Summary
ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンを用いて、神経細胞の形態形成の研究は、免疫蛍光によって、神経や表皮タンパク質のその場可視化で恩恵を受ける。私たちは、幼虫の体壁から筋肉組織を除去することにより、ダニューロンと周囲の表皮細胞の免疫蛍光分析を向上させる手順を説明します。
Abstract
ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンは、神経形態形成のメカニズムを調べるための人気モデルです。 DAニューロンは、彼らが免疫蛍光によってタンパク質を発現し、両方のneuronallyと表皮のその場可視化から支配するので、それらの分析の利点表皮細胞と通信して開発しています。免疫蛍光実験のための幼虫フィレットを製造する従来の方法は、ニューロンおよび表皮タンパク質を画像化するためにいくつかの課題を提示し、体壁の大部分をカバーする筋肉組織をそのまま残します。ここでは、 ショウジョウバエの幼虫の切り身から筋肉組織を除去する方法について説明します。このプロトコルは、他の方法で筋肉組織によって覆い隠されているタンパク質の画像化を可能にする信号対雑音比を改善し、DAニューロンの発達を研究するための超解像顕微鏡の使用を容易にします。
Introduction
ショウジョウバエの幼虫の樹状樹枝状（DA）ニューロンは、それらの遺伝子操作に従順し、それらが画像化することができる容易さに神経発達を研究するための貴重なモデルを提供します。これらの感覚ニューロンは、樹状突起の形態形成1-3を制御する多数の経路の同定に尽力してきました。
ダニューロンの4つのクラス（クラスI - IV）幼虫の表皮を支配します。これらのニューロンは、それらの樹状突起が大きく二次元アレイ4,5を形成することで、基底膜と表皮の間にあります。 4つのクラスのうち、クラスIV DAニューロンは、最も高度に分岐したアーバを持っていると、他の動物の感覚ニューロンのように、これらのアーバーの精緻化は、本質的な要因だけでなく、その開発6-9ため、隣接組織からの合図、特に表皮を、必要とします。
どのような神経細胞や余分な神経事実を決定するための研究ORS免疫蛍光法により、in situでタンパク質の発現を検出する能力の樹状突起の形態形成効果を制御します。幼虫の外側のキューティクルは、抗体に不可解ですが、この障害は、簡単に十分に確立された解剖法10,11を介して幼虫のフィレットの作成によって克服されます。しかし、基底膜のすぐ内側にある体壁筋肉組織は、DA神経細胞と表皮細胞の可視化に向けていくつかの課題を提示します。体壁のほとんどは、非常に神経または上皮組織から発せられる蛍光シグナルを不明瞭線まず、筋肉組織、。これは、実質的に、試料中の信号対雑音比を低下させます。第二に、多くの関連タンパク質は、筋肉組織ならびに神経細胞または表皮で発現させてもよいです。この筋肉由来の蛍光シグナルは、ニューロンまたは表皮からの蛍光シグナルのさらなる曖昧検出する可能性があります。最後に、無顕微鏡技術の進歩サブ回折分解能で試料のワット許可イメージングと神経細胞と周囲の上皮細胞12,13に発現されるタンパク質の局在を見分ける際に特に有用であろう。しかし、雑音比とカバースリップに、試料の近接に強い信号から超解像顕微鏡の利点を介してイメージング。信号対雑音比を減少させることに加えて、幼虫の体壁筋の距離それによって超解像顕微鏡法を用いて達成することができる改善された画像の解像度を制限するカバースリップからのDAニューロン。免疫蛍光分析のための課題に加えて、筋肉組織は、幼虫の体壁内の感覚ニューロンからの電気生理学的記録に対する障壁を提示します。その除去は、したがって、感覚ニューロン14の神経生理学的な操作に利益をもたらします。
ここでショウジョウバエ幼虫の筋肉組織を手動で除去するための方法が記載されています。私たちは、プロトコルPことを実証していますさもなければ筋肉組織によって覆い隠されているタンパク質のermits免疫蛍光イメージングは、クラスIV DAニューロンの可視化のための信号対雑音比を向上させ、より良いDAニューロンにおけるタンパク質及び細胞構造の空間的関係を判別する超解像顕微鏡法の使用を可能と表皮。
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Protocol
注：筋肉を除去するための手順（ 図1）は、幼虫のフィレットを調製するための前述の方法の変形例です。先行すると筋肉の除去を以下の手順を簡単に概説されており、読者はより詳細な説明については、前の作業10、11と呼ばれています。
冷生理食塩水で1解剖幼虫
- 冷たいHL3.1生理食塩水15または低温のCa 2+を含まないHL3.1生理食塩水11（ 表1）の作業希釈を準備します。皿の底をカバーするだけの十分な冷生理食塩水とシリコーンエラストマー皿に幼虫を置きます。
