Abstract
NK-cel cytotoxiciteit is een veel gebruikte maat voor het effect van externe interventie NK celfunctie bepalen. Echter, de nauwkeurigheid en reproduceerbaarheid van deze test onstabiel beschouwd, hetzij door een vergissing gebruiker of vanwege de gevoeligheid van NK cellen voor experimentele manipulatie. Om deze problemen te elimineren, een workflow die hen reduceert tot een minimum werd opgericht en wordt hier gepresenteerd. Ter illustratie, we bloedmonsters op verschillende tijdstippen van lopers (n = 4), die een intensieve training opgemeten werden. Eerst worden NK-cellen tegelijkertijd geïdentificeerd en geïsoleerd door middel van CD56-tagging en magnetische gebaseerde sortering direct uit volbloed en van slechts één milliliter. De gesorteerde NK cellen verwijderd van elke reagens of capping antilichamen. Ze kunnen worden geteld om een nauwkeurige NK cellen vast per milliliter bloed. Ten tweede kan de gesorteerd NK-cellen (effector cellen of E) worden gemengd met 3,3'-Diotadecyloxacarbocyanine perchloraat (DIO) hebben K562 cellen (doelcellen of T) en een test-optimaal 1: 5 T: E-verhouding en geanalyseerd met een beeldvormende flow cytometer dat zorgt voor de visualisatie van elk voorval en het verdwijnen van een valspositieve of valse negatieven (zoals doubletten of effectorcellen). Deze workflow kan worden voltooid in ongeveer 4 uur, en zorgt voor een zeer stabiele resultaten, zelfs bij het werken met menselijke monsters. Indien beschikbaar, kunnen onderzoeksteams testen verschillende experimentele interventies bij menselijke proefpersonen, en vergelijk metingen tussen verschillende tijdstippen, zonder afbreuk te doen aan de integriteit van de gegevens.
Introduction
Natural killer cellen zijn een essentieel onderdeel van het aangeboren immuunsysteem. Terwijl de kamers worden gereguleerd, ze hebben de mogelijkheid om te herkennen en te elimineren abnormale cellen via cel-cel contact en zonder voorafgaande activering 1. Als zodanig vormen ze een snelle lijn van verdediging tegen infecties. Oefening, intense, is aangetoond dat tijdelijk onderdrukken van het immuunsysteem 2, 3, 4, 5. NK-cellen zijn bijzonder gevoelig voor dit effect 4, 6, 7, waardoor effectief een venster van verhoogde gevoeligheid voor ziekte. Vandaar dat de studie van interventies voor, tijdens of na intensieve training met als doel het verminderen van de gevolgen NK celfunctie van bijzonder belang is voor het welzijn van atleten na wedstrijden.
8 bij ongeveer 1% van de witte bloedcellen compartiment; 2) NK-cellen zeer gevoelig zijn voor stress en vertrouwen op constante blootstelling aan fysiologische omstandigheden levensvatbaar en stabiel tijdens experimenten te blijven; en 3) standaard assays voor NK-cel cytotoxiciteit te bepalen, zoals Ficoll gradiënten 9 kort assays 10, onbetrouwbaar en inconsistent. De inherente variabiliteit van menselijke stalen verbinding alleen deze kwesties. Verse menselijke monsters verzameld tijdens ingrepen zijn vrij geregeld en moeilijk te schaffen, tenminste in vergelijking met diermonsters of geïmmortaliseerde cellijnen. Dit vermindert de kansen om experimenten te herhalen of de deelnemers aan de studie cohort om significante statistische drempels bereiken. Tezamen zijn deze problemen achter de noodzaak voor een gestroomlijnde protocol waarmee for zowel high-throughput en een zeer betrouwbare analyse van de NK-cel lytische activiteit in menselijke monsters.
We hebben een workflow dat de tijd verkort die nodig zijn om te identificeren, te isoleren en te testen NK-cellen uit menselijk bloed terwijl het minimaliseren van de blootstelling aan externe factoren. De werkwijze optimaliseert het gebruik van twee instrumenten, een magnetisch gebaseerde celsorteerinrichting en een beeldvormende stromingscytometer en een test-specifieke, geoptimaliseerde T: E verhouding tot de detectie van afname of toename van NK-cel cytotoxiciteit mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
LET OP: Alle incassoprocedures bloed werden uitgevoerd in overeenstemming met de uiteengezet door de Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB) richtlijnen.
