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Die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele als Werkzeug für therapeutische Anwendungen

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DOI:

10.3791/54445

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7. Oktober 2016

 ,  , 
1Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "Giulio Natta", Politecnico di Milano

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Wir präsentieren ein Protokoll für die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogelen als Bauelemente für die Zell- und Wirkstoffabgabe. Das Verfahren beinhaltet eine kupferkatalysierte Alkinazid-Cycloaddition (CuAAC) zwischen alkinmodifizierter Polyacrylsäure (PAA) und einem RGD-Azid-Derivat. Die Hydrogele werden mittels mikrowellenunterstützter Polykondensation gebildet und ihre physikalisch-chemischen Eigenschaften untersucht.

Zusammenfassung

Die Verwendung von Polymeren als Biomaterialien hat bei therapeutischen Anwendungen erhebliche Vorteile gebracht. Insbesondere die Möglichkeit, Polymerketten mit Verbindungen zu modifizieren und zu funktionalisieren, die in der Lage sind, die Biokompatibilität, die mechanischen Eigenschaften oder die Zellviabilität zu verbessern, ermöglicht das Design neuartiger Materialien, um neuen Herausforderungen im biomedizinischen Bereich gerecht zu werden. Mit den Polymerfunktionalisierungsstrategien ist die Klickchemie ein leistungsstarkes Werkzeug, um die Zellkompatibilität und die Wirkstoffabgabeeigenschaften von polymeren Bauelementen zu verbessern. In ähnlicher Weise führt die grundlegende Notwendigkeit der Biomedizin, sterile Werkzeuge zu verwenden, um mögliche nachteilige Nebenwirkungen wie Toxizität oder Kontamination der biologischen Umgebung zu vermeiden, zu einem zunehmenden Interesse an der mikrowellengestützten Strategie.

Die Kombination aus Click-Chemie und der mikrowellenunterstützten Methode eignet sich zur Herstellung biokompatibler Hydrogele mit gewünschten Funktionalitäten und verbesserter Leistung in biomedizinischen Anwendungen. Ziel dieser Arbeit ist die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogelen. RGD (Arginylglycylasparaginsäure) ist ein Tripeptid, das Zelladhäsionsproteine nachahmen und an Rezeptoren auf der Zelloberfläche binden kann, wodurch eine gastfreundliche Mikroumgebung für Zellen innerhalb des 3D-Polymernetzwerks der Hydrogele geschaffen wird. Die RGD-Funktionalisierung erfolgt durch Huisgen 1,3-dipolare Cycloaddition. Einige PAA-Carboxylgruppen sind mit einem Alkinanteil modifiziert, während RGD mit Azidosäure als terminalem Rest der Peptidsequenz funktionalisiert ist. Schließlich werden beide Produkte in einer kupferkatalysierten Klickreaktion eingesetzt, um das Peptid dauerhaft an PAA zu binden. Dieses modifizierte Polymer wird zusammen mit Carbomer, Agarose und Polyethylenglykol (PEG) verwendet, um eine Hydrogelmatrix zu synthetisieren. Die 3D-Struktur entsteht durch eine Veresterungsreaktion mit Carboxylgruppen aus PAA und Carbomer- und Hydroxylgruppen aus Agarose und PEG durch mikrowellenunterstützte Polykondensation. Die Effizienz des Gelierungsmechanismus sorgt für einen hohen Grad an RGD-Funktionalisierung. Darüber hinaus ist das Verfahren, therapeutische Wirkstoffe oder biologische Werkzeuge innerhalb dieses funktionalisierten Netzwerks zu laden, sehr einfach und reproduzierbar.