注：生理食塩水の選択についての議論を参照してください。
| 1×HL3.1生理食塩水（pH7.2）で |
| 5 mMのHEPES |
| 70 mMのNaClを |
| 1.5 mMのCaCl 2を（のCa 2+を含まない生理食塩水のために省略します） |
| 4のMgCl 2 |
| 10mMのNaHCO 3を |
| 5 mMのトレハロース |
| 115 mMのスクロース |
| 4℃でのフィルター滅菌し、店舗 |
| 注：組成を模倣昆虫血リンパ |
冷生理食塩水の表1の組成物。
- 腹側を上にして幼虫を置きます。幼虫の腹面は、前方から後方に実行されている主要な幼虫の気管チューブによって腹部denticalベルトと背側によって同定することができます。前後方向に幼虫を伸ばし、頭と尾をピン虫ピンを使用して皿を解剖シリコーンエラストマー。一方の端で始まり、他方に向かって進行し、腹側正中線に沿って切断するために微細な解剖ハサミを使用してください。
注：この向きはDAニューロンの一般的に研究背クラスタを保持します。 - 幼虫が切り開かれた後、本を開いたかのように解剖皿に四隅を固定します。 CNS、腸、気管などの内臓を取得し、削除するために鉗子を使用してください。フィレットがピンと張ったが、最大限に延伸されないように虫ピンを調整します。
注：筋肉セグメント境界で体壁に固定されています。筋肉は、体壁の大部分をカバーするが、これらは、背側正中線近くの狭い領域に存在しません。
2.筋肉の取り外し
- 筋肉組織が存在しない幼虫の背側正中線の位置を確認します。それは平坦可能向きで筋肉組織の下に挿入することができるように、単一の鉗子の突起を配置します。
- 始まります背側正中線は、セグメントの前方境界付近に、慎重に鉗子と表皮の間の接触を最小限に抑えるように注意しながら、筋肉と表皮の間に鉗子突起をスライドさせます。
- 1アンカーポイントで体壁に筋肉の付着を破壊するために上向きに鉗子を引き出します。関心の残りの半セグメント（複数可）のためにこのプロセスを繰り返します。
注：このプロトコルは、各ダニューロン樹状突起フィールドの後方の保存を最適化します。デンドライトフィールドの前部を維持するためには、各セグメントの後端に鉗子の突起を挿入するのが最善です。 - 幼虫フィレットを最大限にすべての方向に延伸されるように、虫ピンを再調整。
- それはまだ25分間、PBS中の寒い、新たに調製した4％ホルムアルデヒドを使用して、解剖皿に固定されている間にフィレットを修正しました。
- PBSで5回洗浄します。
- コンタを最小限に抑えるように注意しながら、慎重に残りのアンカーポイントから筋肉組織を離れて引っ張るために鉗子を使用して、表皮とCT。
- 固定を解除し、1.5 mlのマイクロ遠心チューブに解剖皿からフィレットを削除します。以前に11を説明したように、すべてのその後の洗浄、ブロッキング、および免疫蛍光染色の手順を実行します。
3.マウント幼虫フィレ
- まずできるだけサンプルは限り平坦にするために微細な解剖ハサミを使用して、頭と尾を削除します。カバーガラスに面したフィレットの内面と退色防止封入でカバースリップ上のフィレットをマウントします。
- カバースリップ上の顕微鏡スライドを配置し、封入剤を分散させるために軽く押してください。以上の顕微鏡スライドを裏返して、マニキュアを使用して、スライド上にカバーガラスをシール。スライドは、少なくとも1ヶ月間-20℃で保存することができます。
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Representative Results
私たちは一緒に膜マーカーで標識されたクラスIV DAニューロンと中隔結合タンパク質網代舟（コーラ）とディスク大（DLG）の同時可視化するために、免疫蛍光実験で信号対雑音比を改善するための筋肉の取り外し手順の有用性を実証しているCD4 - tdTomato。
コーラは、以前に、DAニューロンの樹状突起は、表皮細胞によって囲まれており、DAニューロンの形態形成および機能に関連して研究されてきた多くの識別された表皮の要因の一つは4,6-9,16の樹状突起れるトラクトを特定するために使用されています。ニューロン（赤）を検出するために、抗DsRedを用いた免疫染色および抗コーラ抗体（緑）は、筋肉削除（筋肉オフ）で、筋肉無傷の（筋肉オン）と幼虫の切り身で実施しました。各条件については、クラスIV DAニューロンの樹状突起の後方視野を、レーザー走査共焦点顕微鏡を用いて画像化しました。画像は、IDを使用して得られました両方の条件のためのentical撮像パラメータ。我々はさらに、筋肉の筋組織からの干渉を補償するために増加したレーザー出力を使用してフィレットをイメージ。
