Summary
تفيد الدراسات التشكل الخلايا العصبية باستخدام ذبابة الفاكهة تشجر شجيري اليرقات (دا) الخلايا العصبية من في التصور الموقع من البروتينات العصبية والبشرة المناعي. نحن تصف الإجراء الذي يحسن التحليل المناعي دا الخلايا العصبية والخلايا المحيطة البشرة عن طريق إزالة الأنسجة العضلية من جدار الجسم اليرقات.
Abstract
ذبابة الفاكهة اليرقات تشجر شجيري (دا) الخلايا العصبية هي نموذج شعبية للتحقيق في آليات التشكل الخلايا العصبية. دا الخلايا العصبية تتطور في اتصال مع خلايا البشرة التي يعصب وبالتالي فوائد تحليلهم من التصور في مواقعها الطبيعية في كل من البروتينات وأعرب neuronally وepidermally المناعي. الطرق التقليدية في تحضير شرائح اليرقات لتجارب المناعي على حالها الأنسجة العضلية التي تغطي أكثر من جدار الجسم، وتقديم العديد من التحديات لتصوير الخلايا العصبية والبشرة البروتينات. نحن هنا تصف طريقة لإزالة الأنسجة العضلية من ذبابة الفاكهة شرائح اليرقات. يتيح هذا البروتوكول التصوير من البروتينات التي يتم حجب خلاف ذلك أنسجة العضلات، ويحسن إشارة إلى نسبة الضوضاء، ويسهل استخدام فائقة الدقة المجهر لدراسة دا تنمية الخلايا العصبية.
Introduction
توفر ذبابة الفاكهة اليرقات تشجر شجيري (دا) الخلايا العصبية نموذجا قيما لدراسة تطوير الخلايا العصبية بسبب قابليته لالتلاعب الجيني والسهولة التي يمكن تصويرها. وكانت هذه الخلايا العصبية الحسية دور فعال في تحديد العديد من مسارات التي تتحكم في التغصنات التشكل 1-3.
أربع فئات من دا الخلايا العصبية (الصف الأول - الرابع) يعصب البشرة اليرقات. هذه الخلايا العصبية تقع بين الغشاء القاعدي والبشرة، مع التشعبات الذين يشكلون صفائف إلى حد كبير ثنائية الأبعاد 4،5. من الفئات الأربع، والطبقة الرابعة دا الخلايا العصبية لديها العرش الأكثر تشعبت للغاية، ومثل الخلايا العصبية الحسية من الحيوانات الأخرى، ووضع هذه العرش يتطلب العوامل الجوهرية وكذلك العظة من الأنسجة المجاورة، وخاصة البشرة، لتنميتها 6-9 .
دراسات لتحديد كيف يمكن لهذه الخلايا العصبية والواقع خارج الخلايا العصبيةالأملاح السيطرة صالح التشكل تغصناته من القدرة على الكشف عن بروتين تعبير في الموقع المناعي. بشرة الخارجية لليرقة هو منيع لالأجسام المضادة، ولكن التغلب على هذا العائق بسهولة عن طريق إعداد شرائح اليرقات من خلال وسائل تشريح راسخة 10،11. ومع ذلك، فإن الأنسجة العضلية جدار الجسم التي تقع على بعد الداخلية إلى الغشاء القاعدي تقدم العديد من التحديات نحو التصور من الخلايا العصبية دا وخلايا البشرة. أولا، الأنسجة العضلية، والتي خطوط معظم من جدار الجسم، يحجب كثيرا إشارات الفلورية المنبعثة من الأنسجة العصبية أو البشرة. هذا يقلل بشكل كبير من إشارة إلى نسبة الضوضاء في العينة. ثانيا، يمكن التعبير عن العديد من البروتينات ذات الصلة في الأنسجة العضلية وكذلك في الخلايا العصبية أو البشرة. ومن المرجح أن مزيدا من الكشف غامضة إشارة مضان من الخلايا العصبية أو البشرة هذه الإشارة مضان مأخوذة من العضلات. وأخيرا، فإن التقدم في تقنيات المجهر لاث التصوير تصريح العينات في قرار دون حيود وقد تكون مفيدة خاصة في تمييز توطين البروتينات التي يتم التعبير عنها في الخلايا العصبية والخلايا المحيطة البشرة 12،13. ومع ذلك، والتصوير عبر فوائد المجهر فائقة الدقة من إشارة قوية إلى نسبة الضوضاء وبالقرب من العينة إلى ساترة. بالإضافة إلى الحد من نسبة الإشارة إلى الضوضاء، واليرقات جدار الجسم مسافات العضلات دا الخلايا العصبية من ساترة، مما يحد من دقة وضوح الصورة المحسنة التي يمكن تحقيقها مع أساليب الفحص المجهري فائقة الدقة. وبالاضافة الى التحديات التي تواجه التحليل المناعي، تقدم الأنسجة العضلية عائقا أمام تسجيل الكهربية من الخلايا العصبية الحسية في جدار الجسم اليرقات. وبالتالي زواله يفيد التلاعب العصبي الخلايا العصبية الحسية 14.