1. Hele bloedafname
- Heeft u een gecertificeerde phlebotomist bloed te trekken volgens de richtlijnen van de World Health Organization.
- Trekken bloed in een 4 ml bloedafname met Di-Kalium Ethyleendeniaminetetraacetaat (K 2 EDTA). Inverteer bloedafname volgens de instructies van de fabrikant. Houd bloedafname bij kamertemperatuur op een bankje-top rocker tot scheiding.
2. Voorbereiding van de DIO-gelabelde doelcellen
- Groeien K562 cellen in compleet Iscove's gemodificeerd Dulbecco's Media (IMDM), aangevuld met 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline streptomycine gedurende verscheidene weken voorafgaand aan de test om de gezondheid van de cellen te waarborgen. Pas de concentration van de cellen 3 x 10 5 cellen / ml dagelijks door de voltooiing van een celgetal en daaropvolgende passage van cellen. Voer een volledige media veranderen elke 2 tot 3 dagen.
- Op de dag van de test uitvoert een celtelling met een 1: 1 hemocytometer.
- Verwijderen 10 pi uit de K562 kolf en plaats in 1,5 ml buis.
- Voeg 10 ul van trypan blauwe kleurstof in dezelfde 1,5 ml buis voor een verdunningsfactor van 1: 1.
- Zachtjes flick buis K562 cellen mixen en trypan blauw kleurstof.
- Sta K562 cel-trypan blauwe kleurstof incuberen 1 min bij kamertemperatuur.
- Verwijder 15 pi van gebrandschilderd K562 cellen uit buis.
- Pipet op hemocytometer voor celgetal.
- Aantal cellen in de vier hoeken vierkanten en het middelste vierkant in totaal vijf vierkanten.
- Bereken cellen met de volgende formule:
Total cellen / ml = Total cellen geteld X (verdunningsfactor / aantal vierkantjes) X 10.000 / mL
- Voor ongekleurde K562 doelcellen, voeg 10 ml K562 targetcellen een 15 ml buis bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml voor een totaal van 10 x 10 6 K562 cellen. Plaats in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 tot aan gebruik.
- Dio gekleurd K562 doelcellen, voeg 10 ml K562 doelcellen een 15 ml buis bij een dichtheid van 1 x 10 6 cellen / ml voor een totaal van 10 x 10 6 K562 cellen.
- Voeg 1 ul van DIO cel-labeling oplossing per ml celsuspensie in 15 aangewezen voor DIO kleuring en voorzichtig vortex ml buis. Bijvoorbeeld, voeg 10 ul van cel-labeling oplossing Dio 10 x 10 6 K562 cellen / ml in een volume van 1 x 10 6 cellen / ml.
- Incubate K562-dio oplossing gedurende 20 minuten bij 37 ° C met 5% CO2 in een 15 ml buis.
- Volgening incubatie 3 ml kamertemperatuur fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) aan K562-Dio oplossing die 15 ml buis.
- Centrifugeer 10 min bij 135 xg bij kamertemperatuur.
- Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet met een 1000 ui volume verstelbare pipet.
- Voeg 10 ml vers IMDM naar cel pellet bevattende 15 ml buis.
- Voorzichtig vortex buis om de cellen te resuspenderen.
- Herhaal stap 2,7-2,10 twee keer.
- WINKEL cellen in een 37 ° C incubator met 5% CO 2 tot aan gebruik.
OPMERKING: Cellen kunnen worden opgeslagen in de incubator gedurende maximaal 24 uur, maar het de voorkeur om ze te gebruiken op dezelfde dag.
3. Voorbereiding van Controls
- Breng de volgende in afzonderlijke en gemerkte 1,5 ml buizen:
- Voeg 500 ul van vers IMDM dat gesuspendeerd DIO-gelabelde K562 cellen in de "Double Positive" gelabeld 1,5 ml buis.
- Voeg 500 ul van vers IMDM dat gesuspendeerd DIO-gelabelde K562 cellen in de "enige dio" gelabeld 1,5 ml buis.
- Voeg 500 ul vers IMDM geresuspendeerd met ongelabelde K562 cellen in de "propidiumjodide (PI) in" gelabelde 1,5 ml buis.
- Breng het dubbele positieve en PI alleen buizen in een 55 ° C waterbad gedurende 5 min.
- Na 5 minuten is verstreken verwijderen buizen en afvegen met 70% ethanol.
