Summary
우리는 분리, 표현형 특성화 및 쥐의 잇몸에서 면역 세포의 기능 분석을위한 기술을 설립했다.
Introduction
치은 조직은 인간 및 뮤린 치열을 둘러싸고 끊임없이 티스 (1)의 복잡한 생물막에 노출된다. 치은 배리어 치안 면역 세포 망은 병원성이 챌린지에 대한 효과적인 면역성을 제공하는 동시에, 조직의 무결성을 유지하는 로컬 공생 미생물과 항상성을 보장하고 필수적이다. 항상성을 달성하기 위해, 면역 시스템은 신중 아직 작은 디테일이 치은 면역 세포군 및 조직 내성 (2)를 유지하는 역할로 알려진 고도로 전문화 면역 세포 망을 생성 치은 환경에 맞게 조정된다.
면역 항상성이 치은에 중단되면, 어느 증가 호스트 감수성 및 / 또는 dysbiotic 미생물 지역 사회, 염증 상태의 존재를 통해, 치주염 3 (4)를 발생한다. 치주염은 치아의 손실로 이어지는 일반적인 염증성 질환입니다upporting 구조. 그것의 심한 형태는 일반 인구 (5)의 약 10 %에서 볼 수있다. 치주염 감수성과 진행에 관여하는 중요한 요소를 해부하는 것은 6 어려운 입증했다. 그러나, 동물 모델은 치주염 개시 및 진행 (7)의 메커니즘을 이해하는데 매우 유용 하였다. 모델 면역 항상성 및 치주염의 구동 발전을 유지하는데 필수적인 주요 세포 집단과 분자 매개체를 정의하는데 이용 될 수있다. 이러한 통찰력은 면역 항상성의 치은 특정 제어에 대한 우리의 이해를 변환 및 질환 발병의 우리의 현재 이해를 촉진 할 것이다.
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Protocol
이 프로토콜에 설명 된 모든 실험 절차는 필요한 가이드 라인을 따라 기관 동물 관리 및 사용위원회, NIDCR / NIH에 의해 승인되었다.
1. 사전에 준비
- 전체 미디어 준비 : RPMI가 2 mM L- 글루타민, 100 단위 / mL 페니실린, 100 μg / mL 스트렙토 마이신 및 10 % FBS가 보충.
- 7.5 μg의 DNase의 보충 RPMI 미디어의 50 ㎖ (신선한 확인 항상 얼음에 보관) : DNase의 미디어를 준비합니다.
- DNase의 미디어 플러스 3.2 밀리그램 / 콜라게나 유형 IV ml의 5 ㎖ (신선한 확인 항상 얼음에 보관) : 콜라게나-DNase의 미디어를 준비합니다.
- 사전 멋진 FACS 버퍼 : PBS에 희석 0.5 % FBS.
- 4 ° C에서 미리 냉각 원심 분리기.
- 37 ° C까지 따뜻한 진탕 배양기.
잇몸 블록 2. 절연, 해부 및 세포 분리
- ARAC 지침에 따라, 적절한 챔버 내에 2 CO에 노출하여 마우스를 안락사. <리>는 마음과 내부 장기를 노출 흉부와 복강을 엽니 다. 관류하기 위해, 하대 정맥의 절개를하고, 27 G 바늘 3 ML의 주사기를 사용하여 좌심실을 통해 PBS의 3 ㎖을 관류.
- 이 위를 향 위장 패드에 몸과 마우스의 머리를 고정.
- 기본 조직과 근육을 노출, 하악과 목 영역을 커버하는 피부를 분리, 가위로 목을 향해 입술의 각각의 접합면을 잘라. 하악을 밝히기 위해 아랫 입술을 해부하다.
- 하부 앞니 사이 절단하는 하악골의 양측을 분리하고 구강에 액세스하는 각각의면을 고정한다.
- 시각화 멀리 비강에서 미각을 해부하다.
- 10 블레이드를 사용하여 영역을 해부 및 치은 (그림 1) 주변과 상악과 하악 몰 영역을 포함한다. 수직 절개 단지 첫 번째 대구치 후방 세 번째 몰에 수평 절개시에 전방 확인잇몸의 경계 (조직 주변 치아의 화이트 칼라).
- 5 ml의 콜라게나 / DNase의 (얼음 유지)와 50 ML 원뿔 튜브에 상악과 하악 블록을 배치합니다.
- 1 시간 동안 37 ℃에서 진탕 배양기에서 배양 및 배양의 마지막 5 분 동안 0.5 M EDTA의 50 μl를 추가합니다.
- 조직에 50 ㎖ 튜브에 차가운 DNase의 미디어의 5 ML을 추가하고 부드럽게 섞어 소용돌이 친다.