筋肉オフのサンプルでは、コーラは明らかにクラスIV DAニューロンの樹状突起に沿って断続的な管で、表皮細胞の境界で検出され、クラスIV DAニューロンの細胞体（ 図2C）を概説することができました。対照的に、これらのドメインへの局在化は、大部分は（ 図2A-2B）のレーザーパワーが増大した場合であっても、筋肉の試料において隠されました。筋肉上のサンプルでは、コーラは主に筋肉で可視化した、気管、および筋肉の取り外し手順の結果として体壁から分離さになっ神経筋接合部（NMJ）、で。これらの組織から発せられる蛍光信号は、セル境界を表皮すると体WALの狭いストリップでを除いて、トラクトをデンドライトする局在コーラの大部分を隠さ筋肉が不在である背側正中線、近くリットル。クラスIV DAニューロンの細胞体を概説コーラは筋肉上のサンプル（ 図2A-2B）で可視化されませんでした。このようなDLGとしても高い筋肉の発現を有する表皮発現されたタンパク質の可視化は、特に問題です。筋肉上のサンプルでは、表皮中のDLGの分布はほぼ完全に筋肉やNMJ（ 図2D）からの蛍光によって覆い隠されました。筋肉を除去した後、DLG容易DAニューロンの樹状突起に沿って断続的な管で、表皮細胞の境界で検出され、クラスIV DAニューロン細胞体（ 図2E）に概説されています。このように、筋肉の除去は、そうでなければ、筋肉および関連組織によって不明瞭表皮とneuronally発現タンパク質の可視化を可能にします。
加えて、クラスIV DAニューロンマーカーの蛍光強度は、筋肉のフィレットが低減出現したことが観察されました撮像パラメータは、2つのサンプル調製物（ 図2A、2C）との間で一定に保持した筋肉オフフィレットに比べ。増大したレーザー出力で、クラスIV DAニューロンマーカーの見掛けの蛍光強度は、筋肉オフサンプルに一致することができるが、バックグラウンドノイズは、（ 図2B、2C）に増加しました。したがって、筋肉の除去は、我々のサンプルにおける信号対雑音比を改善します。
最後に、我々は、筋肉組織を除去することによって得られる改善は、サブ回折分解能でクラスIV DAニューロンの画像化に適用することができるかどうかを試験しました。これを行うために、3D構造化照明顕微鏡（SIM）像形成は、約120nmでの横方向分解能13を達成する、行いました。共焦点イメージングと同じように、我々はまず、同一の撮影条件の下で、その後、レーザーパワーを最適化した後、コーラとクラスIV DAニューロンのための免疫染色筋肉オンおよび筋肉オフフィレット、エキスポを比較しましたURE時間、及び筋のサンプルで、画像処理。筋肉オフフィレット（ 図3A-3C）と比較して、同様に共焦点顕微鏡により、筋肉でのノイズ比に実質的に低減された信号が観察されました。また、画像再構成は、筋肉オフサンプルにおいてシャープ登場しました。筋肉オンサンプルと比較すると、（ 図3B、3C）を少なく明らかアーティファクトが観察されたとコーラデンドライトトラクトをより容易に解決されました。デンドライト膜は筋肉オフフィレットで幅が約114 nmで測定したが、筋肉オンフィレット（ 図3D、3E）で広い272 nmであるように思われた可能性があります。したがって、我々のプロトコルは、クラスIV DAニューロンの可視化への超解像顕微鏡法の適用を可能にします。
筋肉の取り外し手順の1.概要図。幼虫を解剖し、シリコンに固定され、皿を解剖エラストマー。筋肉組織を除去するために、ある鉗子プロングは、セグメント境界（2.2）付近の背側正中線から開始し、筋肉及び上皮細胞層との間に挿入されます。鉗子は、筋肉と体壁（2.3）との間の取り付けを破るために上向きに引っ張られます。これは、興味のあるセグメントに対して繰り返され、その後、幼虫は、ホルムアルデヒド（2.5）に固定されています。固定後、鉗子は、体壁（2.7から2.8）から、残りの筋肉組織を分離するために使用される幼虫クチクラおよび表皮は赤で、オレンジ色でクラスIVダ緑のニューロン、および筋肉を描かれています。 （2.2）および（2.7）中の挿入図は、単一の幼虫の半セグメントの断面図を表している。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2.筋肉の取り外し共焦点DAニューロンのイメージングと表皮が向上コーラ（緑; AC）の免疫蛍光。またはDLG（緑; DE）は 、筋肉組織（A、B、D）とし、筋肉組織（C、E）せずに検出されました。クラスIV DAニューロンは、UAS-CD4を発現することが GAL4「477ドライバを使用して標識した：tdTomatoと抗DsRedの抗体（赤）で検出しました。コーラのために標識された筋オンおよび筋肉オフサンプルは、最初に同一の条件（A、C）の下で共焦点顕微鏡で画像化した後、増加したレーザパワーで筋干渉（B）を補償します。 DLGのために標識筋肉オンと筋肉オフのサンプルを個別に最適化された条件下で画像化しました。すべての画像は、共焦点Z-投影です。中央（緑）及び底部（赤）のパネルは、個々のチャネルを示します。トップパネルは、合併チャネルです。