लुकिंग ग्लास के माध्यम से: समय चूक माइक्रोस्कोपी और एकल कक्षों के अनुदैर्ध्य अध्ययन करने के लिए ट्रैकिंग विरोधी कैंसर चिकित्सा
Summary
Here, we describe a method of long-term time-lapse microscopy to longitudinally track single cells in response to anti-cancer therapeutics.
Abstract
कैंसर रोधी दवाओं के लिए एकल कक्षों की प्रतिक्रिया आबादी प्रतिक्रिया का निर्धारण करने में महत्वपूर्ण योगदान देता है, और इसलिए कुल परिणाम में एक प्रमुख योगदान कारक है। Immunoblotting, प्रवाह cytometry और तय सेल प्रयोगों अक्सर अध्ययन करने के लिए कैसे कोशिकाओं को कैंसर रोधी दवाओं का जवाब उपयोग किया जाता है। इन तरीकों में महत्वपूर्ण हैं, लेकिन वे कई कमियों है। दवा प्रतिक्रियाओं में परिवर्तनशीलता कैंसर और सामान्य कोशिकाओं के बीच, और विभिन्न कैंसर कोशिकाओं की उत्पत्ति, और क्षणिक और दुर्लभ प्रतिक्रियाओं के बीच आबादी औसतन assays का उपयोग और सीधे ट्रैक और उन्हें longitudinally विश्लेषण करने के लिए सक्षम होने के बिना समझना मुश्किल है। माइक्रोस्कोप विशेष रूप से अच्छी छवि की जीवित कोशिकाओं के लिए अनुकूल है। प्रौद्योगिकी के क्षेत्र में प्रगति के एक संकल्प है कि न केवल सेल ट्रैकिंग, लेकिन यह भी सेलुलर प्रतिक्रियाओं की एक किस्म के अवलोकन के लिए सक्षम बनाता है पर नियमित रूप से छवि कोशिकाओं कर सकें। हम विस्तार में एक दृष्टिकोण है कि के निरंतर समय चूक इमेजिंग के लिए अनुमति देता है का वर्णनअनिवार्य रूप में लंबे समय, वांछित आम तौर पर 96 घंटा के लिए ऊपर के रूप में दवा के लिए प्रतिक्रिया के दौरान कोशिकाओं। दृष्टिकोण के रूपांतरों का प्रयोग, कोशिकाओं सप्ताह के लिए नजर रखी जा सकती है। आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट biosensors कई प्रक्रियाओं, रास्ते और प्रतिक्रियाओं के रोजगार के साथ पीछा किया जा सकता। हम उस पर नज़र रखने और सेल के विकास और कोशिका चक्र प्रगति, गुणसूत्र गतिशीलता, डीएनए की क्षति की मात्रा का ठहराव, और कोशिका मृत्यु में शामिल उदाहरण दिखाते हैं। हम यह भी तकनीक और इसके लचीलेपन के रूपांतरों पर चर्चा, और कुछ आम नुकसान पर प्रकाश डाला।
Introduction
लाइव सेल माइक्रोस्कोपी और एकल कक्षों के अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग एक नई तकनीक नहीं है। जल्द से जल्द माइक्रोस्कोप से, उत्साही और वैज्ञानिकों मनाया और एकल कक्षों और जीवों, उनके व्यवहार, और विकास 1-3 अध्ययन किया है। 1950 के दशक में वेंडरबिल्ट विश्वविद्यालय में देर डेविड रोजर्स से एक प्रसिद्ध उदाहरण एक स्ताफ्य्लोकोच्चुस जीवाणु और अंततः phagocytosis 4 की प्रक्रिया का पीछा करते हुए एक रक्त धब्बा में एक मानव न्युट्रोफिल पता चलता है। इस लाइव सेल फिल्म कैसे कई प्रक्रियाओं मनाया जा सकता है और सहसंबद्ध एक ही प्रयोग में का एक उत्कृष्ट उदाहरण है: एक रासायनिक ढाल, यांत्रिकी और सेल गतिशीलता की गति की संवेदन, सेल गतिशीलता, आसंजन, और एक रोगज़नक़ के phagocytosis आकार।
पूरी तरह से स्वचालित माइक्रोस्कोप और अति संवेदनशील डिजिटल कैमरों के आगमन माइक्रोस्कोपी का उपयोग जांचकर्ताओं की एक बढ़ती हुई संख्या में हुई है कोशिका जीव विज्ञान से लेकर एफ में मौलिक सवाल पूछने के लिएROM कैसे कोशिकाओं 5,6 के लिए कदम और 7.8 विभाजित गतिशीलता और झिल्ली की तस्करी 9-11 organelle करने के लिए। गैर फ्लोरोसेंट, चरण विपरीत (पीसी) है, जो 1953 में Frits Zernike के लिए नोबेल पुरस्कार हुई हैं, और अंतर हस्तक्षेप विपरीत सहित brightfield माइक्रोस्कोपी, (डीआईसी) कोशिकाओं