Methodenartikel

Eine einfache und effiziente Methode zu konstruieren Mutant Vacciniavirusvektoren

DOI:

10.3791/54171

⸱

30. Oktober 2016

 ,  ,  ,  , 
1Center for Molecular Oncology, Barts Cancer Institute, Queen Mary University of London, 2Sino-British Research Centre for Molecular Oncology, National Center for International Research in Cell and Gene Therapy, Zhengzhou University, 3School of Basic Medical Sciences, Academy of Medical Sciences, Zhengzhou University

* These authors contributed equally

In diesem Artikel

Zusammenfassung

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Vaccinia-Virus (VV) ist in der biomedizinischen Forschung und der Verbesserung der Gesundheit des Menschen weit verbreitet. Dieser Artikel beschreibt eine einfache, hocheffiziente Methode, um die VV-Genom mit Hilfe eines CRISPR-Cas9 System zu bearbeiten.

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die CRISPR-assoziierte Endonuklease Cas9 kann bestimmte genomische Loci bearbeiten, die von einer einzigen Leit-RNA (gRNA) gesteuert werden. Das CRISPR/Cas9-System wird erfolgreich für die Editierung von Genomen verschiedener Organismen eingesetzt. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Bearbeitung des Genoms des Vaccinia-Virus (VV) im Zytoplasma von VV-infizierten CV-1-Zellen mit dem RNA-gesteuerten Cas9. RNA-gesteuertes Cas9 induziert doppelsträngige DNA-Brüche, die eine homologe Rekombination effizient und spezifisch an der Zielstelle von VV ermöglichen, und ein Transgen kann durch homologe Rekombination in diese Stellen eingebaut werden. Durch die Verwendung eines ortsspezifischen homologen Vektors mit Transgenen wurde ein N1L-Gen-deletiertes VV mit dem in dieser Region eingebauten Gen für das rote Fluoreszenzprotein (RFP) mit einer erfolgreichen Rekombinationseffizienz erzeugt, die 10-mal höher war als die mit der herkömmlichen homologen Rekombinationsmethode. Dieses Protokoll demonstriert den erfolgreichen Einsatz des RNA-gesteuerten Cas9-Systems zur Erzeugung mutierter VVs mit erhöhter Effizienz.

Einleitung

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Vaccinia-Virus (VV) ist ein umhülltes DNA-Virus auf die Pockenvirus-Familie gehört und hat eine entscheidende Rolle in einer der größten Erfolge in der Medizin der Ausrottung der Pocken gespielt. In der post-Eradikation Ära der Pocken, VV zur Abgabe von Genen , die für Impfstoffe gegen HIV und andere Infektionskrankheiten als Vektor entwickelt 1-7 durch Einfügen von Genen aus verschiedenen Pathogenen in VV - Vektoren wurde. VV wurde auch als Vektor für die Krebsimmuntherapie 8-14 speziell für die Entwicklung von Tumor-bezogenen replizierende onkolytischen Vacciniavirus extensiv verwendet worden. Um eine wirksame Impfstoffvektor mit verbesserter Selektivität für Krebszellen, Modifikationen innerhalb des viralen Genoms zu schaffen, erforderlich sind, einschließlich Gen-Deletionen oder Einführung von therapeutischen Genen.

Mit der Entwicklung der DNA-Technologie und ein besseres Verständnis der Molekularbiologie und Virologie, Insertion von Fremd-DNA in VV ursprünglich erreichend unter Verwendung der homologen Rekombination (HR) in den 1980er Jahren 15. Dieses Verfahren ist immer noch weit verbreitet VV-Vektoren für die Konstruktion. Einführung der genetischen Modifikation unter Verwendung eines Shuttle-Vektors für HR erreicht, die in pre-infizierten Zellen mit der VV-Genom rekombiniert. Jedoch hat dieses Verfahren als sehr ineffizient erwiesen (weniger als 1% homologe Rekombinationseffizienz 16) und führt oft in zufällige Insertion des Selektionsmarkers in Nicht-Zielbereiche und / oder den Verlust des Markers auf Virus Expansion.

Die Effizienz der DNA homologe Rekombination zum Einführen exogener DNA in genomische Loci kann drastisch in Gegenwart von Doppelstrangbrüchen (DSB) 17 verbessert werden. Daher ist die Technologie, die DSBs an Ziel-Loci birgt ein großes Potenzial für die Genomtechnik von VV induzieren kann.

