° C pendant quelques semaines.
- Mark chaque puits d'une nouvelle plaque de 6 puits avec le nom de l'échantillon correspondant et remplir avec 2 - 3 ml de milieu d'infiltration.
- Transférer les plantules dans la solution d'éthanol à 95% dans le milieu d'infiltration en utilisant une pince. Assurez-vous que les plants sont fully couverte par le milieu.
- Conserver à 4 ° C pendant au moins 4 jours, afin d'assurer une pénétration maximale dans les tissus végétaux.
5. Bloc Préparation
- Placez de petites étiquettes, crayon marqués avec le nom de l'échantillon, à l'intérieur de chaque puits d'incorporer des moules.
- Préparer l'intégration moyenne en ajoutant 1 ml de durcisseur à 15 ml de milieu d'infiltration (voir 4.1). Ne pas essayer de préparer un volume inférieur à 15 ml, pour éviter les problèmes de polymérisation.
- Remplissez la moitié de chaque puits dans le moule avec 200 ul milieu d'enrobage et couvrir avec un morceau de film en tête coupé à la forme du moule, mais à une taille de 1 mm de plus de chaque côté. Incuber à température ambiante pendant au moins 2 heures, pour permettre la polymérisation. Ne pas dépasser 5 heures.
- Préparer un lot supplémentaire de milieu d'inclusion (voir 5.2) et garder sur la glace, pour éviter la polymérisation en pointes des racines sont disposées dans le moule.
- Couper chaque extrémité de la racine sous un champ de dissection en utilisant scalpel et positionner très soigneusement it: verticalement pour des sections transversales ou horizontalement, de la section longitudinale, à environ 2 - 3 mm de la périphérie du moule. Remplissez le moule complètement avec une solution de blocage et le couvercle avec un film en tête. A noter que la solution de blocage se rétracte légèrement lorsqu'elle est polymérisée.
- Conserver à température ambiante pendant 2 heures, au minimum.
- Pour sécher les blocs, placer dans une boîte de gel de silice sec et laisser à température ambiante pendant la nuit, au minimum.
6. sectionnement
- Préparer des couteaux de verre de tiges de verre avec un fabricant de couteau. Utilisez les couteaux de verre pour la coupe de tissu. Couper la baguette de verre dans un carré et puis couper le carré en diagonale pour produire deux couteaux, en utilisant un outil diamant de notation.
- Section blocs dans 2 - 3 um tranches de largeur, en utilisant une machine de découpe. Placer les tranches sur une lame de verre, sur le dessus de gouttelettes d'eau distillée et placer la lame sur un bloc chauffant à basse température (50 - 60 ° C), jusqu'à évaporation de l'eau.
- Diluer solution Richardson (voir 2.1) à 0,2% de la solution originale et utiliser 1 ml de celui-ci pour couvrir les tranches. Placer sur le bloc thermique pendant 5 secondes, puis laver avec de l'eau distillée.
- Sécher la lame sur une plaque chauffante. Observer sous un microscope de dissection et marquer le dos de la lame avec un marqueur, pour indiquer la position des tranches d'intérêt, afin de faciliter leur identification ultérieure au microscope.
- Ajouter 100 ul de milieu de montage et couvercle avec une lamelle.
8. Image Acquisition
- Placez la lame recouverte contenant les sections de racines sous un microscope optique équipé d' un système Polscope approprié pour obtenir des informations de retardement et un filtre polariseur / interférence optique (Figure 1 AD).
- Sélectionnez un grossissement qui permet une visualisation claire de l'ensemble de l' échantillon (par exemple, 40X dans cette étude) et concentrer le Microscopee sur un champ vide qui contient la section de bloc, mais pas de section de la racine. Essayez de trouver une région propre, sans taches. Utilisez cette région pour définir l'arrière-plan.
- Réglez le système d'imagerie et les paramètres du logiciel: Définir plage à 17 nm. Appliquer "Exposition automatique" et de l'image de fond obtenir du champ vide (voir 8.2). Une image de fond est utilisé par expérience.
9. Polscope Analyse de Cellulose microfibrilles Orientation
- L'analyse des coupes longitudinales.
- Placer une diapositive contenant des sections longitudinales sous le microscope et obtenir une image de retardement de celui-ci. Focaliser le microscope sur une section de racine d'intérêt. Fournir un nouveau nom de fichier.