- 페트리 접시에 조직의 4 블록을 전송하고 DNase의 미디어의 500 μL로 커버. 메스 블레이드를 사용하여 치은과 치간 영역으로 블레이드를 가리키는 조직의 각 블록에서 잇몸을 제거합니다.
- 셀 스트레이너 (70 ㎛의 크기)를 통해 새로운 50 ㎖ 튜브, 페트리 접시뿐만 아니라 해부시 사용 이전 DNase의 매체에서 조직 및 미디어 전송. DNase의 미디어 (3-5 ml)에 사용 된 악기와 필터의 모든 씻으시오.
- 멸균 3 ML의 주사기의 플런저를 사용하여, 스트레이너에 조직을 매쉬차가운 DNase의 미디어 (30-35 ml)로 필터링.
- 차가운 DNase의 미디어와 셀 스트레이너를 씻으십시오.
- 4 ° C에서 원심 분리기, 6 분 동안 314 XG.
- 상층 액을 버리고, 전체 미디어의 1 ㎖에 다시 일시 중지합니다.
- 세포 카운트를 자동 세포 계수기를 사용하여 (예상 사용량은> 80 %의 생존 6 10 1.2 × 5-10 × 8 세포 사이의 범위한다).
잇몸 세포의 3 자극 및 FACS 염색
- Brefeldin A의 1 μL / ㎖의 존재하에 PMA (50 NG / ml) 및 이오 노마 이신 (2.5 μg의 / mL)로 단일 세포 현탁액을 자극
- 37 ° C에서 3.5 시간, 5 % CO 2 품어.
- 스핀 다운, 4 ° C에서 PBS와 원심 분리기로 씻어; 6 분 동안 314 XG.
- 제조업체의 지침에 따라 생존의 얼룩을 사용하여 세포를 얼룩.
- 세포 마커 (CD45, TCRγδ, TCRβ, CD4, CD8, TCRγδ 또는 개미에 대한 얼룩제조업체의 지침에 따라 선택의 ibodies).
- 4 ° C, 5 분 동안 314 XG에 차가운 FACS 버퍼와 원심 분리기와 세포를 씻으십시오.
- 조심스럽게 세포 펠렛을 방해하는 소용돌이.
- 실온에서 20 분 동안 2 % 파라 포름 알데히드로 세포를 고정한다.
- 4 ° C, 세포 내 사이토 카인 5 분, 얼룩을위한 314 XG에 차가운 FACS 버퍼, 원심 분리기와 세포를 씻으십시오.
- 4 ° C, 5 분 동안 314 XG에 FACS 버퍼와 원심 분리기에 희석 차가운 0.5 % 사포닌의 솔루션을 FACS 튜브를 입력합니다.
- FACS 튜브에 0.5 % 사포닌 용액 300 μl를 추가, 4 ° C에서 어둠 속에서 15 분 동안 배양 한 후 4 ° C, 5 분 동안 314 XG에 원심 분리기.
- 제조업체의 지침에 따라 세포 내 마커 (IL-17A와 IFNγ 또는 선택의 사이토 카인)에 대한 세포를 얼룩. 5 분, 4 ° C에서 314 XG 0.5 % 사포닌 용액과 원심 분리기와 세포를 씻으십시오.
- FACS 다시 세척버퍼 4 ° C, 5 분 동안 314 XG에 원심 분리기.
- FACS 완충액 300 μL에 세포를 다시 일시.
- 유동 세포 계수기에 대한 결과를 분석합니다.
4. 유동 세포 계측법 분석
- 세포를 시각화하는 파편을 제외 앞으로 (FSC)와 사이드 분산 (SCC) 및 게이트에서 분석한다.
- 높이 (FSC-H) 매개 변수 대 앞으로 분산 형 지역 (FSC-A) 단일 셀을 선택합니다.
- 추가 분석 (도 2A 및 2C)에 대한 조혈 마커 CD45 +의 라이브 (생존 염색법으로 표시됨) 및 양성 게이트 셀.
- 도 2 및도 3에 도시 된 바와 같이 특정 마커의 분석을 계속한다.
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Representative Results
(- / -, 그림 2A - C LFA 대 WT) 프로토콜의 응용 프로그램을 설명하기 위해, 우리는 면역 세포와 치주염이없는 마우스의 치은의 네트워크를 검사 대표적인 결과를 보여줍니다. 대표 FACS 플롯은 치은 (그림 2A, 2C)에 살고 CD45 + 조혈 세포를 표시합니다. 이 프로토콜로 면역 세포의 분리 처리가 생체 자극 사이토 카인 분비 패턴의 특성을 수행 할 수있는 세포를 산출한다. 여기에서 우리는 정상 상태 (WT) 총 CD45 + 세포에서 IL-17 및 IFN-γ 염색을 표시하고 마우스에서 (그림 2B - D) (인해 LFA 결핍) 치주염을 나타내는. 이러한 데이터는 조직 정상 상태 (WT) 동안 로컬 및 치주염과 관련하여 사이토 카인 정보를 캡처하기 위해이 기법의 전위 공개 (LFA - / -). 마이크에서E는 치주염에 민감 우리는 또한 특히 T 세포 및 선천성 림프 세포 (ILC)의 구획 (- B도 3a)의 치은 면역 세포 조성물을 특징으로한다. 우리 TCRβ + CD4 + T 세포에서 IL-17 및 IFN-γ의 생산을 정의 할 수 있었다 TCRβ + CD8 + T 세포, TCRγδ + T 세포, NK 및 ILC 구획 (도 3C).