Die neu entwickelte CRISPR-Cas9 System zeigt Versprechen für DSBs in jedem VV-Gen-Region auslösen. CRISPR-Cas9 ist ein RNA-geführte Nuklease in adaptiven Immunität gegen eindringende Phagen und andere fremde genetische Materialien beteiligt 18-20. Es gibt drei CRISPR-Cas - Systeme im Bereich der mikrobiellen Spezies 21. Der Typ II CRISPR-Cas-System ist für die Bearbeitung des Genoms von eukaryotischen Zellen und große Viren weit verbreitet. Es besteht aus dem RNA-guided Cas9 Endonuklease (aus Streptococcus pyogenes), eine einzige Führungs RNA (sgRNA) und das trans-aktivierende crRNA (tracrRNA) 22-24. Die Cas9 / sgRNA Komplex erkennt die komplementären 20-Nukleotid - genomischen Sequenz vorhergehenden einem 5'-NGG-3 'Protospacer benachbarten Motiv (PAM) Sequenz in Säugetierzellen 22, 23. Es ist für effektive Erzeugung von gentechnisch veränderten Zellen, Viren erfolgreich eingesetzt wurde und Tiermodelle 22-32.

Der CRISPR-Cas9 System hat sich als ein effizientes Werkzeug für die Genom in Kombination im Zytoplasma von VV mit homologe Rekombination gezielt zu infizierten CV-1-Zellens zu erzeugen mutierten Vaccinia - Viren 33, 34 dar . Um die mögliche Anwendung dieses Verfahrens zu verlängern, wir detaillierte Informationen über dieses Systems Methodik vorzustellen. Das beschriebene Protokoll kann verwendet werden, um eine Mutante VV mit einem bestimmten Gen-Deletion zu erzeugen und / oder den Arm des mutierten Virus mit einem therapeutischen Transgen.

Protokoll

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1. Herstellung von Ziel-RNA und Cas9 Konstrukten und Reparatur Donor Vektor

  1. Klonierung von gRNAs
    1. Entwerfen Sie eine Führungs-RNA - Zielsequenz Targeting des N1L Gen von Vaccinia - Virus nach dem Prinzip zuvor erklärt , 25. Richten Sie die Führung-RNA-Zielsequenz gegen das Genom des Vaccinia-Virus (in diesem Fall Lister-Stamm von Vaccinia-Virus), um auszuschließen, keine Off-Target gRNA Zielsequenzen.
    2. Synthetisieren und klonen gRNA Oligos in einen gRNA Klonierungsvektor wie zuvor 25 beschrieben. Bestätigen Sie die Reihenfolge der einzelnen gRNA in dem resultierenden Vektor durch Sanger - Sequenzierung 33. Nennen Sie das resultierende gRNA konstruieren als gRNA N2 33.
      HINWEIS: Die Seite gRNA Ziel innerhalb des N1L - Gens und ist in dem Bereich zwischen dem linken Arm und rechten Arm , dass die Reparatur Donorvektor Abdeckungen (siehe Abbildung 1).
  2. Klonen Sie das Cas9 Gen, das das Kernlokalisationssignal (NLS) in die fehlendepST1374 Vektor und bezeichnen das Konstrukt als pST-Cas9 33.
    Hinweis: Jeder Säugetier-Expressions Klonierungsvektor kann für den Bau des Cas9 Expressionsvektor verwendet werden.
  3. Der Bau der Reparatur Spender Vektor für HR
    1. Verwenden Sie das N1L Gen von VV als Zielregion für die Modifikation 33. Stellen Sie sicher, dass die Längen der linken und rechten Arme sind etwa 500-600 bp jeder, und flankierende den Zielbereich.
      HINWEIS: Der linke Arm / rechten Arm kann mit dem Zielbereich bis zu 50 bp überlappen (siehe Abbildung 1).
    2. Klonen Sie die N1L Region Reparatur Spender Vektor als 33 zuvor beschrieben, 34 und die Reparatur Donorvektor als pT-N1L bezeichnen.
      HINWEIS: Siehe Abbildung 1 für die Reparatur Spendervektor und dessen Zielregion. Andere Regionen der VV kann unter Verwendung Region (Gen) -spezifische gRNA (n) und regionsspezifische Reparatur Spender Vektor abgezielt. Jede Klonierungsvektor kann für die Konstruktion des Reparatur Donorvektor verwendet werden.
    3. Expansion von Plasmid
      1. Verwandeln Sie das Plasmid in chemisch kompetente E. coli nach den Anweisungen des Herstellers. Man reinige das Plasmid ein Plasmid-Extraktions-Kits mit Bezug auf das Protokoll vom Hersteller geliefert werden.