और नाभिक लेकिन यह भी microtubule बंडलों सहित उप सेलुलर संरचनाओं के अवलोकन के लिए अनुमति गुणसूत्रों, nucleoli, organelle गतिशीलता, और मोटी actin फाइबर 12। आनुवंशिक रूप से फ्लोरोसेंट प्रोटीन इनकोडिंग और अंगों के खिलाफ फ्लोरोसेंट रंगों के विकास नाटकीय रूप से समय चूक माइक्रोस्कोपी 13-15 असर पड़ा है। हालांकि इस लेख का ध्यान केंद्रित नहीं, सेल spheroids में और सीटू (intravital माइक्रोस्कोपी) confocal और multiphoton माइक्रोस्कोपी का उपयोग करने में इमेजिंग दृष्टिकोण का एक और विस्तार का प्रतिनिधित्व करते हैं, और वहाँ बकाया लेख है कि का उपयोग करें और इन तरीकों 16-19 पर चर्चा कर रहे हैं।
विरोधी CANC के लिए कोशिकाओं की प्रतिक्रियाएंएर दवाओं या प्राकृतिक उत्पादों आणविक और सेलुलर पैमाने पर निर्धारित होते हैं। समझना सेल प्रतिक्रिया और भाग्य इलाज के बाद अक्सर आबादी औसतन assays (जैसे।, Immunoblotting, पूरे अच्छी तरह के उपाय), या immunofluorescent का पता लगाने के साथ तय समय अंक और प्रवाह cytometry, जो एकल कक्षों को मापने शामिल है। आबादी के भीतर दवाओं के लिए एक सेल प्रतिक्रिया में विविधता, ट्यूमर में विशेष रूप से, सेल लाइनों और ट्यूमर है कि संतृप्ति में एक ही दवा के साथ व्यवहार कर रहे हैं भर में देखा प्रतिक्रिया में परिवर्तनशीलता के कुछ समझा जा सकता है। लंबे समय तक अनुदैर्ध्य दृष्टिकोण एक दिया एकल कक्ष या कक्षों की आबादी का पालन करने के लिए एक कम आम है लेकिन बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण है कि आणविक प्रतिक्रिया रास्ते में से प्रत्यक्ष अध्ययन के लिए अनुमति देता है, अलग अलग phenotypes (जैसे।, कोशिका मृत्यु या कोशिका विभाजन), के अवलोकन आबादी के भीतर सेल करने वाली सेल परिवर्तनशीलता, और कैसे इन कारकों जनसंख्या प्रतिक्रिया गतिशीलता 20-22 के लिए योगदान करते हैं। आशावादी, सक्षम होने के नातेनिरीक्षण और एकल कोशिका प्रतिक्रियाओं का अंदाजा कैसे दवाओं काम करते हैं, यही कारण है कि वे कभी कभी असफल हो, और करने के लिए सबसे अच्छा कैसे उन का उपयोग करने के बारे में हमारी समझ को बेहतर बनाने में मदद करने के लिए होगा।
लंबी अवधि के समय चूक माइक्रोस्कोपी, अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग, और दवा प्रतिक्रियाओं का विश्लेषण करने की तकनीक कई जांचकर्ताओं के लिए उपलब्ध है और phenotype प्रतिक्रियाओं 20,21 निरीक्षण करने के लिए केवल प्रेषित प्रकाश का उपयोग कर, आसान हो सकता है। दृष्टिकोण के मुख्य घटक शामिल हैं: ब्याज की कोशिकाओं की उचित तैयारी, पर्यावरण कक्ष के साथ एक स्वचालित माइक्रोस्कोप, एक कैमरा एक कंप्यूटर के साथ प्राप्त करने के लिए और समय चूक की समीक्षा करने के लिए छवियों को स्टोर, और सॉफ्टवेयर और मापने के लिए और कोशिकाओं का विश्लेषण एकीकृत और किसी भी फ्लोरोसेंट biosensors। हम brightfield और / या widefield epifluorescent माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर के रूप में लंबे समय के रूप में कई दिनों के लिए संवर्धित कोशिकाओं के समय चूक माइक्रोस्कोपी के संचालन के लिए कई सुझावों के साथ एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं। इस प्रोटोकॉल किसी भी कोशिका लाइन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि संस्कृति में उगाया जा सकता हैविरोधी कैंसर उपचार के लिए उनकी प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए। हम अधिग्रहीत डेटा का उदाहरण देते हैं और कई अलग अलग आनुवंशिक रूप से इनकोडिंग फ्लोरोसेंट biosensors और