그림 1 :. 상악과 격리 된 치은 세그먼트 해부의 경계선을 보여주는 쥐 치은의 분리 그림은 잇몸 조직의 절개에 사용되는. 블록 해부 및 절연 블록에 대한 개요와 쥐 상악 (몰 지역)의 (B) 세그먼트. 치은과 상악 대구치 세그먼트의 헤 마톡 실린 및 에오신 염색 (H & E) L 로우 (C)에 도시되고 설명 된 조직 및 (D) 높은 배율. 원래 배율 지적했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 잇몸 세포에서 사이토 카인 생산을위한 대표 FACS 데이터. (A - C) FACS 플롯은 PMA와 생체 다시 자극 다음 마우스 치은 세포의 준비에 살고 CD45 + 세포 게이트를 보여주는 WT 및 LFA에 이오 노마 이신 - / -. (B - D) (인해 LFA-결핍) 치주염없이와 / 마우스의 잇몸에서 총 CD45 + 세포 마우스에서 IFN-γ와 IL-17 염색을 보여주는 대표 FACS 플롯을.세틸 / ftp_upload / 53736 / 53736fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 :. TCRγδ는 CD45 + 세포 게이트에 비해 염증이 잇몸에 면역 인구에 의한 사이토 카인 생산 (A) 대표 FACS 플롯 TCRβ에 대한 염색을 표시합니다. TCRβ + 세포 상에 게이팅 중간 플롯 TCRβ 염색 대는 CD4 (TCRβ + CD4 + T 세포, TCRβ + CD8 + T 세포 및 TCRγδ + T 세포의 분석을 가능)을 나타낸다. TCRγδ - - TCRβ에 게이팅 셀을 마우스 오른쪽 그래프는 NK1.1 염색 (NK 세포의 분석을 위해 수 있습니다) 대 CD45을 보여줍니다. (B) CD90.2에 대한 염색을 보여주는 대표 FACS 플롯은 CD45 + 혈통 음성 세포에 게이트 (CD3- CD19 - NK1.1 - 중 CD11c - CD11b를 - Ly6G - Ly6C - TCRγδ - TCRβ -)하는 타고난 림프 세포를 식별합니다. (C) 확인 된 세포 집단에서 IFN-γ와 IL-17 염색을 보여주는 대표 FACS 플롯. 치은 준비 20 주 이전 LFA에서입니다 - / - 치주염을 개발 마우스; 데이터는 3 개의 독립적 인 실험의 대표입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
현재의 기술이 성공적으로 적합한 (단일 마우스)에서 면역 세포의 수가 산출뿐만 아니라 표현형 특성화뿐만 아니라 기능적 연구 생체. 다른 그룹은 이전에 분리하여 치은 뮤린 면역 세포를 특성화하는 프로토콜 번역 및 동물 모델 9 치주염의 연구에서 유세포 빛깔의 사용 가치를 도입했다. 상당한 문제 해결이 프로토콜의 주요 수정을 따르면 치은 칼라 영역과 치간 치은 (그림 1)를 모두 포함하기 위해 조직의 전체 블록의 해부를 포함했다. 단독으로 치은 박리 종종 전체 두께 플랩이 달성되지 않고, 치은의 일부 특히 치간 영역에서 누락된다. 이 방법을 사용하여 수확 된 면역 세포의 수는 크게 증가한다. 이 기술은 또한 치은 조직 상악의에서 모두 최적의 분리를 허용D 하악.
이 프로토콜의 중요한 단계는 치은 지역의 보수적 해부 및 해부을 효율적으로 속도를 포함한다. 특히, 조직의 블록 치아 (잇몸)의 주위에 최소한의 조직이 아니라 구강 조직을 포함하는 해부한다. 블록 신속하게 해부해야하며, 조직과 세포를 최적의 세포 생존을 보장하기 위해 얼음에 남아 있어야한다.
문제 해결을 목적으로 그 세포의 낮은 수율 콜라, 콜라게나 제 및 / 또는 조직 블록에서 치은 불충분 절개 부적절한 농도 배양 부적절한 시간에 관련 될 수 있음을 주목하는 것이 중요하다. 그 메모에서, 치은 사용 확대 돋보기 (2X-6X)의 해부는 도움이 될 수 있습니다. 세포의 생존 능력은 낮은 절차에서 미디어, 완충제 및 얼음에 계속 남아 있지 셀 지각과 관련 될 수있다.
