Summary
牛角膜内皮细胞的原代培养物用于研究角膜内皮 - 间充质转换的机制。此外，大鼠角膜内皮冷冻损伤模型被用来证明在体内角膜内皮-间充质转换。
Protocol
所有的程序遵循本研究中，在视觉与眼科声明协会研究给予了动物在眼科和视觉研究的用途和台大医院的机构动物护理和使用委员会批准。
1.隔离，原代培养制备与牛的CEC的免疫染色
- 从本地屠宰场获得新鲜牛的眼睛。
- 消毒在3分钟10％w / v的聚乙烯吡咯烷酮 - 碘溶液中的眼睛。用磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液洗涤。
- 收获在无菌条件下解剖刀和剪刀角膜按钮。去皮后弹力与在解剖显微镜下用镊子膜（请注意，在这项研究中，牛眼睛被一个本地屠场去核，因此，在第一研究过程是preenucleated眼睛的在实验室消毒）。
- 在1毫升试试孵育后弹力膜PSIN在37℃下30分钟。收集通过离心牛的CEC在112×g离心5分钟。重悬细胞于1ml补充激素上皮培养基（SHEM）含有HEPES缓冲的Dulbecco改进的Eagle培养基和哈姆的F12培养基，补充有5％胎牛血清，0.5％二甲亚砜，2纳克/毫升人表皮的等体积的生长因子，5毫克/毫升的胰岛素，5毫克/毫升转铁蛋白，5纳克/毫升硒，1纳摩尔/升霍乱毒素，50毫克/毫升庆大霉素，和1.25毫克/毫升两性霉素B的
- 种子的细胞（每眼约1×10 5个细胞）到一个直径6cm培养皿。培养他们在SHEM。孵育在37℃下的菜在5％CO 2在空气气氛中。改变培养基每3天。
- 当细胞达到汇合时，把它们洗干净的PBS，并在37°C孵育他们在1ml胰蛋白酶的5分钟。离心112×g离心5分钟收集它们。重悬在1ml的闪的细胞沉淀。
2.鼠角膜内皮细胞冷冻损伤模型和房内注射
- 麻醉12周大的雄性SD大鼠用2％甲苯噻嗪（5.6毫克/千克）和替来他明以及唑拉西泮（18毫克/千克）的肌内注射。轻轻捏住动物的皮肤，以确认在不存在皮肤抽搐适当麻醉。
- 灌输0.5％丙美卡因盐酸一滴对每只大鼠的右眼，以尽量减少眼痛和眨眼反射。灌输四环素软膏到左眼防止角膜干燥。
- 冷却在液氮中的不锈钢探针（直径= 3毫米）。不锈钢探针应用于右眼的角膜中央，持续30秒。在操作过程中频繁地灌输的PBS于右眼防止角膜干燥。
- 灌输0.1％阿托品和0.3％硫酸庆大霉素冷冻损伤后立即和每日一次，以减轻来自睫状肌痉挛造成眼部疼痛和预防感染。
- 手术后，继续使用热灯老鼠温暖，麻醉后观察其恢复每隔15分钟，直到他们重新获得电机控制。此外，应用四环素软膏右眼以防止在恢复期间角膜干。
- 重复角膜冷冻损伤连续3天。
- 用于递送马立马司他或bFGF的到大鼠眼睛的前房，如前所述麻醉大鼠。灌输一滴0.5％丙美卡因盐酸成右眼的，以尽量减少眼痛和眨眼反射。
- 灌溉用无菌PBS眼表面。通过上述和平行的平面中插入在paralimbal透明角膜附着到1ml注射器一个地下30针虹膜的手术显微镜下进行前房穿刺术。
- 打开针头斜面向上，并稍微踩下角膜伤口排出一些房水，降低眼压。注入0.02毫升药物的前房内。轻轻压缩与针撤出期间棉尖端的针道。
- 拍摄外眼在手术显微镜下所指示的时间点。
3.收获鼠角膜按钮和免疫
- 安乐死的大鼠，将它们放置在一个安乐死腔和以每分钟的腔室容积的10-30％的填充速率注入100％的CO 2。保持二氧化碳注入一个缺乏呼吸和褪色的眼睛的颜色后附加分。
- 穿透眼鼠在用锋利的刀片将角膜缘。切沿角膜缘剪刀眼角膜。拼合幻灯片上的眼角膜。作出额外的放射状切口，如果角膜蜷缩起身体。
- 修复角膜用250微升4％多聚甲醛的，pH为7.4，在室温下30分钟。用250微升0.5％的Triton X-100的5分钟通透，并用10％的牛血清白蛋白阻断30分钟。
- 在抗体稀释液200：为1的稀释孵育针对ABC初级抗体的角膜在4℃下过夜。用PBS洗角膜两次15分钟，并与二级抗体孵育它们：在室温下1小时（1 100在抗体稀释液）。染液通过覆盖细胞用2微克/毫升的4'，6-二脒基-2-苯基细胞核，并用PBS洗涤细胞两次15分钟。
- 安装在防褪色安装解决方案的眼角膜。 OB在20X物镜放大倍率覃在405激发波长的免疫荧光图像和561 nm的激光扫描共聚焦显微镜。
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Representative Results