    2. Seeding Zellen (Tag 1)

    1. Pflegen CV-1-Zellen (Affennierenfibroblasten) in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 5% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 100 U / ml Penicillin und 100 ug / ml Streptomycin bei 37 ° C mit 5% CO 2.
    2. Trypsinize CV-1-Zellen, die 80-90% konfluent sind
      1. Entfernen des Zellkulturmediums aus den T-175-Kolben, der CV-1-Zellen. Spülen Sie die Monoschicht mit 5 ml steriler PBS Rest Serum zu entfernen und den PBS anzusaugen. In 2,5 ml 1 × Trypsin-EDTA-Lösung, die Zellen und der Kolben wird in 37 ° C Inkubator für etwa 5 min zu decken Zellablösung zu unterstützen.
      2. Hinzufügen10 ml Zellkulturmedium (siehe Schritt 2.1), um die Zellen durch vorsichtiges Pipettenwirkung auszusetzen. Zählen Sie die Zellzahlen unter Verwendung einer Zählkammer.
      3. Aussäen Zellen in 6-Well-Platten
        1. Seed 2 × 10 5 CV-1 - Zellen in 2 ml Zellkulturmedium in jede Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen am Tag vor der Transfektion.
          HINWEIS: Eine zusätzliche Zentrifugationsschritt Trypsin zu entfernen, ist nicht erforderlich.

    3. Transfektion von Plasmid Cas9 und gRNA Plasmid (Tag 2)

    1. Transfizieren CV-1-Zellen (hergestellt in Schritt 2.2.3.1) mit 0,5 ug pST-Plasmid Cas9 und 0,5 ug gRNA N2 Plasmid, das ein Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet wird.
    2. Inkubieren Sie die Zellen für 24 h in einem Inkubator (37 ° C mit 5% CO 2), und ersetzen Sie dann das Medium mit 2 ml frischem Zellkulturmedium (beschrieben in Schritt 2.1).

    4. Die Infektion von CV-1-Zellen und Shuttle Donor Vector Transfection für HR (Tag 3)

    1. Verdünne das Rückgrat VVL15 Virus mit DMEM Zellkulturmedium bis zu einer Konzentration von 2 × 10 5 pfu / ml. 24 h nach der Transfektion von Cas9 und gRNA Plasmide, 100 & mgr; l des verdünnten Virus in jede Vertiefung der transfizierten CV-1-Zellen.
    2. 2 h nach der Virusinfektion, transfizieren 1,0 ug Shuttle Donorvektor in VVL15-infizierten Zellen für die HR eine Transfektionsreagenz Verwendung gemäß den Anweisungen des Herstellers. Platzieren Sie die transfizierten Zellen in einem 37 ° C - Inkubator mit 5% CO 2 für 24 h.

    5. Ernte der rekombinante Virus (Tag 4)

    1. Nach 24 Stunden der Transfektion mit dem Shuttle-Donator Vektor für HR in Schritt 4.2, lösen die transfizierten CV-1-Zellen einen Zellschaber verwenden. Sammeln Sie die Zellsuspension in ein Kryoröhrchen und bei -80 ° C für die zukünftige Verwendung.
      HINWEIS: Wischen Sie Zellkulturmedium ausgelaufene Flüssigkeit mit Desinfektionsmittel sofort und wischen Sie dann wieder mit 70% ethanol.