- Voeg 10 L van PI Double positieve en PI slechts 1,5 ml buizen.
- Plaats alle drie K562 doelcel controles in de incubator bij 37 ° C gedurende 30 minuten.
- Na 30 minuten incubatie is verstreken, centrifuge drie K562 doelwitcel regelaars voor 2 min bij 163 x g.
- Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet.
- Resuspendeer elk besturing met 20 pL vers IMDM celkweekmedia, en laat in de 37 ° C incubator met 5% CO2 gedurende ten minste30 min voor een optimale Dio signaal.
LET OP: De controles zijn nu klaar om cytometer worden uitgevoerd door de beeldvorming flow.
4. NK Cell Geautomatiseerde Separation
- Schakel cel afscheider en laat de start-up cyclus te beëindigen.
- Zorg ervoor dat alle vloeistof flessen verlichtingen zijn groen en dat de fles afval leeg is.
- Zorg voor een kamertemperatuur van 15 ml buis rack.
LET OP: De selectie is gebaseerd op de steekproef volumes. Bijvoorbeeld, voor een hoeveelheid van minder dan 3 ml gebruiken een 15 ml buis en rek voor een volume van meer dan 3 ml gebruiken een 50 ml buis rek. - Label monsterbuizen dienovereenkomstig (Repeat per monster / deelnemer): Deelnemer 1 volledig bloedmonster; Deelnemer 1 Negatieve fractie; Deelnemer 1 Positief fractie.
- Voorzichtig pipet 1,5 ml volbloed van Stap 1.2 in "Whole Blood Sample" 15 ml buis.
- Plaats op geschikte wijze gemerkte 15 ml "Whole Blood Sample" buis uit stap 4.5 en gelabeld 15 ml "Negatief Fraction" en"Positief Fractie" buizen uit stap 4.4 in de buis rack. Gebruik thefollowing sample rack set-up: Rij (R1) A: volledig bloedmonster, Row (R2) B: Negatief, ongelabelde fractie, Row (R4) C: Positief, magnetisch gemerkte fractie.
- Plaats de separator rack op de MiniSampler voor autolabeling.
- Selecteer "reagens" op het menu en markeer de positie waar de flacon in de afscheider rack wordt geplaatst.
- Selecteer "Lees Reagent" naar de 2D-codelezer activeren.
- Plaats het reagens flacon voor de 2D-codelezer tussen 0,5-2,5 cm vanaf de codelezer deksel.
OPMERKING: Bijvoorbeeld, de vereiste reagens NK celscheiding is CD56. - Houd reagensflesje schuin voor 2D-codelezer optimaal lezen.
- Plaats de reagensflesje in de juiste afscheider rack positie.
- Markeer de gewenste posities op het tabblad Separation op het scherm.
- Vanaf het submenu Labeling, wijst u een autolabeling programma.
- Wijs de Cell Separation Reagent CD56 microbolletjes posities 1, 2, 3, en 4 rack.
- Selecteer de "posselwb" scheiding programma.
- Selecteer de "spoelen" wasprogramma.
- Plaats een sample volume van 1500 pi in de "Volume" submenu met behulp van het numerieke toetsenbord.
- Selecteer de "Enter" optie op het toetsenbord.
- Selecteer "Run" om de scheiding cel te starten.
- Selecteer "OK" om te bevestigen dat er voldoende buffer is beschikbaar voor de verwerking van alle monsters.
5. NK Cell Count Na Cell Separation
- Onmiddellijk na celscheiding met de cel separator, halen de positieve fractie. Laat bij kamertemperatuur. Deze fractie bevat de gewenste zuivere NK celpopulatie.
- Voor elk individueel monster, het uitvoeren van een aantal cellen met behulp van een hemocytometer als per stap 2.2.
- Na de berekeningen, noteer de celgetal.
6. cytotoxiciteit Assay Monstervoorbereidingstesten
- Bereid en label 1,5 ml buizen voor elk monster / deelnemer dienovereenkomstig.
- Pipet gewenste verhouding van NK-cellen en DIO-gelabeld K562 cellen in elke buis.
OPMERKING: Bijvoorbeeld, de gewenste verhouding van K562 doelwitcellen en effector NK cellen 1: 5. - Centrifugeer gedurende 5 minuten bij 135 x g.
- Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet.