هنا يتم وصف طريقة لإزالة يدوية من ذبابة الفاكهة الأنسجة العضلية اليرقات. علينا أن نبرهن أن لدينا بروتوكول صermits التصوير المناعي من البروتينات التي يتم حجب خلاف ذلك أنسجة العضلات، ويحسن إشارة إلى نسبة الضوضاء لرؤية الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية، ويمكن استخدام فائقة قرار المجهري للتمييز أفضل العلاقات المكانية للبروتينات والهياكل الخلوية في دا الخلايا العصبية و البشرة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: الإجراء لإزالة العضلات (الشكل 1) هو تعديل من الأساليب المذكورة سابقا لإعداد شرائح اليرقات. وترد الخطوات التي تسبق واتبع إزالة العضلات لفترة وجيزة ويشار إلى القارئ إلى الأعمال السابقة 10 و 11 لوصف أكثر تفصيلا.
1. تشريح اليرقة في المياه المالحة الباردة
- إعداد تخفيف العمل الباردة HL3.1 المالحة 15 أو الكالسيوم البارد 2+ خالية HL3.1 المالحة 11 (الجدول 1). مكان اليرقة في طبق المطاط الصناعي السيليكون مع ما يكفي المالحة الباردة لتغطية الجزء السفلي من الطبق.
ملاحظة: انظر مناقشة فيما يتعلق باختيار من المياه المالحة.
| 1X المالحة HL3.1 (درجة الحموضة 7.2) |
| 5 ملي HEPES |
| 70 ملي كلوريد الصوديوم |
| 1.5 ملي CaCl 2 (حذف ل Ca 2+ المالحة خالية) |
| 4 ملي MgCl 2 |
| 10 ملم NaHCO 3 |
| 5 ملي طرهالوز |
| 115 ملي السكروز |
| تعقيم تصفية وتخزينها في 4 درجات مئوية |
| يقلد تكوين الحشرة الدملمف: مذكرة |
الجدول 1. تكوين الباردة المالحة.
- وضع اليرقة مع الجانب حتى بطني. السطح البطني لليرقة يمكن تحديدها عن طريق الأحزمة dentical البطن والجانب الظهري من أنابيب القصبة الهوائية اليرقات الأولية يمتد من الأمامي إلى الخلفي. تمتد اليرقة في الاتجاه الأمامي الخلفي ويعلقون الرأس والذيل لسيليكون المطاط الصناعي طبق تشريح باستخدام دبابيس الحشرات. استخدام مقص تشريح غرامة لقطع على طول خط الوسط بطني، ابتداء من نهاية واحدة وتتقدم في اتجاه آخر.
ملاحظة: هذا التوجه يحفظ الكتلة الظهرية درس عادة من دا الخلايا العصبية. - بعد قطع اليرقة مفتوحة، دبوس الأركان الأربعة للطبق تشريح كما لو فتح الكتاب. استخدام ملقط لانتزاع وإزالة الأعضاء الداخلية بما فيها الجهاز العصبي المركزي، القناة الهضمية، والقصبة الهوائية. ضبط دبابيس الحشرات بحيث فيليه هو مشدود ولكن لا تمتد الى اقصى حد ممكن.
وترسو العضلات لجدار الجسم في حدود القطاعية: ملاحظة. على الرغم من أن عضلات تغطي معظم جدار الجسم، فهي غائبة في منطقة ضيقة بالقرب من خط الوسط الظهرية.