Einleitung

Hydrogele sind dreidimensionale Netzwerke durch hydrophile vernetzte Polymere gebildet werden, die natürlich oder synthetisch sind, und die durch eine ausgeprägte dreidimensionale Struktur aus. Diese Geräte sind zunehmend attraktiv in den biomedizinischen Bereichen Medikamentenabgabe, Tissue Engineering, Genträger und intelligente Sensoren 1,2. Tatsächlich ihres hohen Wassergehaltes sowie ihre rheologischen und mechanischen Eigenschaften machen sie geeignete Kandidaten Weichgewebe Mikroumgebungen zu imitieren und sie wirksame Werkzeuge für wasserlösliche Zytokin oder Wachstumsfaktor-Lieferung. Einer der vielversprechendsten ist die Verwendung als injizierbare Biomaterial Zellen und bioaktiven Verbindungen trägt. Hydrogele können das Überleben von Zellen und Kontrollstammzell Schicksal durch Halten und präzise Abgabe Stammzellregulationssignale in einer physiologisch relevanten Art und Weise verbessern, wie 3,4 in in vitro und in in vivo Experimenten beobachtet. Der führende Vorteil hierbei ist die Möglichkeit,injizierten Zellen innerhalb der Zone der Impfung (in situ), Minimierung der Menge an Zellen zu erhalten, die das Gebiet und Extravasate in den Kreis Strom verlässt, über den ganzen Körper der Migration und dem angestrebten Ziel 5 zu verlieren. Die Stabilität der dreidimensionalen Netzwerke Hydrogels ist aufgrund seiner Vernetzungsstellen, gebildet durch kovalente Bindungen oder Kohäsionskräfte zwischen den Polymerketten 6.

In diesem Rahmen angewendet orthogonal selektive Chemie an Polymerketten ist ein vielseitiges Werkzeug in der Lage 7 Hydrogel Leistungen zu verbessern. Tatsächlich könnte die Modifikation von Polymeren mit geeigneten chemischen Gruppen helfen, geeignete chemische, physikalische und mechanische Eigenschaften bereitzustellen Lebensfähigkeit der Zellen und deren Verwendung in der Gewebebildung zu verbessern. In gleicher Weise zu den Techniken Zellen oder Wachstumsfaktoren innerhalb der Gelmatrix, die Verwendung des RGD-Peptid ermöglicht Verbesserungen in der Zelladhäsion und das Überleben zu laden. RGD ist ein Tripeptid zusammengesetztvon Arginin, Glycin und Asparaginsäure, die bei weitem das wirksamste und oft eingesetzt Tripeptid aufgrund seiner Fähigkeit , mehr als eine Zelladhäsion - Rezeptor und seine biologische Wirkung auf die Zellverankerung, Verhalten und Überleben 8,9 zu adressieren ist. In dieser Arbeit wird die Synthese von RGD-funktionalisierten Hydrogele mit dem Ziel der Netzwerke durch ausreichende biochemische Eigenschaften für eine gastliche Zelle Mikro gekennzeichnet Gestaltung studiert.

Die Verwendung von Mikrowellenstrahlung in Hydrogel - Synthese bietet ein einfaches Verfahren , um Nebenreaktionen zu minimieren und höhere Reaktionsgeschwindigkeiten und Ausbeuten in kürzerer Zeit im Vergleich zu den herkömmlichen thermischen Verfahren 10 erhalten. Dieses Verfahren erfordert keine Reinigungsstufen und Ausbeuten sterile Hydrogele aufgrund der Wechselwirkungen der Polymere und der Abwesenheit eines organischen Lösungsmittels in dem Reaktionssystem 11. Daher gewährleistet es einen hohen Prozentsatz von RGD gebunden an das polymere Netzwerk, da kein modkationen werden den Polymer chemischen Gruppen erforderlich Gelbildung beteiligt. Carboxygruppen, von PAA und Carbomer, und Hydroxylgruppen von PEG und Agarose, führen zu dem Hydrogel dreidimensionale Struktur durch eine Polykondensationsreaktion. Die genannten Polymere werden für die Synthese von Hydrogelen in die Rückenmarksverletzung Reparaturbehandlungen 12 verwendet. Diese Geräte, wie in den vorangegangenen berichtet arbeitet 13,14, zeigen eine hohe Biokompatibilität sowie mechanischen und physikalisch - chemische Eigenschaften, die denen von vielen lebenden Geweben und in thixotropen Natur ähneln. Außerdem bleiben sie in situ lokalisiert in der Zone der Injektion.