- Capturer une image a ouvert (image avec des informations de retard) par la fenêtre "Live a ouvert". Être sûr de capturer un article qui comprend la paroi cellulaire, ce qui peut être identifié par la cellulose colorée courant le long de la périphérie de la cellule, comme le montre la figure 2C.
- L'analyse d'image.
- Double-cliquez sur l'image pertinente dans la pile d'images. Sélectionnez "Couleur Orientation pseudo" dans l'onglet "Paramètres d'affichage".
- Pour estimer l'angle cellulose microfibrilles, correspondre à l'ombre correspondante de la paroi cellulaire pour que, dans la roue des couleurs.
NOTE: La roue de couleur à la figure 2C reflète l'axe lent de la lumière se trouvant le long de la microfibrilles qui indique la direction le long de l'axe long des microfibrilles. L'angle de microfibrilles de cellulose est l'angle indiqué par la couleur et l'axe long de la cellule. Par exemple, la cellule d'allongement dans l'encart montre la couleur cyan, incliné d'environ 90 ° par rapport à l'axe long des cellules. - Pour quantifier l'angle des microfibrilles moyenne dans la paroi cellulaire, utiliser l'outil "Retardateur et Azimuth Stamp" de la barre d'outils du logiciel. Tout en sélectionnant l'outil, pointez et cliquez sur la région d'intérêt dans l'image obtenue.
NOTE: Ce will résultat dans l'affichage des angles (azimut) en degrés (figure 2C). - Dans un accès ouvert polarisé logiciel d'analyse d'images de lumière alternative, le déjeuner plugin "Pol-Analyzer" dans le menu du plugin. Dans la nouvelle fenêtre ouverte, sélectionnez l'onglet et ouvert "biréfringence" et puis enregistrez le fichier d'arrière-plan et le fichier d'image.
- Dans la fenêtre d'image, sélectionnez "Caractéristiques". et ajuster la «taille de pixel de retour sur investissement '(utilisation de 5 pixels pour cette étude). Dans le "Specs." fenêtre, sélectionnez "Afficher les valeurs dans le tableau de résultats".
- Utilisez l'outil Polygon pour marquer la zone d'intérêt dans la fenêtre d'image. Sélectionnez "Lignes d'orientation" pour obtenir l'orientation de la microfibrilles de cellulose.
NOTE: Cela se traduira par l'affichage des angles (azimut) en degrés.
Remarque: L'angle calculé par une moyenne des deux méthodes doivent ensuite être étalonnée par rapport à la position de la section de base le long de la glissière. Pour corriger l'écart dele positionnement horizontal de la partie entière de la racine le long de la glissière, quantifie l'angle de microfibrilles moyenne de la paroi de la cellule adjacente à la cellule le long de son axe (qui est perpendiculaire à la section et le long de l'axe de croissance de la racine, la figure 2C). Cet angle est de 180 °, quand la partie de pied est positionné avec précision le long de la glissière. Pour le calcul de l'angle de microfibrilles, soustraire l'angle de microfibrilles moyenne mesurée de la paroi cellulaire flanquant de 180 °. Ajouter la différence abouti à l'angle de la paroi cellulaire de microfibrilles moyenne mesurée qui repose à plat sur la diapositive.
10. Polscope Analyse de Crystalline Cellulose Accumulation
- Utilisez les sections transversales (croisées). Notez que l'accumulation de la cellulose cristalline ne peut être comparée entre les cellules lorsque leurs microfibrilles de cellulose sont alignées à un angle similaire (tel que déterminé à 9).
- Double-cliquez sur l'image pertinente dans la pile d'images. Sélectionnez "Pseudo couleur "dans l'onglet" Paramètres d'affichage ".
- Pour mesurer retardance. Zoom-in sur l'image. Sélectionnez "Région" et marquer toutes les régions d'intérêt. Déplacer vers l'onglet "mesures" et "Copy to Clipboard" toutes les valeurs.
- Transférer les données vers Excel et d'extraire les informations requises (région de retardance moyenne). Normaliser les données.
NOTE: Pour tenir compte des différences d'épaisseur entre les tranches, d'exprimer les valeurs relatives à un bord de la paroi cellulaire spécifique dans la diapositive. Pour normaliser, diviser la retardance moyenne correspondant à la paroi cellulaire d'intérêt par la retardance moyenne d'une paroi cellulaire différente dans la même image. Par exemple, la paroi cellulaire de l'épiderme externe a été étalonnée par rapport à la paroi de la cellule corticale interne dans notre étude.