إزالة 2. العضلات
- تحديد خط الوسط الظهري لليرقة، حيث الأنسجة العضلية هي غائبة. وضع ملقط الشق واحد بحيث يمكن إدراجها تحت الأنسجة العضلية في تسطحا التوجه ممكن.
- يبدأ منخط الوسط الظهرية، بالقرب من الحدود الأمامي من الجزء، الشريحة بعناية الشق ملقط بين العضلات والبشرة، مع الحرص على تقليل الاتصال بين ملقط والبشرة.
- سحب ملقط صعودا لكسر الحجز على العضلات لجدار الجسم في مرساة نقطة واحدة. كرر هذه العملية لباقي نصفي جزء (ق) من الفائدة.
ملاحظة: هذا البروتوكول يحسن الحفاظ على الخلفي من كل حقل التغصنات دا الخلايا العصبية. للحفاظ على الجزء الأمامي من الملعب في التغصنات، فمن الأفضل لإدراج الشق ملقط في نهاية الخلفي من كل قطعة. - إعادة ضبط دبابيس الحشرات مثل أن شرائح اليرقات ويمتد الحد الأقصى في جميع الاتجاهات.
- إصلاح فيليه في حين انها لا تزال معلقة على طبق تشريح باستخدام الباردة، طازجة الفورمالديهايد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 25 دقيقة.
- شطف 5 مرات في برنامج تلفزيوني.
- استخدام الملقط لسحب بعناية بعيدا الأنسجة العضلية من نقاط الربط المتبقية، مع الحرص على تقليل حساب المشتركط م مع البشرة.
- بفصل وإزالة شرائح من الطبق تشريح لأنبوب microcentrifuge 1.5 مل. أداء جميع الغسيل، حظر، والخطوات المناعي تلطيخ لاحقة، كما هو موضح سابقا (11).
3. جبل اليرقات فيليه
- أولا إزالة الرأس والذيل باستخدام مقص تشريح غرامة من أجل جعل عينة شقة ممكن. تركيب شرائح على ساترة في antifade مرس مع السطح الداخلي للشرائح التي تواجه ساترة.
- ضع شريحة المجهر على ساترة واضغط برفق لتفريق المتوسطة المتزايدة. الوجه شريحة المجهر مرارا وختم ساترة على الشريحة باستخدام طلاء الأظافر. ويمكن تخزين الشرائح في -20 درجة مئوية لمدة شهر واحد على الأقل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ونحن لشرح فائدة هذا الإجراء إزالة العضلات لتحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء في التجارب المناعي للمشاركة في تصور البروتينات محوجزة تقاطع Coracle (كورا) وقرص واسع (أجهزة ...) جنبا إلى جنب مع الصنف الرابع دا الخلايا العصبية المسماة مع علامة غشاء CD4- tdTomato.
وقد استخدم كورا سابقا لتحديد مساحات حيث أرفقت دا التشعبات العصبية من قبل خلايا البشرة ويعد واحدا من العديد من العوامل البشرة التي تم تحديدها التي تم دراستها بالتعاون مع التشكل وظيفة الخلايا العصبية دا التشعبات 4،6-9،16. المناعية مع المضادة للعن dsRed للكشف عن أجريت الخلايا العصبية (الحمراء)، ومكافحة كورا الأجسام المضادة (الخضراء) على شرائح اليرقات مع العضلات إزالة (العضلات إيقاف) ومع العضلات سليمة (العضلات جرا). لكل حالة، تم تصوير هذا المجال التغصنات الخلفي من الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية باستخدام مجهر المسح بالليزر متحد البؤر. وقد تم الحصول على الصور باستخدام معرفالمعلمات التصوير entical لكل الظروف. نحن تصوير بالإضافة إلى العضلات على شرائح باستخدام زيادة قوة الليزر للتعويض عن تدخل من الأنسجة العضلية.