In dieser Arbeit PAA Carboxylgruppen mit einem Alkin - Einheit (1) modifiziert und eine RGD-Azid - Verbindung synthetisiert wird , die Reaktivität des Tripeptids Endgruppe NH 2 mit einer vorbereiteten chemische Verbindung mit der Struktur zu nutzen (CH 2) n - N 3 ( Abbildung 2). Anschließend reagiert das modifizierte PAA mit dem RGD-Azid - Derivat durch CuAAC Klick - Reaktion 15-17 (Abbildung 3). Die Verwendung eines Kupfer (I) -Katalysator führt zu wesentlichen Verbesserungen in sowohl die Reaktionsgeschwindigkeit und die Regioselektivität. Die CuAAC Reaktion wird in der organischen Synthese und in der Polymerwissenschaft weit verbreitet. Es verbindet einen hohen Wirkungsgrad und eine hohe Toleranz gegenüber den funktionellen Gruppen, und es ist unabhängig von der Verwendung von organischen Lösungsmitteln. Eine hohe Selektivität, eine schnelle Reaktionszeit und eine einfache Reinigungsverfahren ermöglichen die Gewinnung von Sternpolymeren, Blockcopolymere oder Ketten gewünschten Einheiten 18 Pfropfen. Dieser Klick-Strategie ermöglicht es, Polymere nach der Polymerisation zu modifizieren, um die physikalisch-chemischen Eigenschaften nach der endgültigen biochemischen Anwendung anpassen. Die CuAAC experimentellen Bedingungen sind leicht reproduzierbar (die Reaktion ist unempfindlich gegen Wasser, während Kupfer Oxidation minimal auftreten kann), und die Art dergebildet Triazol sorgt für Stabilität des Produkts. Die Verwendung von Kupfermetall kann ein kritischer Punkt, aufgrund seiner potentiellen toxischen Wirkung gegenüber Zellen und in der biologischen Mikroumgebung in Betracht gezogen werden, aber der Dialyse wird als Reinigungsverfahren verwendet, um die vollständige Entfernung von katalytischen Rückständen ermöglichen. Schließlich PAA modifizierte RGD in Hydrogel - Synthese (4) und die physikalisch - chemischen Eigenschaften der resultierenden Netzwerken verwendet wird untersucht, um die potentielle Funktionalität dieser Systeme als Zellen oder Drogen Träger zu überprüfen.

figure-introduction-1
Abbildung 1: PAA modifizierte Alkin Synthese ein Schema PAA Funktionalisierung mit Alkin - Gruppe;. "n" gibt die Monomere mit Carboxylgruppe mit Propargylamin reagieren. Bitte klicken Sie hier um zu seheneine größere Version dieser Figur.

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Abbildung 2:.. RGD-Azid - Synthese Die Synthese von RGD-Azid - Derivat Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 3: Klicken Sie auf Reaktionsschema der Klick - Reaktion zwischen RGD-Azid - Derivat und Alkin-PAA.. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 4: Hydrogele synthesis. RGD funktionalisierten Hydrogel - Syntheseverfahren. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Protokoll

Anmerkung: Die verwendeten Chemikalien sind wie empfangen. Linear RGD gekauft wird , aber es kann durch Standard - Fmoc - Festphasen - Peptidsynthese 16,19 hergestellt werden. Lösungsmittel sind von analytischer Qualität. Die Dialyse erfordert die Verwendung von Membran mit einem M w cut-off gleich 3.500 Da. Die synthetisierten Verbindungen werden durch 1 H - NMR - Spektren wurden auf einem 400 MHz - Spektrometer unter Verwendung von Chloroform (CDCl 3) oder Deuteriumoxid (D 2 O) als Lösungsmittel, und die chemischen Verschiebungen sind angegeben als δ - Werte in ppm aufgezeichnet gekennzeichnet. Weiterhin sind Hydrogele unterworfen FT-IR-Analyse KBr Pellet-Technik und ihrer physikalischen Charakterisierung beinhaltet die Gelierung Studien untersucht unter Verwendung der invertierten Teströhrchen bei 37 ° C verwendet wird.

