Summary
A cultura primária de células endoteliais da córnea de bovino foi utilizada para investigar o mecanismo de transição endotelial-mesenquimais da córnea. Além disso, um modelo criolesão endotélio corneano de rato foi utilizado para demonstrar transição endotelial-mesenquimais da córnea in vivo.
Protocol
Todos os procedimentos seguidos neste estudo concedidas com a Associação de Pesquisa em Visão e Oftalmologia Declaração de Uso de Animais em Oftalmologia e Vision Research e foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do National Taiwan University Hospital.
1. Isolamento, cultura Preparação Primária e imunocoloração de Bovinos PEC
- Adquirir olhos bovinos frescas de um matadouro local.
- Desinfectar os olhos em um 10% w / v solução de povidona-iodo durante 3 min. Lavá-las com uma solução tamponada de fosfato salino (PBS).
- Colheita do botão da córnea com um bisturi e tesouras sob condições estéreis. membrana de Descemet Descasque a com uma pinça sob um microscópio de dissecação (notar que, neste estudo, os olhos foram enucleados bovina por um matadouro local, portanto, o primeiro procedimento de pesquisa foi a desinfecção dos olhos preenucleated no laboratório).
- Incubar a membrana de Descemet, em 1 ml de tentativapsin a 37 ° C durante 30 min. Recolher os CECs bovinos por centrifugação a 112 xg por 5 min. Ressuspender as células em 1 ml de meio suplementado epitelial hormonal (SHEM) contendo volumes iguais de meio de HEPES-tamponizada de Dulbecco modificado por Eagle e meio F12 de Ham, suplementado com 5% de soro fetal bovino, 0,5% de sulfóxido de dimetilo, 2 ng / ml de epidérmico humano factor de crescimento, 5 mg / ml de insulina, 5 mg / ml de transferrina, 5 ng / ml de selénio, 1 nmol / l de toxina de cólera, 50 mg / ml de gentamicina e 1,25 mg / ml de anfotericina B.
- Semear as células (cerca de 1 x 10 5 células por olho) em um disco de 6 cm. Cultura-los no Sem. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO2 em ar. Mudar o meio de cultura a cada 3 dias.
- Quando as células atingem a confluência, lavá-las em PBS e incubar em 1 ml de tripsina a 37 ° C durante 5 min. Recolhe-los por centrifugação a 112 xg durante 5 min. Re-suspender o sedimento de células em 1 ml de SHEM.
2. Rat Corneal endotélio criolesão modelo e injeção intracamerais
- Anestesiar ratos machos 12 semanas de idade, Sprague-Dawley machos com injecções intramusculares de 2% de xilazina (5,6 mg / kg) e mais tiletamina zolazepam (18 mg / kg). Suavemente comprimir a pele dos animais para confirmar a anestesia adequada na ausência de espasmos pele.
- Instilar uma gota de cloridrato de proparacaína 0,5% no olho direito de cada rato para minimizar a dor dos olhos e do reflexo de piscar. instilarpomada de tetraciclina para o olho esquerdo para evitar o ressecamento da córnea.
- Arrefece-se uma sonda de aço inoxidável (diâmetro = 3 mm) em azoto líquido. Aplicar a sonda de aço inoxidável para o centro da córnea do olho direito durante 30 seg. incutir frequentes PBS para o olho direito durante o procedimento para prevenir o ressecamento da córnea.
- Instilar 0,1% atropina e 0,3% de sulfato de gentamicina imediatamente após criolesão e uma vez ao dia para aliviar a dor ocular resultante de espasmo ciliar e para prevenir a infecção.
- Após o procedimento, manter os ratos aquecer usando uma lâmpada de calor, e observar a sua recuperação a cada 15 minutos após a anestesia até que recuperar o controle motor. Além disso, aplique pomada de tetraciclina para o olho direito de prevenir o ressecamento da córnea durante o período de recuperação.
- Repita o criolesão córnea durante 3 dias consecutivos.
- Para entregar o marimastat ou de bFGF na câmara anterior dos olhos de ratos, anestesiar os ratos, tal como descrito anteriormente. Instilar uma gotade 0,5% de cloridrato proparacaína no olho direito para minimizar a dor dos olhos e do reflexo de piscar.