- Resuspendeer NK-Dio gemerkte K562 celmengsel in 500 pi van NK celmedium zonder interleukine-2 (IL-2) en 2-mercaptoethanol (2-ME) (incomplete NK celkweekmedium).
LET OP: De onvolledige NK media voor celkweek is Minimum Essential Medium Eagle met natriumbicarbonaat, zonder L-glutamine, ribonucleosiden en deoxyribonucleosides. - Voeg 5 ul van PI aan elke buis.
- Centrifugeer gedurende 2 min bij 163 x g.
- Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Na 2 uur incubatie, centrifugalege gedurende 2 minuten bij 163 x g.
- Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet.
- Resuspendeer cellen in 25 ul onvolledige NK celkweek media.
7. Bereiding van Spontane ( "S") Sample
- Pipetteer 500 ul van DIO-gelabelde K562 cellen (concentratie van 1 x 10 6 cellen / ml) in 1,5 ml buis.
- Voeg 10 ul van PI aan elke buis.
- Centrifugebuis gedurende 2 minuten bij 163 x g.
- Incubeer cellen bij 37 ° C gedurende 2 uur.
- Na 2 h incubatie centrifugeer gedurende 2 min bij 163 x g.
- Verwijder voorzichtig supernatant zonder verstoring van de cel pellet.
- Resuspendeer cellen in 25 ul incomplete alpha-Minimum Essential Medium (α-MEM) celkweek media.
8. Data Acquisition met Imaging flowcytometer
- Druk op de groene knop in de voordeur van de imaging stromingscytometer te schakelen op het instrument.
- Zet all computers in verband met de beeldvorming flowcytometer.
- Start de imaging flowcytometer software.
- Klik op de "Startup" knop om het systeem te spoelen en de voorbereiding van het monster lijn.
- Zodra de "Startup" is voltooid, sluit het venster "Calibrations".
- Wijs kanalen: op de bovenste linkerkant, klikt u op elk kanaal om ze toe te wijzen.
- Aan de rechterkant, klikt u op de scatterplot knop om 4 scatterplots maken: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Raw Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Raw Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 en FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
- Begin met het analyseren van monsters door eerst met behulp van de "Double Positive" control.
- Klik op "Load."
- Plaats de 1,5 ml buis met de "Double Positive" monster van Stappen 3,4-3,9 in het monster loader.
- Selecteer de 40X doelstelling onder het tabblad "Vergroting".
- Schakel de 405 mW en642 mW lasers.
- Schakel de "Helderveld" kanaal.
- Klik op "Select Intensity."
- Op basis van de "Double Positive" controlemonster, bepalen de gewenste intensiteit van de laser 405 mW zodat de detector niet overbelast.
Opmerking: Zo werd de optimale intensiteit voor dit experiment ingesteld op 11 mW.
- Nadat de gewenste set-up wordt bereikt, te verwerven gegevens.
- Onder het tabblad "File Acquisition", voer in een aangepaste bestandsnaam tekst. Selecteer een map voor het opslaan van de data file (s).
- Voer het aantal cellen te verwerven naast "Verzamel". Normaal gesproken is dit aantal varieert tussen 1000 tot 10.000.
- Klik op "te verwerven."
LET OP: Als het gewenste aantal cellen is verkregen, wordt het bestand automatisch opgeslagen in de eerder geselecteerde map.
- Na de overname is voltooid, plaatst u de volgende controle monster - Dio alleen controle.
- Klik op "Load."
- Plaats de 1,5 ml buis met de "DIO only" monster in het monster loader.
- Laat de 40X doelstelling onder het tabblad "Vergroting" geselecteerd.
- Laat de 405 mW laser ingeschakeld.
- Schakel de 642 mW laser en de "Helderveld" kanaal.
OPMERKING: Nu de gewenste opstelling is bereikt, kan data worden verkregen. - Onder het tabblad "File Acquisition", voer in een aangepaste bestandsnaam tekst en selecteer een map voor het opslaan van de data file (s). Voer het aantal cellen te verwerven naast "Collect.". Meestal is dit getal 1000.
- Klik op "te verwerven."
LET OP: Als het gewenste aantal cellen is verkregen van de gegevens wordt automatisch opgeslagen in de eerder geselecteerde map.
- Herhaal stap 8.10 voor de "PI-only" controlemonster. De experimentele monsters zijn nu klaar om te worden verzameld.