    6. Reinigung des modifizierten VV (erste Runde)

    1. Am Tag 1 Saatgut 15 6-well - Platten mit 3 × 10 5 CV-1 - Zellen in jeder Vertiefung.
      1. Am Tag 2 auftauen die gefrorene Zellsuspension aus Schritt 5.1 in einem Wasserbad bei 37 ° C für 3 min, und die Kryoröhrchen kräftig für 30 s vortexen Zelllysat zu erhalten, ohne die Zelltrümmer zu entfernen.
    2. Für die Infektion von einer 6-Well-Platte von CV-1-Zellen, verdünnt 1 & mgr; l Zelllysat mit 3 ml DMEM und 0,5 ml der verdünnten Zelllysat in jede Vertiefung der Platte mit 6 Vertiefungen hinzuzufügen, oben auf Medien bereits Geschenk. Infect alle Platten mit 6 Vertiefungen, hergestellt in Schritt 6.1.
      HINWEIS: Die Entfernung von Zelldebris ist nicht erforderlich.
    3. Nach zwei Tagen der Infektion (dh am Tag 4), RFP-positiven Plaques unter einem Fluoreszenzmikroskop durch kreisen um die Plaque Lage mit 10fach Objektivlinse und beschriften Sie die Plaques unter der Platte mit einem Markierungsstift identifizieren.
      ANMERKUNG: Abbildung 3 für repräsentative RFP-positive Plaque.
      1. Bereiten Sie sechs markierte Kryovials, die 200 & mgr; l Serum-freies DMEM Zellkulturmedium sechs verschiedenen RFP-positiven Plaques zu holen. Absaugen Zellkulturmedium aus dem gut mit markiertem plaque (s) (Schritt 6.3). Bringen Sie eine 200 ul Spitze auf eine P200 Pipette, die Lautstärke bei 30 & mgr; l und nehmen ~ 10 & mgr; l Zellkulturmedium von einem Cryovial.
      2. Halten Sie die Pipette Druckknopf, ohne das Medium lösen und die Spitze verwenden, um die Fläche eines markierten Plaque zu kratzen. Lassen Sie die Pipette Drucktaster um die abgelösten Zellen zu heben und übertragen sie in die Cryovial enthält 190 & mgr; l Serum-freiem DMEM.
      3. Nehmen wir ein anderes 10 & mgr; l Medium aus dem Fläschchen mit den zerkratzten Zellen (von den letzten Schritt) und wiederholen Sie den Vorgang des Aufnehmens die gleiche RFP-positive Plaque dreimal bis zu so viele zerkratzt Zellen wie möglich zu sammeln. Übertragen Sie alle Zellen in die gleiche Fläschchen und lagern Sie das Fläschchen bei -80 ° C.
        Hinweis: Alternativ können die Kryovials für 10 min auf Trockeneis gefrieren, wenn die zweite Runde der Reinigung sofort durchgeführt wird.

    7. Die Reinigung der modifizierten VV (zweite Runde)

    1. Seed 3 × 10 5 CV-1 - Zellen in jede Vertiefung von sechs 6-Well - Platten und Kultur die Zellen für 24 h.
    2. Tauen die gefrorenen Kryovials (aus Schritt 6.3.3) in 37 ° C warmen Wasserbad für 3 min, Strudel dann die Kryovials kräftig für 30 Sekunden Zelllysat zu erhalten.
      1. Mit 0,5 & mgr; l des gemischten Zelllysat in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte. Infect für jede Plakette eine 6-Well-Platte. Inkubieren Sie die VV-infizierten 6-Well - Platten bei 37 ° C mit 5% CO 2 für 2 Tage (Zweite Runde Plaque - Reinigung). Dann wiederholen Sie Abschnitt 6.3.
        HINWEIS: Mehr als sechs RFP-positive Plaques ausgewählt werden können auf; zwei oder mehr Platten mit 6 Vertiefungen kann zur Reinigung jedes Plaque verwendet werden.

    8. Weitere Runden von Plaque Purifizierung

    1. Fahren Sie weitere drei bis fünf Runden der Reinigung nach dem gleichen Protokoll in Schritt 7 beschrieben, bis alle gebildeten Plaques aus einer positiven Plaque erscheinen RFP-positiv unter dem Mikroskop zu sein.
      HINWEIS: Diese Plakette dann rein betrachtet.
    2. Sobald die Plaque rein ist (Abbildung 4, alle infizierten Zellen RFP exprimieren), ernten eine positive Plaque in einen Cryovial und bei -80 ° C , wie in Kapitel 6.3 beschrieben. Überprüfen Sie die Plakette nach dem Protokoll in Schritt 9 und 10 beschrieben.