في عينات العضلات قبالة، كورا يمكن أن يتم الكشف بشكل واضح في حدود الخلية البشرة، في مساحات متقطعة على طول التشعبات الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية، وتحديد سوما الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية (الشكل 2C). في المقابل، تم حجب الترجمة لهذه المجالات إلى حد كبير في العضلات على عينات، حتى عندما تم زيادة قوة الليزر (الشكل 2A-2B). في العضلات على عينات، وتصور كورا في المقام الأول في العضلات، والقصبة الهوائية، وفي الوصل العصبي العضلي (NMJ)، الذي انفصلوا من جدار الجسم نتيجة للإجراءات الإزالة العضلات. إشارة مضان المنبثقة من هذه الأنسجة تحجب معظم كورا أن يموضع إلى البشرة حدود الخلية والتغصنات مساحات، باستثناء في شريط ضيق من الجسم وولل بالقرب من خط الوسط الظهرية، حيث العضلات غائبة. كورا التي تحدد الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية سوما لم تصور في العضلات على عينات (الشكل 2A-2B). التصور من البروتينات وأعرب epidermally التي لديها أيضا التعبير العضلات عالية، مثل أجهزة ...، هو مشكلة خاصة. في عينات العضلات على، وتوزيع أجهزة ... في البشرة كانت تحجب تماما تقريبا مضان من العضلات وNMJ (الشكل 2D). بعد إزالة العضلات، تم الكشف عن أجهزة ... بسهولة في حدود الخلية البشرة، في مساحات متقطعة على طول التشعبات دا الخلايا العصبية، وتحديد سوما الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية (الشكل 2E). وهكذا، وإزالة العضلات تمكن التصور من البروتينات وأعرب epidermally وneuronally تحجب خلاف ذلك العضلات والأنسجة المرتبطة بها.
وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ أن كثافة مضان من الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية علامة بدا تخفيض في العضلات على شرائحبالمقارنة مع شرائح العضلات قبالة عندما عقدت المعلمات التصوير المستمر بين عينة اثنين الاستعدادات (الشكل 2A، 2C). مع زيادة قوة الليزر، يمكن أن تكون مطابقة لشدة مضان واضحة من الطبقة الرابعة دا الخلايا العصبية علامة لعينات العضلات حالا ولكنه ضجيج الخلفية زادت (الشكل 2B، 2C). لذلك، إزالة العضلات يحسن إشارة إلى نسبة الضوضاء في عينات لدينا.
وأخيرا، نحن اختبار ما إذا كانت التحسينات التي اكتسبتها إزالة الأنسجة العضلية يمكن أن تطبق على التصوير من الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية في قرار الفرعية الحيود. للقيام بذلك، 3D منظم المجهري الإضاءة تم تنفيذ (SIM) والتصوير، والذي يحقق ما يقرب من 120 قرار الجانبي نانومتر 13. كما هو الحال مع التصوير متحد البؤر، قارنا شرائح العضلات على والعضلات من immunostained لكورا والدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية، لأول مرة في ظل ظروف التصوير متطابقة ثم بعد تحسين قوة الليزر، المعارضالوقت لدى عودتهم، ومعالجة الصور لعينات العضلات جرا. وعلى غرار الفحص المجهري متحد البؤر، لوحظ وجود انخفاض كبير إشارة إلى نسبة الضوضاء في العضلات على بالمقارنة مع شرائح العضلات قبالة (الشكل 3A-3C). بالإضافة إلى ذلك، يبدو أن إعادة بناء صورة أكثر وضوحا في عينات العضلات حالا. مقارنة العضلات على عينات، لوحظت أقل التحف واضحة وكانت كورا مساحات تغصناته حلها بسهولة أكبر (الشكل 3B، 3C). يمكن قياس الأغشية التغصنات في حوالي 114 نانومتر في العرض في شرائح العضلات قبالة لكن على ما يبدو 272 نانومتر واسعة في العضلات على شرائح (الشكل 3D، 3E). وبالتالي، لدينا بروتوكول يتيح تطبيق فائقة الدقة المجهر إلى التصور من الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية.