चरण विपरीत माइक्रोस्कोपी का एक उदाहरण का उपयोग करते हुए विश्लेषण किया है, संक्षेप में जांच के विभिन्न प्रकार के फायदे और लंबी अवधि के समय चूक और अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग के नुकसान पर चर्चा, क्या हो सकता है इस दृष्टिकोण है कि गैर प्रत्यक्ष दृष्टिकोण, और कुछ बदलाव है कि हमें आशा है कि ब्याज और अनुभवहीन शोधकर्ताओं जो दृष्टिकोण का उपयोग करने के लिए विचार नहीं किया है मूल्य का हो जाएगा से समझने के लिए मुश्किल है, और अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए है के लिए सीखा है।
Protocol
Representative Results
Discussion
समय चूक माइक्रोस्कोपी और अनुदैर्ध्य ट्रैकिंग के लाभ
माइक्रोस्कोप दवा प्रतिक्रिया के अनुदैर्ध्य अध्ययन के लिए एक आदर्श साधन के रूप में यह जांचकर्ताओं व्यक्ति की कोशिकाओं और उनके भा…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Joshua Marcus for technical support and Jolien Tyler, Ph.D., Director of the Richard J. McIntosh Light Microscopy Core Facility, for technical advice. This work was supported by funds from the University of Colorado Boulder and the University of Colorado Boulder Graduate School to J.D.O. R.T.B. is partially supported by pre-doctoral training grant from the NIH (T32 GM008759). We thank Karyopharm Therapeutics, Inc. for selinexor and Merck Serono for Kinesin-5 inhibitor. FUCCI plasmids are from Atsushi Miyawaki (RIKEN, Japan) via MTA. mCherry-BP1-2 was from Addgene. HeLa expressing H2b-mCherry and β-tubulin-EGFP are from Daniel Gerlich (IMBA, Austrian Academy of Sciences, Austria).
Materials
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | microtubule stabilizing drug |
| etoposide | Selleckchem | S1225 | topoisomerase II inhibitor |
| selinexor | Karyopharm Therapeutics | na | XPO1/CRM1 inhibitor, gift |
| Kinesin-5 inhibitor | Merck Serono | na | gift, also available from American Custom Chemicals Corporation. CAS 858668-07-2 |
| cell growth medium | HyClone (Fisher) or Mediatech | many companies available | |
| 5% CO2/balance air, certified | Airgas | Z03NI7222004379 | |
| 35mm dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm 4 well dish, 20mm glass bottom | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | many companies available |
| 35mm dish, gridded glass bottom | MatTek | P35G-2-14-CGRD | many companies available |
| multi-well, glass bottom | Cellvis | P12-1.5H-N | many companies available |
| Olympus IX81 inverted epifluorescence microscope | Olympus | ||
| Olympus IX2-UCB controller | Olympus | ||
| PRIOR LumenPro200 | Prior Scientific | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III motorized stage | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Environmental Controller Unit | InVivo Scientific | STEV.ECU.HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD with controller | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| Nikon laser launch | Nikon | ||
| SOLA light engine | lumencor | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT inclubation chamber | TOKAI HIT | TIZSH |
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