- Behandel de remaining experimentele monsters, inclusief de "spontane" S "monsters" als volgt:
- Laat de 40X doelstelling onder het tabblad "Vergroting" geselecteerd.
- Zet de 405 mW en 642 mW lasers.
- Zet de "Helderveld" kanaal.
- Klik op "Set Intensity."
- Onder het tabblad "File Acquisition", voer in een aangepaste bestandsnaam tekst en selecteer een map voor het opslaan van de data file (s). Voer in een aangepaste bestandsnaam tekst.
- Voer het aantal cellen te verwerven naast "Collect."
- Klik op de "Acquire" knop.
LET OP: Als het gewenste aantal cellen is verkregen van de gegevens wordt automatisch opgeslagen in de eerder geselecteerde map.
- Herhaal stap 8.12 voor alle experimentele monsters.
- Na alle experimentele gegevens en bestanden zijn verzameld, klikt u op de "Afsluiten" knop om het systeem te steriliseren.
9. Imaging flowcytometer Sample Analysis
- Open de beeldvorming flowcytometer analyse software.
- Onder "File", opent een experimentele .RIF bestand.
- Bouw een nieuwe matrix met behulp van de enkele kleur .RIF bestanden (DIO-uitsluitend het beheer en PI-only control, gemaakt tijdens stappen 8.10 en 8.11) door te kiezen voor "Create a New Matrix" onder het tabblad Compensation in de imaging flowcytometer software.
OPMERKING: De software vraagt voor de selectie van één kleur bestanden en samenvoegen tot een matrix bestand (.ctm extensie) te creëren, die wordt geselecteerd kanaalcompensatie passen. - Maak dot plots met behulp van de functie "bouwstenen" van de software.
- Maak een dot-plot (BrightFieldGradient_RMS vs frequentie) aan de poort van de gerichte cellen. Bel de gate "Focus" (Figuur 1A).
- Met behulp van de "Focus" poort, maak een dot plot van Bright Field Area vs Bright Field beeldverhouding g at de singlet cellen. Bel de gate "Single" (Figuur 1B).
- Met behulp van de "Single" poort, maak een dot plot van Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Gebruik dit perceel te identificeren en gate DIO-positieve alleen cellen (targets, levend) en PI-DIO dubbele positieve cellen (targets, dood) (figuur 1C).
LET OP: Alle percelen beschreven in de stappen 9.4.1, 9.4.2 en 9.4.3 kan worden gemaakt met behulp van de functie "bouwstenen" van de software.
- Klik op de statistieken functie van de dot plot om toegang te krijgen cel aantallen van elke poort.
- Bereken het percentage dode doelen in de spontane monster en proefmonsters volgens de volgende formule:
% Dode doelwitten in het monster = (#dead targets x 100) / (# wonen targets + #dead targets) - Bereken cytotoxiciteit met de volgende formule:
% Cytotoxiciteit = [(Experimental dead-Spontaan dood) / (100-Spontane dood)] x100
Figuur 1: Representatieve histogrammen, scatter plots en afbeeldingen voor cytotoxische activiteit analyse. (A) aandacht cel analyse. (B) single cell analyse. (C) doelwitcel kleuring analyse. Alle bepalingen worden uitgevoerd met de afbeelding bij elke gebeurtenis. Dit kan in de analyse software worden benaderd door simpelweg te klikken op het evenement op de grafieken. (D) representatief beeld van een doublet evenement, dat een apoptotische NK cel en een live-K562 doel. CH01, Helderveld. CH02, Dio. CH05, PI. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bepaling van NK cellen
Het effect van zware verkeer op NK cellen in volbloed werd berekend op basis van de inspanningsprotocol in figuur 2 beschreven. Bloedmonsters werden voor de inspanning, onmiddellijk na de training, 1,5 uur na inspanning, en tenslotte 24 en 48 uur na de eerste bloedafname. De concentratie van NK cellen per milliliter bloed werd gemeten voor elke loper (figuur 3A) en gemiddeld (Figuur 3B) voor elk tijdstip.