الشكل 1. نظرة عامة على إجراء إزالة العضلات. يتم تشريح يرقة ويعلق على السيليكونالمطاط الصناعي طبق تشريح. لإزالة الأنسجة العضلية، ويتم إدخال واحد الشق الملقط بين طبقة العضلات والبشرة الخلايا، بدءا من خط الوسط الظهرية قرب الحدود شريحة (2.2). يتم سحبها ملقط صعودا لكسر مرفق بين الجدار العضلي والجسم (2.3). ويتكرر هذا بالنسبة لشرائح من الفائدة ومن ثم يتم إصلاح يرقة في الفورمالديهايد (2.5). بعد التثبيت، يتم استخدام ملقط لفصل الأنسجة العضلية المتبقية من جدار الجسم (2،7-2،8) إهاب اليرقات وصورت البشرة باللون البرتقالي، والطبقة الرابعة دا الخلايا العصبية باللون الأخضر، والعضلات باللون الأحمر. إدراجات في (2.2) و (2.7) تمثل رأي مستعرضة من اليرقات نصفي قطعة واحدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم إزالة 2. العضلاتيحسن متحد البؤر التصوير دا الخلايا العصبية والبشرة المناعي من كورا. (أخضر، AC) أو أجهزة ... (الأخضر، DE) تم الكشف مع الأنسجة العضلية (A، B، D) ودون الأنسجة العضلية (C، E). وصفت الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية باستخدام GAL4 "سائق 477 للتعبير عن UAS-CD4: tdTomato والكشف مع الأجسام المضادة لمكافحة عن dsRed (الحمراء). عينات العضلات على العضلات والنعاس، وصفت لكورا تم تصويرها أولا مع المجهر متحد البؤر في ظل ظروف مماثلة (A، C) وبعد ذلك مع زيادة قوة الليزر للتعويض عن التدخل في العضلات (B). تم تصوير عينات العضلات على العضلات والنعاس، وصفت لأجهزة ... في ظل ظروف الأمثل بشكل فردي. جميع الصور هي متحد البؤر-توقعات Z. وسط (الأخضر) وأسفل (الحمراء) لوحات تظهر القنوات الفردية؛ لوحات أعلى هي القنوات دمجها. الحدود من الأنسجة العضلية (الخطوط المتقطعة)، الطبقة الرابعةدا الخلايا العصبية سوما (الأسهم السماوي)، كورا وأجهزة ... التغصنات مساحات (السهام البيضاء)، حدود الخلية البشرة (السهام قرمزي)، NMJ (الأسهم الصفراء)، والقصبة الهوائية (الأسهم البرتقالية) والمشار إليها. شريط النطاق = 20 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. إزالة العضلات تمكن سوبر قرار من تصوير دا الخلايا العصبية وخلايا البشرة. كشف المناعي من كورا (الأخضر) في الصف الرابع دا الخلايا العصبية مع العضلات سليمة (A، B) وبعد إزالة العضلات (C). وصفت الدرجة الرابعة دا الخلايا العصبية كما في الشكل 2 تم تصوير عينات العضلات على والعضلات قبالة مع إضاءة المجهر منظم لأول مرة في ظل ظروف مماثلة (A، C)؛ عينة العضلات علىفي الفقرة (أ) ثم أعيد تصويرها مع زيادة قوة الليزر والتعرض مرات للتعويض عن التدخل في العضلات (B). جميع الصور هي من التوقعات Z. وسط (الأخضر) وأسفل (الحمراء) لوحات من AC تظهر القنوات الفردية. لوحة أعلى من التيار المتردد هو الدمج. يشار إلى حدود الخلية البشرة (السهام قرمزي)، كورا مساحات التغصنات (السهام البيضاء)، وقطعة أثرية صورة إعادة الإعمار (رأس السهم الأصفر). إدراجات في لوحات السفلية من B و C تتوافق مع D و E، على التوالي. يظهر عرض واضح للغشاء التغصنات في العضلات على (D) و (E) عينات العضلات خارج. على نطاق والحانات = 3 ميكرون (AC) و 0.5 ميكرومتر (D، E). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يوصف بروتوكول للالإزالة اليدوية من الأنسجة العضلية من ذبابة الفاكهة شرائح اليرقات. هذا البروتوكول يعدل الموصوفة سابقا تقنيات تشريح اليرقات 10،11. بعد تشريح اليرقة في طبق المطاط الصناعي السيليكون، يقع خط الوسط الظهرية. وملقط الشق واحد، في تسطحا توجهها الممكن، يتم إدراج بعناية بين أنسجة العضلات والبشرة، بالقرب من خط الوسط الظهرية. يتم سحب ملقط بلطف صعودا إلى الأنسجة العضلية منفصلة عن مرساة نقطة واحدة في كل جزء اليرقات من الفائدة. ثم يتم إصلاح فيليه اليرقات في الفورمالديهايد البارد وبعد ذلك يتم استخدام ملقط مرة أخرى لسحب بعيدا العضلات من نقاط الربط المتبقية.