1. Synthese von 4-Azidobutanoyl Chloride 1

  1. Man löst 500 mg 4-azidobutanoic Säure (3,90 mmol) in 10 ml Dichlormethan und 0,5 ml Dimethylformamid gegeben.
  2. Die Lösung wird bei 0 ° C, Mit einem Eisbad.
  3. Hinzufügen 505 ul Oxalylchlorid (5,85 mmol) zu 5 ml Dichlormethan gelöst und langsam tropfenweise zu dem Reaktionssystem hinzuzufügen, während gerührt wurde.
  4. Nach 1 Stunde bei 0 ° C mit einem Eisbad, Rückkehr zur Raumtemperatur.
  5. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer.
  6. Charakterisieren des erhaltenen Produkts durch 1 H-NMR - Spektroskopie, um die Probe in CDCl 3 16 aufzulösen.

2. Synthese von RGD-Azid-Derivat 2

  1. Man löst 50 mg RGD (0,145 mmol) in 1 ml 1 M NaOH.
  2. Man löst 24 mg 1 (0,16 mmol) in 2 ml Tetrahydrofuran gegeben.
  3. Fügen Sie alle der RGD - Lösung zu Lösung 1 tropfenweise bei 0 ° C mit einem Eisbad.
  4. Rückkehr auf Raumtemperatur und rühre über Nacht.
  5. 1 ml 1 M HCl.
  6. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck am Rotationsverdampfer.
  7. Charakterisieren Sie die obtained Produkts durch 1 H-NMR - Spektroskopie, Lösen der Probe in D 2 O 16.

3. PAA Alkin Modifikation 3

  1. Man löst 200 mg von 35% w / w PAA-Lösung (2,8 mmol) in 15 ml destilliertem Wasser.
  2. Hinzufügen 15,4 mg Propargylamin-hydrochlorid (0,20 mmol).
  3. Man löst 42,8 mg von 1-Hydroxybenzotriazol-hydrat (HOBt, 0,28 mmol) in 14 ml eines 1: 1 v / v Acetonitril: destilliertes Wasser-Lösung durch Erhitzen auf 50 ° C.
  4. Fügen alle der HOBt-Lösung PAA-Lösung bei Raumtemperatur.
  5. Hinzufügen, 53,6 mg Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid (EDC, 0,28 mmol) zu dem Reaktionsgemisch.
  6. Verwenden Sie 1 M HCl, um den pH-Wert auf 5,5 und rührt das Reaktionssystem über Nacht bei Raumtemperatur einzustellen.
  7. Dialysieren der Lösung. Man löst 11,2 g Natriumchlorid in 2 l destilliertem Wasser und füge dann 0,2 ml 37% w / w HCl. Dialysieren der Lösung mit einer Membran mit einem M w cut-off von 3,5 kDa verwendet wird .
  8. Perform Dialyse für drei Tage. Ändern, um die Dialyselösung täglich mit 2 l frisch destilliertem Wasser hergestellt, das 0,2 ml 37% w / w HCl.
  9. Bewahren Sie die endgültige Lösung bei -80 ° C. Lyophilisieren es in einem Lyophilisator nach Herstellerprotokollen.
  10. Charakterisierung des funktionalisierten Polymers durch 1 H-NMR - Spektroskopie, Lösen der Probe in D 2 O 16.