Onze resultaten (Figuur 3A) toont dat lopers 1, 2 en 4 aanwezig een vergelijkbaar patroon met een lichte toename van NK-cellen na inspanning, onmiddellijk gevolgd door een scherpe daling, voordat langzaam terug naar normaal na 24 en 48 uur. Deze trend was vooral zichtbaar door NK cellen gemiddelden plotten de groep lopers, maar geen significant verschilpre-inspanningsniveaus gedetecteerd. Runner 3 presenteerde een zeer hoog aantal in eerste instantie, die sterk gedaald na de training en 1,5 uur na het sporten, voordat langzaam terug te keren naar normaal na 24 en 48 uur. In het gemiddelde, het NK celgetal (Figuur 3B) daalde 1,5 uur na de training (zij het niet significant), maar was terug tot bijna normale niveaus na 24 uur.
Bepaling van NK-cel cytotoxiciteit
Na het berekenen van de NK-cel telling werden NK-cellen onmiddellijk tot hun cytotoxische activiteit te bepalen zoals beschreven in hoofdstuk 6 van het protocol. De resultaten zijn weergegeven in Figuur 4A voor elke individuele agent, figuur 4B die de gemiddelde NK cytotoxiciteit. Onze resultaten tonen aan dat de gemiddelde NK cytotoxiciteit licht gedaald na het sporten en 1,5 uur na de training (zij het niet-significant), maar aanzienlijk toegenomen na 24 uur. De NK cytotoxiciteit bleef hoog in vergelijking met de pre-Oefening niveaus, zij het niet-significant (gedeeltelijk te wijten aan het kleine aantal deelnemers aan dit proefproject).
Figuur 2: Oefening protocol. Bloed trekt (rode pijlen) werden uitgevoerd op n = 4 lopers.
Figuur 3: NK-cellen telt pre-training, na de training, 1,5 uur en 21 uur na de training. (A) NK celgetal per milliliter bloed per individuele loper. (B) gemiddelde NK celgetal per milliliter bloed. N = 4; Schaal bars = standaard fout.
Figuur 4:NK-cellen cytotoxiciteit pre-training, na de training, 1,5 uur en 21 uur na de training. (A) NK-cel cytotoxiciteit (uitgedrukt als een percentage dode doelwitcellen) voor elk loper. (B) Gemiddeld NK-cel cytotoxiciteit (uitgedrukt als een percentage dode doelwitcellen). N = 4; Schaal bars = standaard fout; *: P <0,05; **: P <0,005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De werkwijze beschreven in deze studie meet direct de specifieke activiteit van NK-cellen van een individu in reactie op stimuli (in dit geval, langdurige oefening). Kenmerkend worden NK-cellen geïsoleerd van bloed dichtheidsscheiding gradiënten of celsortering door een combinatie van merkers. Hoewel deze werkwijzen op grote schaal worden gebruikt, hebben veel nadelen: ze zijn tijdrovend, omvatten meerdere manipulaties en zijn sterk afhankelijk van de gebruiker. Hierdoor wordt onnodige nadruk gelegd op de geïsoleerde NK-cellen, wat kan leiden tot verhoogde variabiliteit van experiment tot experiment, of zelfs binnen hetzelfde experiment. In dit artikel beschrijven we een protocol dat magnetische gebaseerde isolatie gebruikt. Dit maakt een snelle en betrouwbare sortering van een groot aantal NK cellen in volbloed van een individu, terwijl het minimaliseren van bloed of NK-cel manipulatie.
Deze methode is vooral geschikt voor menselijke studies waarbij monsters dun, maarAan de andere kant van de methode wordt het vrij moeilijk wanneer er te veel monsters moeten samen worden verwerkt. Inderdaad moet het raam van verkrijging cytotoxische assay meestal binnen 30 minuten na het einde van de incubatie, die in onze ervaring vertalen in 5 monsters tegelijk hooguit. Als er veel monsters worden verwerkt, is het essentieel om een duizelingwekkende schema vast te stellen om voldoende tijd voor flowcytometrie overname mogelijk te maken. Een ander nadeel van deze werkwijze kunnen de kosten van de reagentia die vrij hoog zijn en kan snel worden geconsumeerd als meer hoeveelheid bloed wordt verwerkt voor hogere opbrengst NK zijn. Wij zijn echter van mening dat deze kosten worden gecompenseerd door de aanzienlijke hoeveelheid tijd bespaard.