牛的CEC的分离后，将细胞在体外培养， 图1给出了牛的CEC的相位对比图像。细胞在汇合的六边形表示细胞没有通过细胞分离过程中角膜基质成纤维细胞的污染。 图2描绘了使用针对ABC，蜗牛和蛞蝓的抗体在一个指定的时间点进行的免疫染色。除了 在体外培养的表型变化，观察到的ABC和EMT调节的相应核易位。 图3示出马立马司他的效果，具有广谱的MMP抑制剂，在体外培养的牛的CEC的EnMT过程。 图4包括冷冻损伤随后房内注射后的大鼠的外眼的照片。 图5示出了r的免疫染色在角膜钮被使用抗ABC冷冻损伤随后房内注射之后执行。 PBS组中观察到ABC的核转和bFGF的组中显著增加，表明Wnt信号/β-catenin信号和EnMT过程的激活。之后的bFGF房内注射后注射马立马司他，ABC核染色减少，暗示马立马司他的EnMT抑制效果。
图1： 在体外培养的牛的CEC在培养板上被接种后，将牛的CEC最初出现相位对比图像成纤维细胞样天3和6它们在达到第9天比例尺上完整合流变得更加六边形= 50微米。 3个重复的代表图像。4329fig1large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图2：主动β-catenin的： 在体外培养的牛的CEC在牛的CEC，ABC，蜗牛，蛞蝓和的核转的体外培养是通过14天检测ABC 免疫染色 。比例尺= 100微米。 3重复代表性的图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：带或不带不同的细胞融合层次马立马司他在体外培养的牛的CEC的免疫染色免疫染色恶魔trated，农行，蜗牛，蛞蝓和在有或无10μM第3天然而马立马司他的牛的CEC的核心是显而易见的，马立马司他显著减少ABC，蜗牛核染色，第9天的时候牛的CEC蛞蝓开始全面融合。比例尺= 100微米。 3重复代表性的图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4：在指定的时间点冷冻损伤后大鼠的外部眼睛的照片之后冷冻损伤，连续3天，将大鼠进行房内注射0.02毫升的PBS或50纳克/ ml的bFGF在第3天第6天，0.02毫升10μM的马立马司他是在的bFGF /马里组中的前房内注入，而将PBS中的其他2 GROU注入PS（N = 9每组）。而马立马司他进一步减少角膜水肿与单纯的bFGF相比每组 9 bFGF的注射后外眼照片显示出降低角膜水肿。比例尺= 1毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：收获第9天的大鼠角膜按钮大鼠角膜按钮的免疫染色免疫染色揭示了PBS组ABC的小核染色。在的bFGF组中，ABC，其中的bFGF /马里组中显著减少的广泛核染色。比例尺= 100微米。 请点击此处查看THI一个更大的版本的身影。
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Discussion
的CEC是众所周知的倾向中的细胞增殖经受EnMT。制定战略用于抑制EnMT过程用于治疗目的时，EnMT机构的透彻理解是必要的。我们描述了2模型，研究EnMT，即在体 外培养模型大鼠角膜内皮冷冻损伤模型牛CEC。我们的研究结果证明了这两款车型的EnMT过程。此外，马立马司他的EnMT抑制效应再现这两种模式，这表明这些2种型号共享相同的机制。
体外培养模型牛CEC提供易于操控。此外， 在以往的研究17,18采用体外培养模型人类或灵长类动物的CEC相比，牛眼睛是更大，更容易获得，因此有更多的CEC可用。在我们的研究中，我们获得了去核的牛眼睛从本地屠宰场。由于FRES的牛眼睛h的性质，收集牛的CEC的确切数目受变异，以每眼约1×10 5细胞。相比之下，人类的CEC的在正常角膜的数量大约为3×10 5个每眼。这个数字是低在学习等级眼角膜是移植后残留角膜边缘甚至更低。收获过程中的操作将进一步减少获得的细胞的数量。此外，牛的CEC可以增殖并自发进行EnMT;因此， 在体外培养模型中的牛的CEC是在调查EnMT机理和筛选EnMT抑制化学物质，如马立马司他有用。虽然仍存在关于物种相关的差异，如的CEC的增殖能力的关注，我们的结果表明，牛的CEC的EnMT信号通路类似于人类的CEC，包括的Wnt /β-catenin的18,19的激活。