4. Synthese von PAA-RGD Polymer 4

  1. Man löst 78 mg des modifizierten PAA Alkin 3 (1,083 mmol) in 10 ml destilliertem Wasser.
  2. Man löst 25 mg des RGD Azid 2 Derivat (0,0722 mmol) in 5 ml Tetrahydrofuran gegeben.
  3. Fügen alle der RGD Lösung der Polymerlösung.
  4. Hinzufügen 2,2 mg Kupferiodid (0,0116 mmol) und 2,2 mg Natriumascorbat (0,0111 mmol).
  5. Rückfluß der resultierenden Mischung über Nacht bei 60 ° C unter Rühren.
  6. Das Gemisch wird auf 25 ° C.
  7. Dialyze die Lösung. Man löst 11,2 g Natriumchlorid in 2 l destilliertem Wasser und füge dann 0,2 ml 37% w / w HCl. Dialysieren der Lösung mit einer Membran mit einem M w cut-off von 3,5 kDa verwendet wird .
  8. Führen Sie die Dialyse für drei Tage. Ändern, um die Dialyselösung täglich mit 2 l frisch destilliertem Wasser hergestellt, das 0,2 ml 37% w / w HCl.
  9. Bewahren Sie die endgültige Lösung bei -80 ° C. Lyophilisieren es in einem Lyophilisator nach Herstellerprotokollen.
  10. Charakterisieren des erhaltenen Produkts durch 1 H-NMR - Spektroskopie, Lösen der Probe in D 2 O 16.

5. RGD-funktionalisierten Hydrogel-Synthese

  1. Bereiten Sie die PBS. Man löst 645 mg PBS Salz in 50 ml destilliertem Wasser.
  2. Mischung 40 mg Carbomer und 10 mg funktionalisiertes PAA 4 in 9 ml PBS (Schritt 5.1), bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Auflösung (30 min).
  3. In 400 mg PEG zur Lösung und halten für 45 min gerührt wurde.
  4. Halten Sie das Rühren und lassen Sie das System für 30 Minuten absetzen.
  5. Verwenden 1 N NaOH pH auf 7,4 einzustellen.
  6. Zu 5 ml der erhaltenen Mischung werden 25 mg Agarose-Pulver.
  7. Bestrahlen, das System mit Mikrowellenstrahlung bei 500 W bis zum Kochen, für eine Zeit, in der Regel zwischen 30 sec und 1 min, und elektromagnetisch erhitzen auf 80 ° C.
  8. Lassen Sie die Mischung auf Raumtemperatur ausgesetzt, bis die Temperatur auf 50 ° C ab, und mit 5 ml PBS (Schritt 5.1), um eine Lösung mit einer 1: 1 zu erhalten Volumenverhältnis.
  9. Bereiten Sie 12 Multi-Well-Platte mit Stahlzylinder mit einem Durchmesser von 1,1 cm.
  10. Nehmen Sie 500 ul Aliquots aus der Lösung und legen Sie sie auf jede Stahlzylinder.
  11. Lassen Sie für 45 Minuten bis zur vollständigen Gelieren des Systems in Ruhe.
  12. Entfernen Sie die Zylinder ein Edelstahl-Pinzette, um die Hydrogele erhalten.

6. Laden von Therapeutic Tool (Drug oder Zellen)

  1. Wiederholen Sie steps 5,1-5,7.
  2. Wenn die Mischung (die bereits im Sol-Zustand) 37 ° C erreicht, werden 5 ml der Lösung die gewünschte Arzneimittellösung oder Zellkultur enthält, um ein Endsystem zu einem 1: 1 zu erhalten Volumenverhältnis.
  3. Wiederholen Sie die Schritte 5,9-5,12 polymere Netzwerke mit Bioverbindungen physikalisch innerhalb des Gels eingeschlossen zu erhalten.