De kritische stappen in dit protocol zijn degenen die het meest openstaan voor wijzigingen. Het is cruciaal om het bloed bij kamertemperatuur behouden en te verwerken binnen een uur van tekening NK cel-stress voorkomen. Na isolatie celtelling is uiterst kritisch voornauwkeurigheid resultaat, zodat de telmethode moet constant zijn, bijvoorbeeld voor trypan blue assay te controleren of meerdere velden geteld op de hemocytometer, en dat de gebruiker of lab gebruikt dezelfde identificatieparameters. Het protocol hier gepresenteerde gebruik 1,5 ml bloed en test NK-cel cytotoxiciteit op T: E-verhouding van 1: 5, maar deze parameters kunnen worden geoptimaliseerd, afhankelijk van de gewenste test en de beschikbare hoeveelheid bloed: indien minder bloed beschikbaar is dan mogelijk om lagere verhoudingen zoals 1 gebruiken: 4 of 1: 3 tot nog redelijke acquisitietijd. In onze ervaring kan lagere verhoudingen niet volstaat om een geschikte cytotoxische activiteit mogelijk te maken. Ook vanwege sample variatie komt het voor dat de NK cellen is veel lager dan verwacht; reactie, moet de hoeveelheid doelcellen verlagen reactiebuizen dezelfde T doen: E ratio gehele experiment. Tijdens resultaatanalyse, de meest kritische stap is om zoveel tijd als nodigverkrijgen van een goede matrix. Dit kan alleen worden verkregen als grote zorg is genomen om de in stap 3 van het protocol beschreven controles voor te bereiden. Zodra poorten zijn vastgesteld, zoals beschreven in stap 9, kunt u bestanden aan elkaar worden gegroepeerd en in serie geanalyseerd met zeer weinig variatie. In geval van twijfel moet de gebruiker altijd de fotogalerij door te klikken op ieder geval uitgezet op een grafiek (te zien op figuur 1C), om te controleren of alle passende gebeurtenissen worden opgenomen in de juiste poort.
De representatieve resultaten in figuur 2A bleek dat 3 lopers van de 4 presenteerde een vergelijkbaar patroon. Het patroon van de 4 e runner waarschijnlijk specifiek voor die persoon en geen onjuiste handeling vertegenwoordigen. De NK cellen voor deze persoon is aan het boveneinde van acceptabele grenzen in volledig menselijk bloed zowel pre-oefening en 48 uur na training. Dit toont een van de sterke punten van de methode in dit document, waar de NK c beschrevenells nauwkeurig worden verkregen. Daarnaast is de mogelijkheid om natieve cellen te verkrijgen via één labeling stap zorgt voor minimale belasting en wijzigingen van de NK-cellen. Dit is bijzonder kritisch wanneer NK-cel cytotoxiciteit wordt gemeten onder fysiologische stressomstandigheden.
Na isolering NK-cel cytotoxiciteit kenmerkend bepaald door flowcytometrie of radioactieve afgifte test (chromium assay bijvoorbeeld). Terwijl afgifte assays worden beschouwd als een gouden standaard zij naar het gebruik van radioactieve isotopen en aanverwante apparatuur, die zeer duur zijn. Bovendien, voorschriften voor het gebruik en de verwijdering van radioactieve stoffen toe te voegen complexiteit experimenten die tijd-efficiëntie en precisie vereisen. Het gebruik van een flowcytometrie benadering zinvol maar typisch voorzorgen worden gevolgd waaronder laserinstellingen en fluorochroom compensatie en gating. Dit geldt vooral bij 2 verschillende celtypen in de sample, zoals het geval is voor cytotoxische assays. In ons geval het gebruik van een grafisch stroming cytometer maakt een beeld vast te leggen voor elke gebeurtenis, en de parametergrootte verhouding maakt de scheiding van doubletten van enkelvoudige cellen. Dit is een kritisch punt, aangezien de cytotoxische assay gebaseerd op het fysieke contact tussen effector en doel; heel vaak deze 2 soorten cellen zullen nog steeds bij elkaar zijn tijdens stroming meting, de invoering van valse dubbele positieven in de resultaten. Dit punt is geïllustreerd in figuur 1D, waarbij een doublet gevormd door een (stervende, PI negatief) NK cel geeft, en een (live, DIO positieve, PI negatief) K562 cellen. In traditionele flowcytometrie, zal deze gebeurtenis de K562 celdood telling worden toegevoegd, maar is in feite een vals positief. Gegevens verwijderen kan inderdaad problematisch zijn, maar het is niet zo consequent gedaan en met behulp van zeer strenge parameters van experiment tot experiment (in casu de parameter "aspect ratio"). In ruil,de verkregen gegevens zal veel stabieler. Bovendien visualiseren elk geval maakt de nauwkeurige gating (tellen) van elke gebeurtenis op basis kleurparameters, zonder te vertrouwen op harde poorten die traditioneel worden ingesteld met de knoppen en die geen rekening houden met de natuurlijke "data drift" die kan optreden bij flowcytometrie. De toegevoegde vermogen van de beeldvorming van elk doel gebeurtenis tijdens overname zorgt voor een verbeterde gating van single (alleen DIO, die de live-doel cellen) en dubbel-gekleurde bevolking (DIO + PI bevlekt, die de dode doelwitcellen).
