Summary
Abbiamo stabilito una tecnica per l'isolamento, la caratterizzazione fenotipica e analisi funzionale di cellule immuni dalla gengiva murino.
Introduction
Tessuti gengivali circondano la dentatura murino e umano e sono costantemente esposti al complesso biofilm del dente 1. La rete di cellule immunitarie sorvegliare la barriera gengivale è fondamentale per mantenere l'integrità del tessuto, garantendo omeostasi con i microbi commensali locali e, al tempo stesso, assicura immunità efficace contro sfida patogenicità 2. Per raggiungere l'omeostasi, il sistema immunitario è attentamente su misura per l'ambiente gengivale creazione di una rete di cellule immunitarie altamente specializzato, ma piccolo dettaglio si sa delle popolazioni di cellule immunitarie gengivali e il loro ruolo nel mantenimento del tessuto immunità 2.
Quando l'omeostasi immunitaria è interrotta alla gengiva, sia attraverso una maggiore suscettibilità dell'ospite e / o la presenza di comunità microbiche disbiosico, una condizione infiammatoria, la parodontite si pone 3 4. La parodontite è una malattia infiammatoria comune, con conseguente perdita del dente sstrutture upporting. Nelle sue forme più gravi si è visto in circa il 10% della popolazione generale 5. Analisi dei fattori chiave coinvolti nella predisposizione e nella progressione della parodontite si è dimostrato difficile 6. Tuttavia, i modelli animali sono stati estremamente utili per la comprensione dei meccanismi di iniziazione parodontite e la progressione 7. I modelli possono essere utilizzati per definire le popolazioni di cellule chiave e mediatori molecolari che sono vitali per il mantenimento dell'omeostasi immunitario e lo sviluppo di auto di periodontite. Tale intuizione trasformerà la nostra comprensione di controllo specifico-gengiva di omeostasi immunitaria e ulteriormente la nostra attuale comprensione della patogenesi della malattia.
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Protocol
Tutte le procedure sperimentali descritte in questo protocollo seguite le linee guida necessarie e sono stati approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa, NIDCR / NIH.
1. preparare in anticipo
- Preparare supporti Completa: RPMI integrato con 2 mM L-glutammina, 100 unità / ml di penicillina, 100 ug / ml di streptomicina e il 10% FBS.
- Preparare supporti DNase: 50 ml di media RPMI con 7,5 mcg DNasi (Fai fresca, tenere in ghiaccio in ogni momento).
- Preparare supporti Collagenasi-DNasi: 5 ml di media DNasi oltre 3,2 mg / ml di Collagenasi di tipo IV (Fai fresca, tenere in ghiaccio in ogni momento).
- Pre-cool tampone FACS: 0,5% FBS diluito in PBS.
- centrifuga pre-raffreddare a 4 ° C.
- Warm agitatore incubatore a 37 ° C.
2. Isolamento, Dissection, e l'isolamento delle cellule da gengivali Blocks
- Euthanize topi esponendo loro di CO 2 in una camera adeguata, secondo le linee guida ARAC. <li> Aprire la cavità toracica e addominale per esporre il cuore e gli organi interni. Per profumato, fare un'incisione nella vena cava inferiore e profumato 3 ml di PBS attraverso il ventricolo sinistro utilizzando una siringa da 3 ml con un ago 27 G.
- Immobilizzare il corpo e la testa del mouse su un blocco con lo stomaco rivolto verso l'alto.
- Tagliare ogni commessura del labbro verso il collo con le forbici, separando la pelle che copre la mandibola e collo regione, esponendo i tessuti sottostanti e muscoli. Sezionare il labbro inferiore per scoprire la mandibola.
- Tagliare tra gli incisivi inferiori per separare entrambi i lati della mandibola e immobilizzare ogni lato per accedere alla cavità orale.
- Visualizzare e sezionare il palato lontano dalla cavità nasale.
- Sezionare aree utilizzando una lama di 10 e comprendono aree molari mascellari e mandibolari con circostante gengiva (Figura 1). Fare incisioni verticali appena anteriore al primo molare e posteriore per il terzo molare e una incisione orizzontaleil bordo della gengiva (colletto bianco del tessuto denti circostanti).
- Posizionare il mascellare e mandibolare blocchi in un tubo da 50 ml con 5 ml Collagenasi / DNasi (tenere in ghiaccio).
- Incubare in un incubatore shaker a 37 ° C per 1 ora e durante gli ultimi 5 min di incubazione aggiungere 50 ml di 0,5 M EDTA.
- Aggiungere 5 ml di media DNasi freddo per il tubo da 50 ml con i tessuti e mescolare delicatamente per mescolare.
- Trasferire i 4 blocchi di tessuto in una capsula di Petri e coprire con 500 ml di DNasi media. Rimuovere gengiva da ciascun blocco di tessuto, utilizzando un bisturi e indicando la lama nelle aree gengivali e interdentali.