7. Hydrogels Charakterisierung

  1. FT-IR-Analyse
    1. Nach der Gelbildung, während 24 Stunden in 2,5 ml destilliertem Wasser eine der synthetisierte Hydrogele einweichen.
    2. Entfernen Sie die wässrigen Medien , wo Hydrogel untergetaucht ist und gefrier trocken mit flüssigem N 2.
    3. Laminat mit der Hydrogel-Probe gemäß KBr Pellet-Technik.
      1. Fügen Sie einen Spachtel voller KBr in einem Achatmörser. Nehmen Sie eine kleine Menge an Hydrogel-Probe (etwa 0,1 bis 2% des KBr Menge oder gerade genug, um die Spitze der Spachtel zu bedecken) und vermischen sich mit dem KBr-Pulver.
      2. Schleifen Sie die Mischung, bis das Pulver fein und homogen.
      3. Verwenden Sie das KBr-Pellet-Kit das IR-Pellet zu bilden. Drücken Sie die Pulver eine manuelle Laborpresse: 3 min bei Druckkapazität in Höhe von 5 Tonnen und dann 3 min bei Druckkapazität von 10 Tonnen.
      4. Lassen Sie den Druck der endgültige Pellet als homogen und transparent im Aussehen zu erhalten. Legen Sie die Pellets in den IR - Probenhalter und führen Sie das Spektrum 16.
  2. Gelieren Studies
    1. Füllen 2 ml Mikrozentrifugenröhrchen mit 900 & mgr; l PBS und auf 37 ° C äquilibrieren.
    2. Füge 100 & mgr; l der hergestellten Polymerlösung, um das Hydrogel bilden, und Inkubieren bei 37 ° C.
    3. Drehen Sie das Röhrchen und beobachten, ob das Gel bei 1 fließt, 2, 5, 10 und 20 min. Aufzeichnen der Zeit, zu der das Gel fließt nicht als die Gelierzeit.

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Ergebnisse

Die PAA Alkin - Derivat effizient aus Polyacrylsäure und Propargylamin synthetisiert, wie in Abbildung 1 gezeigt , wobei n die Monomere , deren Carboxyl - Gruppen reagieren mit dem Amin - Etiketten. Die Identität des Produkts wird durch 1 H-NMR - Spektroskopie bestätigt. Abbildung 5 Die 1 H-NMR - Spektrum von PAA zeigt mit Dreifachbindung modifiziert.

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Diskussion

Die PAA-Postpolymerisationsmodifikation mit Alkinanteilen und die RGD-Funktionalisierung mit der Azidgruppe garantieren die Bildung einer stabilen Bindung zwischen dem Polymer und dem Peptid. In der Tat dient Triazol als starre Verbindungseinheit zwischen den Kohlenstoffatomen, die an die 1,4 Positionen des 1,2,3-Triazol-Rings gebunden ist, und es kann weder hydrolytisch noch auf andere Weise gespalten werden. Darüber hinaus ist Triazol im Gegensatz zu anderen zyklischen Strukturen wie Benzolenoiden und verwandten aromat...

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Offenlegungen

Die Autoren geben keinen Interessenkonflikt an und haben keine Vergütung für die Vorbereitung dieses Manuskripts erhalten.

Danksagungen

Autoren möchte Prof. Maurizio Masi für eine fruchtbare Diskussion und Fräulein Chiara Allegretti für Lektur danken. Autoren Forschung wird von Bando Giovani Ricercatori 2010 (Ministero della Salute GR-2010- 2312573) unterstützt.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
Mittelwert der Poly(acrylsäure)-Lösung Mw ~100.000, 35 Gew.-% in H2O Sigma Aldrich523925CAS 9003-01-4
Poly(ethylenglykol) 2.000Sigma Aldrich84797CAS 25322-68-3
Carbomeer 974PFagron1387083
Agarose Invitrogen Corp.16500-500UltraPure Agarose
RGD Peptidabcamab142698
4-AzidobutansäureAurum PharmatechZ-2421  CAS 54447-68-6
OxalylchloridSigma AldrichO8801CAS 79-37-8
Propargylaminhydrochlorid 95%SigmaAldrichP50919CAS 15430-52-1
Kupfer(I)-iodidSigma Aldrich3140CAS 7681-65-4
NatriumascorbatSigma AldrichY0000039CAS 134-03-2
Phosphatgepufferte KochsalzlösungSigma AldrichP4417
DialysemembranSpectrum Laboratories, Inc.132725Spectra/Por 3 Dialysemembran  Standard RC Tubing
MWCO: 3,5 kD

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