- Irrigar a superfície ocular com PBS estéril. Realizar paracentese da câmara anterior sob um microscópio de operação através da inserção de uma agulha de 30 G ligada a uma seringa de 1 ml na córnea clara paralimbal num plano acima e paralelo ao da íris.
- Rode a agulha de bisel para cima, e ligeiramente deprimir o ferimento da córnea para drenar um pouco de humor aquoso e reduzir a pressão intra-ocular. Injectar 0,02 ml da droga intracamerally. Gentilmente comprimir o trato agulha com uma ponta de algodão durante a retirada da agulha.
- Fotografar a parte externa do olho em um ponto de tempo indicado sob o microscópio cirúrgico.
3. Colheita do Rato Botão de córnea e imunocoloração
- A eutanásia os ratos, coloque-os em uma câmara de eutanásia e infundir 100% de CO2 a uma taxa de preenchimento de 10-30% do volume da câmara por minuto. Manter CO 2 para uma infusãominuto adicional após a falta de respiração e cor dos olhos desapareceu.
- Penetrar no olho do rato no limbo com uma lâmina afiada. Corte as córneas com uma tesoura ao longo da córnea do limbo. Achate as córneas em um slide. Fazer incisões radiais adicionais se as córneas enrolar.
- Fixar as córneas com 250 uL de paraformaldeído a 4%, pH 7,4, durante 30 min à temperatura ambiente. Permeabilizar com 250 ul de 0,5% de Triton X-100 durante 5 min, e bloquear com 10% de albumina de soro de bovino durante 30 min.
- Incubar as córneas com anticorpos primários contra ABC durante a noite a 4 ° C com uma diluição de 1: 200 em diluente de anticorpo. Lavam-se as córneas, duas vezes com PBS durante 15 min, e incubar com o anticorpo secundário (1: 100 em diluente de anticorpo) à temperatura ambiente durante 1 h. Contracoloração o núcleo da célula, cobrindo as células com 2 ug / ml de 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole, e lavar as células duas vezes com PBS durante 15 min.
- Monte as córneas em anti-fading solução de montagem. obtain as imagens de imunofluorescência em comprimentos de onda de excitação de 405 e 561 nm com um microscópio confocal de varredura a laser com ampliação de 20x objetiva.
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Representative Results
Após o isolamento de PEC bovina, as células foram cultivadas in vitro. A Figura 1 apresenta as imagens de contraste de fase do PEC bovina. A forma hexagonal das células em confluência indicaram que as células não foram contaminadas pelos fibroblastos do estroma da córnea durante o isolamento de células. A Figura 2 mostra a imunocoloração que foi realizada utilizando anticorpos contra ABC, caracol, e lesma em um ponto de tempo indicado. Para além de alterações fenotípicas em cultura in vitro, foi observada uma translocação nuclear correspondente de reguladores de ABC e EMT. A Figura 3 ilustra o efeito de o marimastat, um inibidor MMP de largo espectro, no processo EnMT dos PEC bovinos cultivadas in vitro. A figura 4 compreende as fotografias externa do olho de ratos após criolesão seguido por injecção intracameral. a Figura 5 mostra a imunocoloração do r no botão da córnea que foi realizada utilizando anticorpos contra ABC criolesão depois seguido por injeco intracameral. A translocação nuclear de ABC foi observada no grupo de PBS e foi significativamente aumentada no grupo de bFGF, indicando a activação da sinalização / β-catenina e Wnt processo EnMT. Após a injeção intracameral de bFGF seguido de injecção marimastat, a coloração nuclear da ABC foi diminuída, sugerindo o efeito EnMT de inibição de marimastat.