Daarnaast is de workflow hier gepresenteerde werd geoptimaliseerd om rekening te houden met het gebrek aan NK cellen in volbloed en de noodzaak voor nauwkeurige resultaten. Terwijl de traditionele NK-cel cytotoxiciteit assays verken de lytische activiteit bij verschillende T: E verhoudingen is het onpraktisch om een aantal redenen: 1) de hoeveelheid beschikbare NK-cellen uit bloed beperkt en zeer variable en 2) het bedrag van target cellen die nodig zijn voor de analyse moet groot genoeg zijn om te zorgen voor vrij snel verkrijgen van de gegevens. Verscheidene testen met verschillende verhoudingen (hier niet getoond) toonden aan dat een 1: 5 T: E-verhouding, wat zich vertaalt in 4 x 10 4 T / 2 x 10 5 E geeft een optimale balans en zorgt voor grote reproduceerbaarheid. Gebaseerd op herhaalde testen met monsters van verschillende individuen (hier niet getoond), deze verhouding ook een verwachte cytotoxische activiteit van 50-70% in normale monsters, die een significant boven en onder raam biedt om het effect van interventies te meten.
De NK cellen was vergelijkbaar met wat werd gevonden in andere werken 11, 12, 13, en in overeenstemming met de aanvaarde bereik van de frequentie van NK-cellen op 14 bloed. Echter, is het voordeel van deze werkstroom getoond in figuur 3B, waarbij we vaststellened een significante toename van NK-cel cytotoxiciteit na 24 uur vergeleken met pre-training niveau, ondanks de NK-cellen die in gemiddeld (alhoewel niet significant) lager op hetzelfde tijdstip. Dit resultaat verschilt van andere gepubliceerde studies waarin cytotoxische niveaus waren meestal identiek (of lager) om de pre-training niveau. Het suggereert dat in plaats van depressief gedurende een lange tijdsperiode na de training, kan NK-cel cytotoxiciteit kunnen "rebound" naar nog hogere niveaus na slechts 21 uur na de oefening. Deze waarneming met behulp van een nieuwe methodologie met pure, gezonde NK-cellen, indien bevestigd in follow-up studies, heeft de potentie om de huidige perspectief te veranderen dat zware inspanning is immunosuppressieve. Wanneer NK-cellen worden verkregen middels Ficoll gradiënten of stroomcytometrie-gebaseerde sortering, de resulterende populatie is gemengd met andere celtypen, bevatten meerdere beschadigde NK-cellen en / of NK-cellen met gemodificeerde reactie. Deze gevolgen zijn om consi worden verwachtDering de lengte, hardheid en / of onnauwkeurigheid van de bovengenoemde methoden. Het verwijderen van deze kwesties, en een verblijf in de buurt van fysiologische omstandigheden te allen tijde, zal leiden tot experimentele resultaten meer representatief zijn voor de NK-cellen in vivo gedrag.
Samengevat beschrijven we een geïntegreerde workflow die zorgt voor een snelle, nauwkeurige isolatie en detectie van NK-cel cytotoxiciteit van kleine humane bloedmonsters dat sommige van de beperkingen geassocieerd met andere werkwijzen vermijdt. Menselijk bloed terwijl de focus van dit werk was, moet worden opgemerkt dat deze werkwijze kan worden toegepast op dieren bloedmonsters. Deze workflow is zeer reproduceerbaar en kunnen kleine variaties, die bijzonder waardevol voor oefening studies waarbij het aantal deelnemers beperkt en seriële bloed maatregelen worden verworven detecteren. Zoals onderstreept in de representatieve resultaten Deze verbeterde werkwijze heeft het potentieel om te vechten en actuele kennis in de uitoefening immunologie,en andere gebieden die verband houden met NK immuno-surveillance.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , Garland Science. (2001).