    9. Erweitern Sie die gereinigten Plaque (n)

    1. Seed 3 × 10 5 CV-1 - Zellen in jede Vertiefung einer 6-Well - Platte einen Tag vor der Virusinfektion.
    2. Auftauen des gefrorenen Kryoröhrchen von 8,2 in einem 37 ° C Wasserbad für 3 min Zelllysat zu erhalten. Fügen Sie alle das Lysat (ohne Zelltrümmer zu entfernen) in eine Vertiefung einer 6-Well-Platte von CV-1-Zellen (ausgesät in Schritt 9.1). Inkubieren der infizierten CV-1-Zellen bei 37 ° C mit 5% CO 2 für bis zu 3 Tagen.
      1. Erweitern Sie alle gereinigten Plaques (mindestens drei Plaques).
        HINWEIS: Die Infektionszeit variiert von 1-3 Tagen in Abhängigkeit von der Menge des Virus in dem Lysat.
    3. Ernten Sie die VV-infizierten Zellen einen Zellschaber verwenden, wenn mehr als 50% Zellen cytopathische Wirkung zeigen, unter einem Mikroskop beobachtet (Zellen sind abgerundet, leicht abgenommen und RFP positiv). Sammle die abgelösten Zellen zusammen mit dem Zellkulturmedium in einem 15 ml-Röhrchen.
      1. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 300 g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand und halten das Zellpellet bei -80 ° C bis zur weiteren Verwendung oder verwenden Sie das Zellpellet sofort für Schritt 10.

    10. Prüfung der Änderung der Mutant VV PCR

    1. Extrahieren VV DNA aus dem Zellpellet, hergestellt in Schritt 9.3.1 einen DNA Extraction Kit nach Herstellerprotokoll. Eluieren der DNA mit 200 & mgr; l doppelt destilliertem Wasser.
      HINWEIS: Verwenden Sie die Hälfte des Volumens des Pellets DNA zu extrahieren und den Rest für die virale Produktion zu halten, wenn der Klon als enthält, um die korrekte Modifikation / Einfügen überprüft wird.
    2. Verifikation der Löschens des N1L Gens und die Insertion von RFP-Gens in das N1L Region.
      1. Amplify ein DNA-Fragment, das das Gen N1L (L025) und die L026-Gen entworfen Primer gegen die N1L Gen verwendet wird. Amplify das RFP-Gen mit RFP -spezifische Primer. Amplify ein Kontroll-DNA-Fragment, das A52R durch PCR-A52R-spezifische Primer verwendet wird.
        HINWEIS: Siehe Liste der Materialien für spezifische Primer.
        1. Führen Sie die PCR ein PCR-Master-Mix-Kit. Einrichten 25 & mgr; l PCR-Reaktion unter Verwendung von 2 & mgr; l DNA-Templat, denaturieren die PCR-Reaktion bei 94 ° C für 2 min, dann 30 Zyklen von PCR folgenden diese Schritte auszuführen: Denaturieren der DNA bei 94 ° C für 15 s, dann Tempern die Primer an die DNA-Matrizen bei 52 ° C für 15 s Verlängerung der PCR-Reaktion bei 72 ° C für 30 s.
    3. Lösen Sie die PCR - Produkte einer 1% igen Agarosegel unter Verwendung 33. Nehmen Sie das Gel Bild unter Verwendung eines UV-Gel doc. Wenn der N1L PCR negativ und A52R und RFP PCRs positiv sind, dann wird die Plaque korrekt im N1L Region modifiziert.