- Transférer les données vers Excel et d'extraire les informations requises (région de retardance moyenne). Normaliser les données.
- Répétez les mesures pendant au moins 3 sections par racine, avec un minimum de 3 racines par échantillon.
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Representative Results
Nous étudions l'impact des réponses spécifiques de type cellulaire pour brassinostéroïdes (BRS), en utilisant la racine de Arabidopsis comme un organe de modèle 15-17. Lorsque le récepteur BRI1 BR est ciblée, dans le fond de BRI1 mutante, à un sous - ensemble des cellules de l' épiderme , appelées cellules non capillaires (figure 2A, B), il inhibe l' expansion des cellules unidirectionnel de cellules voisines, et la croissance toute la racine 15. analyse Polscope a été réalisée pour révéler le mécanisme sous-jacent de cette inhibition. Des sections longitudinales de la racine obtenue à partir de type sauvage et des lignes exprimant BRI1 dans les cellules non-cheveux seulement, ont montré une orientation similaire de microfibrilles de cellulose (figure 2C, D, et comme expliqué dans 9.2.3), ce qui permet la comparaison de l'accumulation relative de cristallin cellulose dans les cellules méristématiques et d' allongement, en utilisant des sections transversales prises à partir de ces zones (Figure 2E, F). Cette analyse a montré un corrélations entre l'expression de BRI1 dans les cellules non-cheveux et une accumulation locale de cellulose cristalline. Suivi des expériences ont montré que l' inhibition modérée de la cellulose synthase par de faibles concentrations de isoxaben a abaissé le niveau de la cellulose cristalline dans ces cellules, qui à son tour, partiellement restauré inhibition de la croissance, en favorisant l' expansion des cellules unidirectionnelle et la longueur des racines 15.
Figure 1:. Polarized système Light Microscopy Le système Polscope se compose d'un microscope optique (A), équipé d'une caméra numérique CCD (B), un analyseur et un cristal liquide vert situé sur le dessus de sa source de lumière (C) (D). logiciel a ouvert a été utilisée pour l' acquisition et l' analyse d' images. S'il vous plaît cliquez ici to voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: Analyse de la composition Polscope de la paroi cellulaire. (A) Coupe de la racine primaire Arabidopsis montrant l' organisation radiale de ses tissus constitutifs. Parmi ceux-ci, les cellules épidermiques non-cheveux (N); les cellules ciliées (H) et le cortex (C) sont marqués. Bar, 10 um. (B) des images de microscopie confocale de racines exprimant BRI1-GFP ciblées aux cellules non-cheveux. Blanc, PI coloration qui marque les cellules, vert, expression BRI1-GFP. Bar, 20 um. (C) des sections longitudinales des racines obtenues à partir de type sauvage et de plantes exprimant BRI1 dans les cellules non-cheveux. L'angle de microfibrilles de cellulose ( par exemple, l'angle entre la couleur et de l' axe long cellulaire, ce qui reflète l'axe long de la racine) est similaire entre les deux lignes. La paroi cellulaire flanquant la cellule le long de son laxe ong est encerclé; angle marque représente la paroi cellulaire ombragé qui est mesurée. Bar, 50 um. (D) Quantification de l' angle de microfibrilles de cellulose dans les parois des cellules de l' épiderme. Notez la grande variabilité des angles présents dans les cellules méristématiques (ie, zone méristématique, MZ) par rapport à des cellules dans la zone de transition (TZ), comme en témoigne la boîte à moustaches. L'angle cellulose microfibrilles moyenne similaire entre le type et les plantes sauvages exprimant BRI1 dans les cellules non-cheveux permet la comparaison de l'accumulation de la cellulose cristalline dans les cellules de leur zone de développement correspondant. L'angle moyen dans chaque échantillon est indiquée par une ligne rouge. Sections (EF) Transverse profondes de ces mêmes milieux de plantes, montrées en mode retardateur de lumière. échelle de couleur représente retardance lumière de 0-17 nm. Les articles correspondant à la méristème (E) et de l' allongement (F) zones sont indiquées. Bar, 50 um. La paroi cellulaire de l'épiderme externe et interneparoi cellulaire corticale sont encerclés. (G) Quantification des valeurs de retardement tel que calculé à partir des images de polscope. Les valeurs sont exprimées comme le rapport de retardement entre la paroi cellulaire de l'épiderme externe et la paroi interne de la cellule corticale. On notera que le haut dépôt de la cellulose cristalline dans des cellules non ciliées de lignées exprimant BRI1 uniquement dans ces cellules. Moyenne + SE; 40 <n <600; (**) P <0,01; (***) P <0,001 dans un t-test bilatéral. Le chiffre a été adopté et modifié à partir de 15. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous présentons une méthode de détermination de l'accumulation de cellulose cristalline dans les différents tissus composant les racines d' Arabidopsis, tout en conservant les informations anatomiques. En tant que tel, il fournit une étape supplémentaire vers la compréhension des processus de croissance des plantes à une résolution cellulaire. Cette méthode peut également être appliquée pour l'étude des espèces et des organes végétaux supplémentaires.