筋肉組織の境界（点線）、クラスIVDAニューロン細胞体（シアン矢印）、コーラおよびDLGは、管（白矢印）、表皮細胞の境界（マゼンタ矢印）、NMJ（黄色の矢印）、および気管（オレンジ色矢印）が示されているがデンドライト。スケールバー=20μmである。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.筋肉の取り外しは、ダニューロンのイメージングと表皮細胞の超解像を可能にします。コーラの免疫蛍光検出（緑）、クラスIVのDAニューロンの筋肉無傷の（A、B）とし、筋肉の除去（C）の後。 。クラスIV DAニューロンは、筋肉の図2のように標識し、筋肉オフのサンプルを同一の条件（A、C）の下で最初の構造化照明顕微鏡で画像化しました。筋肉上のサンプル（A）筋肉干渉（B）を補償するために、次に増加レーザパワーと露光時間で再画像化しました。すべての画像はZ-投影です。 ACの中央（緑）及び底部（赤）のパネルは、個々のチャネルを示します。 ACのトップパネルは、マージです。表皮細胞の境界（マゼンタ矢印）、コーラデンドライト管（白矢印）、および画像再構成アーチファクト（黄矢印）が示されています。 B及びCの下のパネルにおける挿入図は、それぞれ、D及びEに対応します。樹状突起膜の見かけの幅は、筋肉オン（D）および筋肉オフ（E）のサンプルに示されています。スケールバー= 3ミクロン（AC）と0.5ミクロン（D、E）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
ここでは、プロトコルは、ショウジョウバエの幼虫の切り身から筋肉組織を手動で除去するために記載されています。このプロトコルは、以前幼虫の解剖技術10,11を説明し修正します。幼虫は、シリコーンエラストマー皿に切開した後、背側正中線が配置されています。単一鉗子プロングは、その平坦可能な向きに、慎重に背側正中線近くに、筋組織と表皮との間に挿入されます。鉗子を穏やかに関心のある各幼虫のセグメントに1アンカーポイントから筋肉組織を分離するために上向きに引っ張られます。幼虫のフィレットは、その後、鉗子は、残りのアンカーポイントから筋肉を引き離すために再び使用された後、冷ホルムアルデヒド中で固定されています。
筋肉の除去手順の後固定の全体を実行するために魅力的ですが、私たちは、延伸筋肉は、一度固定し、レンダリング、平坦化されたままと密接にさえアンカーポイントから剥離した後、表皮に並置することを見つけますそれは困難な下にある組織を損傷することなく操作します。さらに、我々の経験では、固定された筋肉組織は脆く、体壁からの完全な除去を防止し、簡単に涙。対照的に、筋肉を固定前に1アンカーポイントから取り外されたときに、より容易に鉗子によってつかみ、幼虫の体壁から引き出すことができる組織スタブを残して、固定の際に残りのアンカーポイントに向かって収縮します。
最高のサンプルを維持するためには、かなりの注意が筋肉の取り外し手順で鉗子と表皮との間の接触を最小限に抑えるように注意しなければなりません。その結果、当社のプロトコルは、前述の解剖技術10,11に数分を追加することができます。組織の劣化を回避するために、固定前に解剖されている幼虫の数は、経過時間がない25分以上しないよう制限する必要があります。さらに、当社は、鉗子の複数のペアをテストするお勧めします - 同じカ月の鉗子をデルは、形状やシャープネスがかなり異なる場合があります - とフィレットが組織保存および解剖速度を向上させるために、前の筋肉の除去に引き伸ばされる程度を調整します。
最後に、我々は幼虫の解剖時の標準HL3.1の生理食塩水対のCa 2+を含まないHL3.1生理食塩水の使用を試してお勧めします。カルシウムの非存在下で、幼虫の筋収縮が大幅に低減されます。このように、幼虫の切り身は、Ca 2+を含まないHL3.1生理食塩水で解剖したときに操作することが容易です。しかし、我々は、筋収縮は、筋肉と表皮の間にスペースを作成し、表皮への損傷のリスクを最小限に抑えながら、これは、これらの組織間の鉗子の挿入を容易にすることができることがわかります。その結果、標準HL3.1は、表皮およびDAニューロンの完全性を保存することが好ましい場合があります。生理食塩水と選択肢のいずれかがユーザーに任されていると我々は良い結果を得ます。
一方、我々のプロトコルが増加先に述べた解剖技術10,11の期間および複雑さは、それが幼虫の感覚ニューロンと表皮細胞を画像化するために有用ないくつかの改善を提供しています。まず、それはそうでなければ、筋肉組織によって覆い隠されているneuronally及び表皮発現されたタンパク質のイメージングを可能にします。第二に、それは雑音比に蛍光シグナルを改善します。最後に、DAニューロンと表皮中のタンパク質の空間的関係の優れた識別のための超解像顕微鏡の使用を可能にします。私たちは筋肉の除去を以下の項目を守って改善された結像品質は、おそらくサンプルとカバーガラスの間に減少光子吸収や散乱だけでなく、距離の減少の結果です。ここで実証されていないが、筋肉の除去は、おそらくまた、免疫蛍光の質の向上、表皮およびDAニューロンへの抗体のアクセスを改善します。グレーター抗体アクセシビリティabsenで行われる免疫蛍光プロトコルのために特に有用であり得ます剤4を透過性組織のCE。