帐篷“>在牛的CEC的分离，剥离后弹力膜是至关重要的。在一些牛眼中，Descemet膜可以具有密合性的角膜基质，从而导致上剥离的Descemet膜过度基质组织。另外胰蛋白酶可能导致该转变成角膜成纤维细胞，从而影响细胞的纯度，因此，实验结果。在我们的研究中，我们仔细在显微镜下剥离的Descemet膜。为了进一步确保细胞纯度基质角膜的释放，我们首先培养收获的细胞中有6厘米培养皿直到细胞汇合。只有当细胞在形状六角形是它们在进一步的实验中使用。为了进一步证实在体外培养模型牛CEC的调查结果，我们使用在以往的研究20,21通过了鼠角膜内皮冷冻损伤模型。冷冻损伤后，大鼠的CEC中再生，manife接受EnMT由活性β连环蛋白的核易位STED，表明Wnt信号/β-catenin信号的活化CEC再生过程中种间保守的。另外，由于低CEC功能导致明显角膜水肿该模型是在调查的CEC的功能是有用的。与其它设备，如超声生物显微镜，眼前段光学相干断层成像，和共聚焦显微镜相结合，角膜厚度可以定量评价，因而反映CEC功能。
为了刺激的CEC的再生和伤口愈合后抑制EnMT，我们给予其次是马立马司他注射的bFGF房内注射。治疗显著减少角膜水肿的程度。以前的研究已经使用CEC生长刺激剂，如ROCK抑制剂，和EnMT抑制剂，诸如槽口抑制剂21,22的局部施用。然而，药物的渗透到CEC铺设器是由角膜上皮和基质，这可能会影响治疗功效23限定。在对比局部施用，房内注射使通过将药物直接进入前房到角膜内皮的直接访问。因此，化学品的生长刺激和EnMT抑制效果可以无偏以下冷冻损伤评估。在我们的研究中，我们进行前房穿刺降低房内注射前的眼压。无穿刺术，眼内压的突然增加导致角膜水肿或甚至通过针道虹膜脱垂。轻轻地压缩在针头收回艾滋病道密封伤口，防止感染眼内。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trypsin | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| human epidermal growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulin, transferrin, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-active beta-catenin antibody | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail antibody | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug antibody | Santa cruz | sc15391 | |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11001 | for staining of ABC of bovine CECs |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11003 | for staining of ABC of rat corneal endothelium |
| goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | for staining of snail and slug of bovine CECs |
| antibody diluent | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laser scanning confocal microscope | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinary drug |
| proparacaine hydrochloride ophthalmic solution | Alcon | N/A | veterinary drug |
| 0.1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | clinical drug |
| 0.3% gentamicin sulfate | Sinphar Group | N/A | clinical drug |
| basic fibroblast growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | clinical drug |
References
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