في حين أنه من المغري لأداء مجمل إزالة العضلات الإجراء بعد التثبيت، نجد أن العضلات امتدت، مرة واحدة ثابتة، لا يزال بالارض والرئيسي يعارضها ارتباطا وثيقا البشرة حتى بعد انفصال من نقطة الربط، وجعلهامن الصعب التلاعب دون الإضرار الأنسجة الكامنة. الأنسجة العضلية بالإضافة إلى ذلك، في تجربتنا، الثابتة هي هشة والدموع بسهولة، ومنع زواله كاملة من جدار الجسم. في المقابل، عندما يتم فصل العضلات من نقطة الربط واحد قبل التثبيت، فإنه سيتم التعاقد نحو نقطة الربط المتبقية خلال التثبيت، وترك بذرة الأنسجة التي يمكن أن أمسك أكثر سهولة بواسطة ملقط وانسحبت من جدار الجسم اليرقات.
من أجل الحفاظ على أفضل العينات، يجب الحرص كبيرة لتقليل الاتصال بين ملقط والبشرة أثناء إجراء إزالة العضلات. ونتيجة لذلك، لدينا بروتوكول قد تضيف عدة دقائق لتقنيات تشريح هو موضح سابقا 10،11. لتجنب تدهور الأنسجة، وعدد من اليرقات التي يتم تشريح قبل التثبيت ينبغي أن يقتصر مثل هذا الوقت المنقضي وجود أكثر من 25 دقيقة. بالإضافة إلى ذلك، فإننا ننصح باختبار أزواج متعددة من الملقط - الملقط من نفس موديل قد تختلف اختلافا كبيرا في الشكل والحدة - وضبط مدى امتدت شرائح قبل إزالة العضلات من أجل تحسين حفظ الأنسجة وسرعة تشريح.
وأخيرا، فإننا نوصي تجريب استخدام الكالسيوم 2+ خالية من الملوحة HL3.1 مقابل المالحة HL3.1 القياسية خلال تشريح اليرقات. في حالة عدم وجود الكالسيوم، وتقلص إلى حد كبير تقلصات العضلات اليرقات. وبالتالي، قد يكون فيليه اليرقات أسهل للتلاعب عند تشريح في كا 2+ خالية HL3.1 المالحة. ومع ذلك، نجد أن تقلص العضلات يخلق مسافة بين العضلات والبشرة وهذا يمكن أن يسهل إدخال ملقط بين هذه الأنسجة وتقليل مخاطر الأضرار التي لحقت البشرة. ونتيجة لذلك، قد يكون HL3.1 القياسي الأفضل للحفاظ على سلامة البشرة ودا الخلايا العصبية. نحصل على نتائج جيدة مع ترك إما المالحة والخيار للمستخدم.
في حين يزيد بروتوكول لدينامدة وتعقيد تقنيات تشريح هو موضح سابقا 10،11، ويوفر العديد من التحسينات التي هي مفيدة لتصوير الخلايا العصبية الحسية اليرقات وخلايا البشرة. أولا، أنه يسمح التصوير من البروتينات وأعرب neuronally وepidermally أن يتم حجب خلاف ذلك الأنسجة العضلية. الثانية، ويحسن الإشارة مضان إلى نسبة الضوضاء. وأخيرا، فإنه يمكن استخدام فائقة قرار المجهري للتمييز متفوقة من العلاقات المكانية البروتين في الخلايا العصبية دا والبشرة. وتحسين جودة التصوير التي نلاحظها بعد إزالة العضلات هو على الأرجح نتيجة لانخفاض امتصاص الفوتون ونثر وكذلك تقليل المسافة بين العينة وساترة. على الرغم من أن لم تظهر هنا، وإزالة العضلات المرجح أيضا يحسن وصول الأجسام المضادة إلى البشرة ودا الخلايا العصبية، وتحسين نوعية المناعي. قد تكون زيادة إمكانية الوصول الأجسام المضادة مفيدة بشكل خاص للبروتوكولات المناعي تؤدى في أبسينم من الأنسجة permeabilizing عامل 4.