Figura 1:. Imagens de contraste de fase de produção in vitro PEC bovinas em cultura Depois de ser semeadas na placa de cultura, o PEC bovina inicialmente parecia tipo fibroblasto nos dias 3 e 6. Tornaram-se mais hexagonal após atingir confluência completa no dia 9. A barra de escala = 50? m. Imagens representativas de 3 repetições.4329fig1large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: A imunocoloração in vitro PEC bovinos cultivadas Durante a cultura in vitro do PEC bovina, a translocação nuclear do ABC, caracol e lesma foi detectado até ao dia 14. ABC:. Ativo β-catenina. Barra de escala = 100 pm. Imagens representativas de 3 repetições. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3:. Imunocoramento in vitro PEC bovinos cultivadas com ou sem marimastat em diferentes níveis confluência celular imunocoloração demôniostrado que a ABC, caracol e lesma eram evidentes no núcleo dos CECs bovinos com ou sem 10 mM de marimastat no dia 3. No entanto, marimastat reduziu significativamente a coloração nuclear da ABC, caracol e lesma no dia 9, quando os PEC bovina tornou-se plenamente confluentes. Barra de escala = 100 pm. Imagens representativas de 3 repetições. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4:. Fotografias externa do olho de ratos nos pontos de tempo indicados após criolesão Seguindo criolesão durante 3 dias consecutivos, os ratos foram sujeitos a uma injecção intracameral de 0,02 ml de PBS ou 50 ng / ml de bFGF no dia 3. No dia 6, 0,02 ml de 10 uM marimastat foi injectada no grupo intracamerally bFGF / Mari, enquanto PBS foi injectada na outra 2 grouPS (n = 9 em cada grupo). Fotografias oculares externas revelaram redução do edema da córnea após a injecção de bFGF, ao passo que o marimastat ainda mais reduzida edema da córnea em comparação com bFGF sozinho. N = 9 em cada grupo. Barra de escala = 1 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5:. Imunocoloração de botões de rato córnea imunocoloração dos botões da córnea de ratos que foram colhidas no dia 9 revelou coloração nuclear pouco do ABC no grupo PBS. No grupo de bFGF, houve coloração nuclear de grande ABC, que foi significativamente reduzida no grupo de bFGF / Mari. Barra de escala = 100 mm. Por favor clique aqui para ver uma versão maior do this figura.
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Discussion
PEC são conhecidos pela sua propensão para sofrer EnMT durante a proliferação celular. Para desenvolver estratégias para suprimir o processo EnMT para fins terapêuticos, uma profunda compreensão do mecanismo EnMT é necessário. Nós descrevemos 2 modelos para investigar EnMT, ou seja, a CEC bovina em modelo de cultura in vitro e rato modelo criolesão endotélio corneano. Os nossos resultados demonstram o processo EnMT em ambos os modelos. Além disso, o efeito de supressão de EnMT marimastat foi reproduzida em ambos os modelos, o que sugere que estes 2 modelos partilham o mesmo mecanismo.
A CEC bovina em modelo de cultura in vitro oferece facilidade de manipulação. Além disso, em comparação com o CTC humano ou primata em modelos de cultura in vitro empregues em estudos anteriores 17,18, bovina olhos são maiores e mais fáceis de adquirir e, portanto, tem mais PEC disponível. Em nosso estudo, nós adquirimos os olhos bovinos enucleados de um matadouro local. Por causa das Fres h natureza dos olhos bovina, o número exacto de PEC bovina colhido está sujeito a variação, em cerca de 1 x 10 5 células por olho. Por outro lado, o número de PEC humanos em uma córnea normal é de aproximadamente 3 x 10 5 por olho. Este número é inferior em córneas estudo grau e é ainda menor nas bordas da córnea residuais após o transplante. Manipulações durante o procedimento de colheita vai reduzir ainda mais o número de células obtidas. Além disso, PEC bovinos podem proliferar e passam por EnMT espontaneamente; por conseguinte, o CCE modelo de bovino em cultura in vitro é útil na investigação do mecanismo de rastreio de produtos químicos e EnMT EnMT-supressores, tais como marimastat. Embora não permanece preocupação com diferenças de espécies relacionadas, tais como a capacidade proliferativa de PEC, os nossos resultados demonstraram que a via de sinalização de PEC EnMT bovina é semelhante ao do PEC humanos, incluindo a activação da via Wnt / β-catenina 18,19.