- Trasferire i tessuti e il supporto dalla capsula di Petri, nonché i mezzi di DNasi precedenti utilizzate durante la dissezione, in un tubo da 50 ml attraverso il filtro cella (70 micron dimensioni). Lavare con supporti DNasi (3-5 ml) tutti gli strumenti utilizzati e filtro.
- Utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile da 3 ml, schiacciare il tessuto contro il filtro,filtraggio con i media DNasi fredda (da 30 a 35 ml).
- Lavare il filtro cella con i media DNasi freddo.
- Centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 6 min.
- Eliminare il surnatante, risospendere in 1 ml di completo media.
- Contare le cellule (la quantità prevista dovrebbe variare tra 8 x 10 5 1,2 x 10 6 cellule con una vitalità> 80%) usando un contatore automatico di cellule.
3. Stimolazione e FACS colorazione delle cellule gengivali
- Stimolare la sospensione cellulare singola con PMA (50 ng / ml) e Ionomicina (2,5 mcg / ml) in presenza di 1 microlitri / ml di brefeldin A.
- Incubare per 3,5 ore a 37 ° C e 5% CO 2.
- Spin giù e lavare con PBS e centrifugare a 4 ° C; 314 xg per 6 min.
- Macchiare le cellule utilizzando una macchia vitalità seguendo le istruzioni del produttore.
- Stain di marcatori extracellulari (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ o formicaibodies di scelta) a seguito le istruzioni del produttore.
- Lavare le cellule con tampone a freddo FACS e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min.
- Delicatamente vortice di disturbare il pellet.
- Fissare le cellule con paraformaldeide al 2% per 20 min a temperatura ambiente.
- Lavare le cellule con tampone freddo FACS, centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min e colorare per citochine intracellulari.
- Riempire i tubi FACS con una soluzione di fredda saponina 0,5% diluito in tampone FACS e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min.
- Aggiungere 300 pl di soluzione di saponina 0,5% ai tubi FACS, incubare per 15 minuti al buio a 4 ° C e quindi si centrifuga a 4 ° C, 314 xg per 5 min.
- Colorare le cellule per markers intracellulari (IL-17A e IFNγ o citochine di scelta) seguito le istruzioni del produttore. Lavare le cellule con soluzione di saponina 0,5% e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min.
- Lavare nuovamente con FACSbuffer e centrifugare a 4 ° C, 314 xg per 5 min.
- Risospendere le cellule in 300 ml di tampone FACS.
- Analizzare i risultati su un citometro di flusso.
4. Flusso Analisi Citometria
- Visualizzare le cellule da analizzare in avanti (FSC) e side scatter (SCC) e porta ad escludere detriti.
- Selezionare le celle singole con zona forward scatter (FSC-A) vs. altezza parametri (FSC-H).
- Cellule gate che sono in diretta (come indicato dalla redditività colorazione) e positiva per il marcatore ematopoietiche CD45 + per ulteriori analisi (Figura 2A e 2C).
- Continuare analisi di marcatori specifici come mostrato in Figura 2 e Figura 3.
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Representative Results
Per illustrare l'applicazione del protocollo, si mostra risultati rappresentativi esaminando la rete delle cellule immunitarie nella gengiva di topi con e senza parodontite (WT vs LFA - / -, Figura 2a - C). FACS Rappresentante grafici mostrano le cellule CD45 + ematopoietiche dal vivo nella gengiva (Figura 2A, 2C). L'isolamento e la trasformazione delle cellule immunitarie con questo protocollo rendimenti cellule sufficienti per eseguire ex vivo la stimolazione e la caratterizzazione di modelli di secrezione di citochine. Qui mostriamo IL-17 e IFN-γ colorazione in cellule CD45 + totali in stato stazionario (WT) e in topi esibendo parodontite (a causa di deficit di LFA) (Figura 2B - D). Questi dati rivelano il potenziale di questa tecnica per catturare profili citochine durante tissue stato stazionario (WT) e nel contesto di periodontite locale (LFA - / -). in mice suscettibile di parodontite si caratterizza ulteriormente la composizione delle cellule immunitarie gengivale particolare della cellula T e compartimenti cellulari innata linfoide (ILC) (Figura 3a - B). Siamo stati in grado di definire la produzione di IL-17 e IFN-γ all'interno della cellula T + TCRβ + CD4, cellule T CD8 + TCRβ, cellule T TCRγδ, NK e scomparti ILC (Figura 3C).