Ergebnisse

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Für den Bau eines neuen VV Vektor, der Schlüssel ist Ausgangspunkt zu entwerfen und einen Spender-Shuttle-Vektor zu konstruieren, der eine bestimmte Region des Genoms ausrichten können. In dieser Studie wurde das VV N1L Gen als Beispiel Target verwendet. Die Kassette des Spender Shuttle - Vektor für die Rekombination und der Zielregion in dem VV in 1 gezeigt sind. Um die Effizienz der homologen Rekombination zu erhöhen, Plasmiden Cas9 und N1L spezifische gRNA exprimieren , wurden co-transfiziert in den CV -1 Zellen 48 h vor der homologen Rekombination 33 durchführt. Eines Tages (24 h) nach der Transfektion, RFP wurde in den CV-1 - Zellen (Abbildung 2) ausgedrückt. Nach der Infektion von CV-1 - Zellen mit dem gesamten Lysats aus der homologen Rekombination (Schritt 5), RFP-positive und negative Plaques wurden beobachtet sowohl in den CV-1 - Zellen (Abbildung 3). Nach dem Reinigungsprotokoll beschrieben, eine reine Plaque co ULD nach 3-5 Runden der Reinigung erhalten werden. Wie in 4 gezeigt, aus einer reinen Plaque alle Plaques nach der Infektion mit Zelllysat mit dem mutierten Vaccinia - Virus abgeleitet präsentiert ein RFP - Signal. Um zu überprüfen , ob die reine Mutante VV die richtige Genveränderung hatte, wurde PCR verwendet , um die Abwesenheit des anvisierten N1L Gens zu bestätigen, wie in Abbildung 5 dargestellt. PCR des modifizierten Virus zeigte ein positives Signal für RFP und einen abwesenden Signal für N1L ( Abbildung 5 lane AG), während die Ergebnisse der PCR N1L für die Kontrollvirus (Ctr) mit intaktem N1L Bereich positiv ist. Die Kontroll-DNA-Fragmente von A52R waren positiv für alle rekombinanten Viren und Ctr-Virus. Die HR - Effizienz in RFP-positiven Plaques ist 100% (6/6) in diesem Experiment (es bis zu 94% in der vorherigen Arbeit 34 war). Das hier beschriebene Verfahren hat die Rekombinationseffizienz um mehr als das 100 - fache im Vergleich zu herkömmlichen Protokollen 33, 34 verbessert.

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Abb . 1: Die Kassette des Donor - Shuttle - Vektor für die homologe Rekombination und die Zielregion in dem VV - Genom Die Reinigung Markergen RFP wird durch das H5 - Promotor angetrieben. Die Reparatur Donorvektor die N1L Region Ergebnisse im RFP Gen-Targeting, die in die N1L Region nach homologe Rekombination eingebaut. 'X' zeigt die homologe Sequenz in der Reparatur Spender Vektor, der die gleiche Sequenz auf dem Vaccinia - Virus - Genom ersetzen wird. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2:. Abbildung des CV-1 - Zellen einen Tag nach der homologen Rekombination Eines Tages nacr homologe Rekombination, die Zellen mit VV infiziert gegeben und durch Reparatur Spender Vektor sind RFP-positiv . A: Phasenkontrastbild (Originalvergrößerung 100X) . B: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme (Originalvergrößerung 100X). Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3:. Ein RFP-positive Plaque in der ersten Runde der Reinigung des mutierten Virus in der ersten Runde der Reinigung des mutierten Virus, das RFP-positive Plaque (eingekreist mit roter Linie) mit der Zielregion Löschung werden von Plaques gebildet umgeben von Wildtyp - Virus (eingekreist mit gelbe Linie) . A: Phasenkontrastbild (Originalvergrößerung 100X) . B: Fluoreszenz microscopy Bild (Originalvergrößerung 100X). Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abb . 4: Die reine Mutante VV Nach 3-5 Runden der Reinigung, reine Plaques wurden wie alle Plaques erhalten wurden , waren RFP-positiv . A: Phasenkontrastbild (Originalvergrößerung 100X) . B: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahme (Originalvergrößerung 100X) . Maßstabsbalken = 50 & mgr; m. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 5: Verification der reinen Mutante VV. Die DNA wurde aus VV extrahiert infizierten CV-1 - Zellen. Die Deletion der Zielregion N1L durch PCR unter Verwendung von Primern N1L, das Einfügen von RFP in N1L Region überprüft wurde, wurde durch PCR unter Verwendung von Primern, RFP bestätigt. Die Spuren AF zu sechs gereinigten Plaques entsprechen, Spur G ist eine Steuertafel mit N1L Deletion in früheren Arbeiten überprüft 33, Spur Ctr (Kontrolle) ist das Wildtyp - Vaccinia - Virus (mit N1L Region intakt). A52R - Gen wurde als Kontroll - Gen für alle Proben amplifiziert. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Diskussion