tenda "> durante o isolamento de PEC bovina, descamação da membrana de Descemet é crítica. Em alguns olhos bovina, a membrana de Descemet pode ter aderência apertada com o estroma da córnea, o que leva ao tecido estromal excessivo sobre a membrana de Descemet desenrolada. Além disso tripsinização pode levar a a libertação de ceratócitos de estroma que se transformam em fibroblastos da córnea, que afectam a pureza das células e, por conseguinte, os resultados experimentais. no nosso estudo, descascadas membrana de Descemet cuidadosamente sob um microscópio. Para garantir ainda mais a pureza da célula, primeiro cultivadas as células colhidas num seis cm de prato, até confluência celular. Apenas quando as células foram de forma hexagonal que foram utilizados em experiências adicionais.Para substanciar as conclusões do CEC bovina em modelo de cultura in vitro, foi utilizado o modelo criolesão endotélio corneano de ratos adotada em estudos anteriores 20,21. Após criolesão, os CECs de ratos foram submetidos a EnMT durante a regeneração, manifested pela translocação nuclear de β-catenina activa, indicando que a activação da sinalização de Wnt / β-catenina é conservada entre espécies durante a regeneração CEC. Além disso, este modelo é útil na investigação da função de PEC porque baixa função CEC leva ao edema da córnea óbvia. Combinado com outros equipamentos, tais como biomicroscópio ultra-som, segmento anterior tomografia de coerência óptica e microscopia confocal, a espessura da córnea pode ser avaliado quantitativamente e, portanto, refletir a função CEC.
Para estimular a regeneração do PEC e suprimir EnMT após a cicatrização de feridas, administrou injecções intracamerais de bFGF seguido de injecção marimastat. O tratamento reduziu significativamente a extensão do edema da córnea. Estudos anteriores têm utilizado a aplicação tópica de agentes estimulantes do crescimento CEC, tais como inibidor de ROCK, e agentes EnMT-supressores, tais como inibidor de 21,22 Notch. No entanto, a penetração de medicamentos para o CCE estabelecerer é limitado pelo epitélio da córnea e estroma, que podem influenciar a eficácia do tratamento 23. Em contraste com a aplicação tópica, injecção intracameral permite o acesso directo ao endotélio da córnea através da introdução de drogas directamente para a câmara anterior. Portanto, o efeito de supressão de EnMT e estimulador de crescimento de produtos químicos pode ser avaliada unbiasedly criolesão seguinte. No nosso estudo, foi realizada paracentese da câmara anterior para reduzir a pressão intra-ocular antes da injecção intracameral. Sem paracentese, um aumento abrupto na pressão intra-ocular provoca edema da córnea ou mesmo prolapso da íris através do tracto da agulha. Suavemente comprimindo o tracto durante auxiliares de retirada da agulha na selagem a ferida e prevenção da infecção intra-ocular.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| trypsin | ThermoFisher Scientific | 12604-013 | |
| Dulbecco’s modified Eagle medium and Ham's F12 medium | ThermoFisher Scientific | 11330 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 26140-079 | |
| dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650 | |
| human epidermal growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0311 | |
| insulin, transferrin, selenium | ThermoFisher Scientific | 41400-045 | |
| cholera toxin | Sigma | C8052-1MG | |
| gentamicin | ThermoFisher Scientific | 15750-060 | |
| amphotericin B | ThermoFisher Scientific | 15290-026 | |
| paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 111219 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| bovine serum albumin | Sigma | A7906 | |
| marimastat | Sigma | M2699-25MG | |
| anti-active beta-catenin antibody | Millpore | 05-665 | |
| anti-snail antibody | Santa cruz | sc28199 | |
| anti-slug antibody | Santa cruz | sc15391 | |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11001 | for staining of ABC of bovine CECs |
| goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11003 | for staining of ABC of rat corneal endothelium |
| goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | ThermoFisher Scientific | A-11008 | for staining of snail and slug of bovine CECs |
| antibody diluent | Genemed Biotechnologies | 10-0001 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole | ThermoFisher Scientific | D1306 | |
| mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | |
| laser scanning confocal microscope | ZEISS | LSM510 | |
| xylazine | Bayer | N/A | |
| tiletamine plus zolazepam | Virbac | N/A | veterinary drug |
| proparacaine hydrochloride ophthalmic solution | Alcon | N/A | veterinary drug |
| 0.1% atropine | Wu-Fu Laboratories Co., Ltd | N/A | clinical drug |
| 0.3% gentamicin sulfate | Sinphar Group | N/A | clinical drug |
| basic fibroblast growth factor | ThermoFisher Scientific | PHG0024 | clinical drug |
References
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