Figura 1:. Isolamento di gengiva murine illustrativa dimostrare i confini di dissezione nella mascella e il segmento gengivale isolato da utilizzare per la dissezione del tessuto gengivale. (B) Segmento di murino mascellare superiore (area molare) con il profilo per il blocco dissezione e blocco isolato. Ematossilina e eosina (H & E) di un segmento molare mascellare con gengiva l tessuti descritti è mostrata in basso (C) e superiori ingrandimento nella (D). Ingrandimenti originali indicate. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: dati FACS rappresentativi per la produzione di citochine da cellule gengivali. (A - C) FACS trama mostrando cancello per CD45 + cellule vive in preparazioni di cellule del mouse gengivali seguenti ex vivo ri-stimolazione con PMA e ionomicina nel WT e LFA - / -. (B - D) trame FACS rappresentativi mostrano IFN-γ e IL-17 colorazione in totale cellule CD45 + mouse dalla gengiva di topi con / senza periodontite (a causa di LFA-deficit).iles / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3:. La produzione di citochine da parte delle popolazioni immunitarie gengiva infiammata (A) diagramma rappresentante FACS mostrando colorazione per TCRβ contro TCRγδ gating sulle cellule CD45 +. Gating sulle cellule TCRβ +, la trama centrale mostra CD4 rispetto TCRβ colorazione (consente per l'analisi delle cellule T CD4 + TCRβ, cellule T CD8 + TCRβ e le cellule T + TCRγδ). Gating su TCRβ - TCRγδ - cellule, la trama destra mostra CD45 contro NK1.1 colorazione (consente per l'analisi delle cellule NK). (B) Rappresentante FACS trama mostrando colorazione per CD90.2 gating su CD45 + lineage cellule negative (CD3- CD19 - NK1.1 - CD11c - CD11b - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -), che identifica le cellule linfoidi innate. (C) trame FACS rappresentativi mostrano IFN-γ e IL-17 colorazione in popolazioni di cellule identificate. Preparati gengivali sono da 20 settimane di età LFA - / - mice che sviluppano parodontite; i dati sono rappresentativi di tre esperimenti indipendenti. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
L'attuale tecnica produce con successo un gran numero di cellule immunitarie (da un singolo mouse) adatto, non solo per la caratterizzazione fenotipica, ma anche per studi funzionali ex vivo. Un altro gruppo aveva già pubblicato un protocollo per isolare e caratterizzare le cellule immunitarie murino gengivali e ha introdotto il valore di usare multicolore citometria a flusso nello studio di parodontite in modelli animali 9. A seguito di una notevole risoluzione dei problemi della modifica chiave in questo protocollo è stato quello di comprendere la dissezione di interi blocchi di tessuto al fine di includere entrambe le aree colletti gengivali e gengiva interdentale (Figura 1). Con solo dissezione gengivale, spesso lembi a tutto spessore non vengono raggiunti e parte della gengiva è mancato in particolare nelle zone interdentali. Usando questo approccio, il numero di cellule immunitarie raccolte sono notevolmente aumentati. Questa tecnica consente inoltre di isolamento ottimale dei tessuti gengivali sia da un mascellared mandibola.
passaggi critici di questo protocollo includono una dissezione conservatore di aree gengivali e un tasso efficace di dissezione. In particolare, i blocchi di tessuto devono essere sezionati per includere solo il tessuto minime intorno ai denti (gengive) e nei tessuti non buccali. I blocchi devono essere sezionati in modo rapido e tessuti e cellule dovrebbero rimanere sul ghiaccio per garantire la vitalità delle cellule ottimale.
Ai fini della risoluzione dei problemi, è importante notare che la bassa resa di cellule può essere legata al tempo insufficiente di incubazione con collagenasi, concentrazioni inappropriate di collagenasi e / o dissezione inadeguata della gengiva dai blocchi di tessuto. In tal senso, la dissezione di gengiva con occhialini ingrandimento (2X-6X) può essere utile. Basso vitalità delle cellule può essere correlato al ritardo nella procedura e di media, tamponi e le cellule non rimangono costantemente sul ghiaccio.
Limitazioni di questo protocollo, inerenti al tipo di tessuto dissected è la dimensione dei tessuti gengivali, rispetto ad altri siti barriera anatomica studiata (es. pelle o del tratto gastrointestinale) in cui sono disponibili i tessuti più grandi.
Tuttavia, la tecnica qui presentata ci ha permesso di caratterizzare le popolazioni di cellule dominanti nel LFA - / - modello che spontaneamente sviluppato parodontite. In LFA - / - mice abbiamo identificato un dominante IL-17 firma citochina durante lo sviluppo della parodontite 10. Utilizzando multicolore analisi di citometria di flusso siamo stati in grado di definire le fonti cellulari di IL-17 11. In questa impostazione IL-17 malattia è stata prodotta dalle cellule TCRγδ T, cellule T CD4 + e cellule linfoidi innate (ILC) a livello locale all'interno della gengiva 10.
Con il numero sostanziale di cellule isolate con questa metodologia e la capacità di identificare anche piccole sottopopolazioni, sarà ora possibile sviluppare una vasta capireing della rete di cellule immunitarie specializzate salvaguardare l'integrità barriera gengivale. Questa intuizione critica ci permetterà di valutare le risposte immunitarie nell'ambiente gengivale. Utilizzando questa tecnica possiamo ora procedere per isolare componenti specifiche della rete di cellule immunitarie gengiva per l'ordinamento delle cellule citometria a flusso, permettendo analisi e caratterizzazioni ulteriori da intraprendere.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
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