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Es gibt zwei Hauptziele in Bezug auf Änderung von VV zu therapeutischen Zwecken. Eines ist ein bestimmtes Gen, wie beispielsweise die Thymidinkinase (TK) Gen zu deletieren Virus für Anti-Tumor-therapeutische Verwendung zu dämpfen. Die andere ist, VV mit einem gewünschten therapeutischen Gens (wie etwa GM-CSF) oder ein Markergen (wie Luciferase-Gen) zu bewaffnen. eine dieser Verwirklichung beinhaltet das Löschen eines Zielbereichs / Gen. Eine direkte DNA Ligierungstechnik 35 und ein In - vitro - Verpackungsverfahren 36 verwendet wurden zuvor mutierten Vaccinia - Viren mit TK Genveränderungen zu erzeugen. Jedoch haben diese Verfahren beschränkt Anwendung Mutation von anderen Regionen im Genom hinsichtlich aufgrund eines Mangels an einzigartigen Restriktionsenzymstellen über das Genom. Der derzeitige Ansatz Mutante VV zur Schaffung beinhaltet Transfektion eines Shuttle (Donor) Vektor mit einem Selektionsmarker (RFP oder GFP) in CV-1-Zellen zwei Stunden nach der Infektion mit VV eine homologe Rekombination diedrei zu induzierenng der Selektionsmarker in den Zielbereich. Die Auswahl der Marker-positiven Plaques wird durch ihre Reinigung 24 h nach der Transfektion gefolgt. Die Plaque-Reinigungsverfahren kann bis zu 10 Runden, letzten 3-4 Wochen dauern und führt oft zu unerwünschten rekombinanten Viren mit Selektionsmarker in Off-Target-Regionen eingesetzt. DNA - Doppelstrangbrüchen effektiv homologe Rekombination in Säugerzellen 37, induzieren und durch diesen Mechanismus die Nutzbarmachung der Wirkungsgrad mutant VV des Erzeugens kann erheblich verbessert werden. Die gRNA geführte Cas9 System wurde in der Genom Bearbeitung und verbessert die Effizienz der homologen Rekombination in eukaryotischen Organismen 22, 25. Letzter Zeit in Wirtszellen , die Genome von Adenovirus und Typ I Herpes Simplex Virus bearbeitet wurden von der gRNA geführte Cas9 erfolgreich eingesetzt System 24. Es wurde kürzlich gezeigt, dass CRISPR Cas9 System ein leistungsfähiges Werkzeug für die effiziente Bearbeitung der VV-Genom ist und ein VV Vektor Konstruktion für eine exprimierendenbestimmten Gens.

Beide N1L gRNA geführte Cas9 und die traditionelle homologe Rekombination (HR) Methode führte zu erfolgreichen HR Ereignissen an der gleichen Zielstelle von N1L. Interessanterweise jedoch gRNA geführte Cas9 induzierte HR bei viel höheren Wirkungsgrad als die herkömmliche Methode HR. Somit beseitigt die Verwendung von gRNA gelenkten Cas9 die Notwendigkeit, so viele Plaques zu reinigen mutant VVs zu erhalten. In dieser Arbeit konnten wir deutlich die Effizienz und den Zeitrahmen für die Erzeugung von Mutanten - VV die gRNA geführte Cas9 System 33 verwendet wird . Zu beachten ist, ist ein kritischer Schritt, eine hohe Effizienz der homologen Rekombination zur Gewinnung von CV-1-Zellen mit den Plasmiden exprimieren Cas9 und gRNA für 24 h zu transfizieren, bevor die herkömmliche homologe Rekombination durchgeführt wird. Die 24-h-Intervall erlaubt Cas9 und gRNA auf einem vernünftigen Niveau zum Ausdruck gebracht werden. Ferner müssen die gRNA Sequenz, die ein bestimmtes Gen Targeting kann optimiert werden, wie wir, dass die verschiedenen gRNA t Sequenzen gefundenargeting N1L Gen in ihrer Effizienz 33, 34 variiert.