Un certain nombre de points doivent être considérés lors de l'application de la méthode. Tout d'abord, l'accumulation de la cellulose cristalline dans une section de racine donnée peut être comparée parmi les tissus, entre les sections de différents génotypes et entre les traitements, si l'orientation de leurs microfibrilles de cellulose est similaire. Les microfibrilles de cellulose orientation est déterminée en coupe longitudinale contenant une face de la paroi cellulaire 18. Par conséquent, la série de sections longitudinales distinctes couvrant les tissus des racines, de l'extérieur vers l'intérieur plus petits, permettent analysest de l'orientation des microfibrilles de cellulose dans les différents tissus, à un stade de développement donné. Dans l'exemple représenté ici, les cellules méristématiques de l'épiderme ont un large éventail de microfibrilles de cellulose orientation avec un angle moyen de microfibrilles de cellulose de 140 °, tandis que les cellules d'allongement de l'épiderme ont une structure plus organisée, avec un angle moyen des microfibrilles de cellulose de 120 °. Ces mesures étaient similaires entre le type sauvage et le mutant d'intérêt, permettant ainsi une comparaison sûrs de leur rapport d'accumulation de la cellulose cristalline, dans les types de cellules correspondantes et de la zone de développement.
En second lieu, la variabilité de la largeur des sections différentes peuvent influer sur les niveaux de lumière retardance mesurées. Ceci est contournée ici en normalisant les mesures de retardance brutes du tissu d'intérêt (cellules épidermiques) pour la mesure de retardement d'un tissu différent (cellules du cortex). Les valeurs normalisées are ensuite comparé (voir la figure 2E-G).
Enfin, les sections transversales le long de la racine, capturent différentes zones de développement. L'identification de ces zones dans la section transversale est importante pour l'interprétation des données. La perte de la couche cellulaire la plus externe latérale de coiffe dans la section comprend un marqueur de zone franche. En général, les cellules commencent leur expansion rapide lorsque la cellule la plus ancienne de la capsule latérale racine subit la mort cellulaire programmée, après quoi, l'épiderme non protégés devient le tissu le plus extérieur 19.
À l'heure actuelle, les procédés qui fournissent une mesure de la résolution cellulaire du rapport du cristallin par rapport aux domaines de la cellulose amorphe font défaut. En effet, cela est également une limitation de la méthode présentée ici. Cependant, sa capacité à communiquer l'accumulation de cellulose cristalline en tant que telle est un progrès important, les niveaux relatifs élevés que la cellulose cristalline rend probablement plusparoi cellulaire robuste, avec une résistance accrue à la traction. Développement d'outils à haute résolution pour déterminer précisément la composition de la paroi cellulaire aux côtés de ses propriétés mécaniques reste un défi pour l'avenir.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Murashige & Skoog (MS) | Duchefa | M0221 | |
| Borax | LOBA CHEMIE | 6038 | |
| Methylene blue | Sigma | M-9140 | |
| Azure | Sigma | 861065 | |
| Syringe Driven 0.22 mm PVDF Filter | MILLEX-GV | ||
| Glutaraldehyde | EMS | 16220 | |
| Sodium Cacodylate | Sigma | C-0250 | |
| Leica kit historesin | Leica | 7022 18 500 | |
| embedding molds | Agar Scientific | AGG3530 | |
| film 100 µ P.P.C. | www.Jolybar.com | overhead film | |
| Knivemaker | LKB | 7800 | |
| Ultratome III | LKB | 8800 | Ultratome |
| Shandon immumount | Thermo | 9990402 | mounting medium |
| light microscope | Nikon | Eclipse 80i | |
| Abrio imaging system | CRI | Abrio imaging system | |
| Abrio V2.2 software | CRI | Abrio V2.2 software | |
| Open access polarized light image analysis software | OPS | OpenPolScope | http://www.openpolscope.org/ |
References
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