このプロトコルを使用することによって得られた改善は、感覚ニューロンにおける樹状突起の形態形成を調節する神経細胞と表皮の要因の研究に利益をもたらす可能性があります。また、筋肉の除去は、以前に、幼虫の体壁に感覚ニューロンの電気生理学的研究を促進しており、このプロトコルの修正版は、幼虫の感覚ニューロンの神経生理学的な操作を採用し、将来の研究のために有用である可能性があります。最後に、このプロトコルの修正バージョンは、遺伝子発現プロファイリングのための単一のDAニューロンの単離のような他の用途に向けて有用であり得ます。
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Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Acknowledgments
私たちは顕微鏡上で有用な議論のためのゲイリーLaevskyに感謝します。 NIHによって資金を供給されたこの作品は、ERGにR01GM061107とR01GM067758を付与します
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dumont #5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72701-D | |
| Micro Scissors, 8 cm, straight, 5 mm blades, 0.1 mm tips | World Precision Instruments | 14003 | |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Dow Corning | 3097358-1004 | for dissecting plates |
| Austerlitz insect pins, 0.1 mm | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| Fostec 8375 light source | Artisan Technology Group | 62792-4 | |
| Zeiss Stemi 2000 | Carl Zeiss Microscopy | ||
| Vectashield antifade mounting medium | Vector Laboratories | H-1000 | for confocal microscopy |
| Prolong Diamond antifade mountant | Life Technologies | P36970 | for structured illumination microscopy |
| Micro cover glass, 22 x 22 mm, No. 1.5 | VWR | 48366-227 | |
| Superfrost Plus microscope slides, 25 x 75 x 1.0 mm | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Mouse anti-Coracle antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | C615.16 | supernatant, dilute 1:50 |
| Mouse anti-Discs large antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 4F3 | supernatant, dilute 1:50 |
| Rabbit anti-dsRed antibody | Clontech | 632496 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-rabbit antibody, Alexa Fluor 568 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11011 | dilute 1:1,000 |
| Goat anti-mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | ThermoFisher Scientific | A-11001 | dilute 1:500 |
References
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