Die Begrenzung für die CRISPR / Cas9 in Bearbeitung VV ist die niedrige Rate von RFP-positiven Plaques in der ersten Runde der Rekombination. Um eine ausreichende Anzahl von RFP-positiven Plaques enthaltenden rekombinanten Virus zu erhalten, in der Regel mindestens zehn 6-Well-Platten benötigt, was macht Erstrunden-Screening langweilig. Daher besteht immer noch ein Bedürfnis, das Protokoll zu optimieren, um diese Einschränkung zu überwinden.

Die geringe Größe des RFP-positiven Plaques ist ein weiteres potentielles Problem, das zu einem hohen Volumen von Lysat zurückzuführen ist verwendet, um eine 6-Well-Platte zu infizieren. Um dies zu überwinden, sollte ein kleineres Volumen des Lysats verwendet werden, um eine 6-Well-Platte zu infizieren, um größere Größe RFP-positive Plaques erhalten. ein kleineres Volumen von Lysat wird auch für eine bessere Trennung von RFP-positive Plaques aus den RFP-negativen ermöglichen. Folglich werden weniger Runden Plaquereinigung erforderlich reine RFP-positive Plaques zu erhalten.

Off-Target-Effekte sind immer ein unerwünschtes Problem in der Gen-Bearbeitung. CRISPR-Cas9 hat Off-Target-Effekte gezeigt. Doch mit einer sorgfältigen Gestaltung von gRNA, Off-Target - Effekte können vermieden werden , wenn die Bearbeitung der VV 33, 34 Genome. Dies ist der besondere Vorteil der gRNA geführte Cas9 System für die Bearbeitung des Genoms von VV. In Anbetracht der Versprechen von VV, mit dem CRISPR / Cas9 System wird die Entwicklung von mutierten VVs für die biomedizinische Forschung und in der translationalen Medizin beschleunigen. Darüber hinaus würde ein solches System auch beschleunigen Entdeckungen in der Zellbiologie, wie Dissektion der Signalwege von VV verwendet für die Aktin-basierte Motilität.

Offenlegungen

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Die Autoren haben keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Danksagungen

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch das MRC DPFS Stipendium (MR/M015696/1) und das Ministerium für Wissenschaft und Technologie von China (2013DFG32080).

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Plasmid #4182441824AddgenegRNA Klonierungsvektor
pST137413426AddgeneCas9 Klonierungsvektor
pGEMT easyA1360PromegaReparatur Donor Vektor Klonierung
One Shot TOP10 Chemisch kompetent E. coliC4040-10InvitrogenTransformation
QIAprep Spin Miniprep Kit 27106QiagenPlasmid-Extraktion
Dulbecco' s Adler" s Medium (DMEM)11965-092Life TechnologiesZellkulturmedium
fötales Rinderserum (FBS)SH30088.03HIHyclone-Zellkulturserum
Penicillin, Streptomycin15070-063Thermo ScientificAntibiotika
Effecten301425Qiagen-Transfektion
Thermo Scientific Nalgene Kryo-Fläschchen; 2.0  mLW-06754-96Thermo ScientificFluoreszenzmikroskop für Viren
Olympus BX51 Fluoreszenz Olympusfindet RFP-positive Plque
DNeasy Blood & Tissue Kit69506QiagenDNA-Extraktion
Extensor Long PCR ReddyMix Master MixAB-0794/BThermo ScientificPCR Reagenz
10 cm KulturschaleZ688819-6EASigmaZellkultur 
6-Well-PlatteZ707759 Sigma-Zellkultur 
ZellschaberC5981SigmaSchrottzellen
1x Trypsin-EDTA-LösungT4299Sigmatrypsinisieren Zellen
Virkon95015661Anachem LtdDesinfektionsmittel
Falcon TubeCLS430791-500EASigmaHold cell
suspension N1L forward 5'-TATCTAGCAATGGACCGT-3'SigmaPCR
Primer N1L reverse  5'-CCGAAGGTAGTAGCATGGA-3'SigmaPCR Primer
A52R forward 5'-ATAGGATTGTGTGCATGC-3'SigmaPCR Primer
A52R reverse 5'-TTGCGGTATATGTATGTAGG-3'SigmaPCR Primer
RFP vorwärts 5'- GCTACCGGACTCAGATCCA-3'    SigmaPCR-Primer
RFP reverse 5'-CGCCTTAAGATACATTGATGAG-3'SigmaPCR Primer
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