조직 DIS의 유형에 내재이 프로토콜의 제한,sected 다른 해부학 배리어 연구 된 부위 (예. 피부 또는 위장관) 큰 조직을 사용할 수있는 비교 잇몸 조직의 크기이다.
- / - 자발적으로 치주염을 개발 모델 그럼에도 불구하고, 여기에 제시된 기술은 우리가 LFA에서 지배적 인 세포 집단의 특성을 허용했다. LFA에서 - / - 마우스는 우리가 치주염 (10)의 개발 과정에서 지배적 인 IL-17 사이토 카인의 서명을 확인했다. 다색 유세포 분석을 이용하여, 우리는 IL-17 (11)의 셀 소스를 정의 할 수 있었다. IL-17의 설정이 질병에 로컬 TCRγδ 치은 (10) 내의 T 세포, CD4 + T 세포 및 선천성 림프 세포 (ILC)에 의해 제조 하였다.
이 방법에도 작은 개체군을 식별하는 능력을 가진 절연 셀 실질적인 번호, 지금 포괄적 이해 개발할 수있을 것이다치은 장벽의 무결성을 보호 전문 면역 세포 네트워크의 ING. 이 중요한 통찰력은 우리가 치은 환경에서 면역 반응을 평가 할 수 있습니다. 이 기술을 사용함으로써, 우리는 이제 추가적인 분석과 특성화를 수행 할 수 있도록, 유세포 셀 정렬하여 치은 면역 세포 망의 특정 구성 성분을 분리하기 위해 진행할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fine Scissors | Fine science tools | 14058-11 | |
| Scalpel Handle #3 | Fine science tools | 10003-12 | |
| Scalpel Blades #10 | Fine science tools | 10010-00 | Sterile |
| Splinter Forceps | Integra Miltex | 6-304 | |
| Needles with regular bevel | BD Medical | 305109 | 27 G, 12.7 mm length |
| Monoject syringes | Covidien | 8881513934 | Luer-lock tip, 3 ml |
| PBS, pH 7.4 | Life Technologies | 10010-049 | Without Calcium and Magnesium |
| RPMI 1640 | Lonza | 12-167F | Without L-glutamine |
| DNase I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25-1G | |
| Collagenase type IV | Gibco (by Life technologies) | 17104-019 | |
| Fetal Bovine Serum | Gemini Bio-products | 100-106 | |
| Gentamicin 50 mg/ml | Quality biological | 120-098-661EA | |
| Pen Strep | Gibco (by Life technologies) | 15140-122 | |
| L-Glutamine | Gibco (by Life technologies) | 25030-081 | |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 | Quality biological | 351-027-721EA | |
| 50 ml tubes | Corning | 352070 | Polypropylene, sterile |
| 70 μM Cell Strainers | Corning | 352350 | |
| Petri dishes | Corning | 351029 | Sterile |
| 5 ml FACS tubes | Corning | 352052 | Sterile |
| BD GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | Contains brefeldin A solution |
| Phorbol 12-Myristate 13-Acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Ionomycin Calcium Salt | Sigma-Aldrich | 13909 | |
| Saponin from quillaja bark | Sigma-Aldrich | S4521 | |
| LIVE/DEAD Fixable Aqua Dead Cell Stain Kit | Life Technologies | L34957 | |
| Anti-Mouse CD45 Alexa Fluor 700 | eBioscience | 56-0451-82 | |
| Anti-Mouse CD4 eFluor 450 | eBioscience | 48-0042-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta APC eFluor 780 | eBioscience | 47-5961-82 | |
| Anti-Mouse gamma delta TCR FITC | eBioscience | 11-5711-82 | |
| Anti-Mouse IL-17A APC | eBioscience | 12-7311-82 | |
| Anti-Mouse IFN-γ PE | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse NK1.1 PE-Cy7 | eBioscience | 25-5941-82 | |
| Anti-Mouse CD90.2 APC eFluor 780 | eBioscience | 47-0902-82 | |
| Anti-Mouse CD3e FITC | eBioscience | 11-0031-82 | |
| Anti-Mouse CD19 FITC | eBioscience | 11-0193-82 | |
| Anti-Mouse CD11b FITC | eBioscience | 11-0112-82 | |
| Anti-Mouse CD11c FITC | eBioscience | 11-0114-82 | |
| Anti-Mouse TCR beta FITC | eBioscience | 11-5961-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6G FITC | eBioscience | 11-5931-82 | |
| Anti-Mouse Ly-6C FITC | BD Pharmingen | 553104 |
References
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