من المرجح أن تستفيد الدراسات من العصبية والبشرة من العوامل التي تنظم التشكل التغصنات في الخلايا العصبية الحسية التحسينات التي اكتسبتها استخدام هذا البروتوكول. وعلاوة على ذلك، وإزالة العضلات سهلت سابقا دراسة الكهربية للخلايا العصبية الحسية في جدار الجسم اليرقات وقد يكون نسخة معدلة من هذا البروتوكول مفيدة للدراسات المستقبلية التي تستخدم التلاعب العصبي الخلايا العصبية الحسية اليرقات. وأخيرا، قد يكون نسخة معدلة من هذا البروتوكول مفيدة نحو التطبيقات الأخرى مثل عزل الخلايا العصبية دا واحدة لتحديد ملامح التعبير الجيني.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
نشكر غاري Laevsky لإجراء مناقشات مفيدة حول المجهري. بتمويل من المعاهد الوطنية للصحة هذا العمل يمنح R01GM061107 وR01GM067758 إلى أرج
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
- Jan, Y. N., Jan, L. Y. Branching out: mechanisms of dendritic arborization. Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).
- Corty, M. M., Matthews, B. J., Grueber, W. B. Molecules and mechanisms of dendrite development in Drosophila. Development. 136 (7), 1049-1061 (2009).
- Parrish, J. Z., Emoto, K., Kim, M. D., Jan, Y. N. Mechanisms that regulate establishment, maintenance, and remodeling of dendritic fields. Annu Rev Neurosci. 30, 399-423 (2007).
- Kim, M. E., Shrestha, B. R., Blazeski, R., Mason, C. A., Grueber, W. B. Integrins establish dendrite-substrate relationships that promote dendritic self-avoidance and patterning in Drosophila sensory neurons. Neuron. 73 (1), 79-91 (2012).
- Han, C., et al. Integrins regulate repulsion-mediated dendritic patterning of Drosophila sensory neurons by restricting dendrites in a 2D space. Neuron. 73 (1), 64-78 (2012).
- Parrish, J. Z., Xu, P., Kim, C. C., Jan, L. Y., Jan, Y. N. The microRNA bantam functions in epithelial cells to regulate scaling growth of dendrite arbors in Drosophila sensory neurons. Neuron. 63 (6), 788-802 (2009).
- Jiang, N., Soba, P., Parker, E., Kim, C. C., Parrish, J. Z. The microRNA bantam regulates a developmental transition in epithelial cells that restricts sensory dendrite growth. Development. 141 (13), 2657-2668 (2014).
- Meltzer, S., et al. Epidermis-derived Semaphorin promotes dendrite self-avoidance by regulating dendrite-substrate adhesion in Drosophila sensory neurons. Neuron. 89 (4), 741-755 (2016).
- Han, C., et al. Epidermal cells are the primary phagocytes in the fragmentation and clearance of degenerating dendrites in Drosophila. Neuron. 81 (3), 544-560 (2014).
- Brent, J. R., Werner, K. M., McCabe, B. D.
- Karim, M. R., Moore, A. W. Morphological analysis of Drosophila larval peripheral sensory neuron dendrites and axons using genetic mosaics. J Vis Exp. (57), e3111 (2011).
- Gustafsson, J. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J Microscopy. 198 (2), 82-87 (2000).
- Ashdown, G. W., Cope, A., Wiseman, P. W., Owen, D. M. Molecular flow quantified beyond the diffraction limit by spatiotemporal image correlation of structured illumination microscopy data. Biophys J. 107 (9), L21-L23 (2014).
- Zhang, W., Yan, Z., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Sound response mediated by the TRP channels NOMPC, NANCHUNG, and INACTIVE in chordotonal organs of Drosophila larvae. PNAS. 10 (33), 13612-13617 (2013).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. J Neurogenet. 18 (2), 377-402 (2004).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
