Abstract
NK-cell cytotoxicitet är en allmänt använt mått för att bestämma effekten av en yttre intervention på NK-cellfunktion. Emellertid kan exaktheten och reproducerbarheten av denna analys betraktas instabil, antingen på grund av användarens fel eller på grund av känsligheten hos NK-celler till experimentell manipulering. För att eliminera dessa problem, var ett arbetsflöde som reducerar dem till ett minimum etablerad och presenteras här. För att illustrera, erhöll vi blodprover, vid olika tidpunkter, från löpare (n = 4) som lämnades in till en intensiv våg av motion. Först NK-celler samtidigt identifieras och isoleras genom CD56 märkning och magnetisk baserad sortering, direkt från helblod och från så lite som en milliliter. De sorterade NK-celler avlägsnas av något reagens eller kapslings antikroppar. De kan räknas för att fastställa en exakt celltal NK per milliliter blod. För det andra kan de sorterade NK-celler (effekten celler eller e) blandas med 3,3-Diotadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO) märkta K562-celler (målceller eller T) vid en analys optimala 1: 5 T: E-tal, och analyseras med hjälp av en avbildande flödes cytometer som möjliggör visualisering av varje händelse och eliminering av falska positiva eller falskt negativa resultat (såsom dubbletter eller effektorceller). Detta arbetsflöde kan fyllas i cirka fyra timmar, och gör det möjligt att mycket stabila resultat även när man arbetar med prover från människa. När de är tillgängliga, kan forskargrupper testa flera experimentella insatser på människor, och jämföra mätningar över flera tidpunkter utan att kompromissa med datas integritet.
Introduction
Naturliga mördarceller är en viktig del av det medfödda immunförsvaret. Medan de är inte reglerat, de har förmågan att känna igen och eliminera abnorma celler genom cell-till-cell-kontakt och utan föregående aktivering 1. Som sådana utgör de en snabb försvarslinje mot infektioner. Motion, särskilt intensiv, har visat att övergående pressa immunsystemet 2, 3, 4, 5. NK-celler är speciellt benägna att denna effekt 4, 6, 7, i praktiken skapar ett fönster av förstärkt känslighet för sjukdomar. Därför, före, under eller efter intensiv träning med målet att minska sin påverkan på NK cellfunktion är studiet av insatser av särskilt intresse för välbefinnande idrottare post-tävlingar.
8, vid ca 1% av den vita blodkroppsutrymmet; 2) NK-celler är mycket känsliga för stress och förlita sig på konstant exponering för fysiologiska förhållanden för att förbli livskraftig och stabil under experiment; och 3) standardanalyser för att bestämma NK cell cytotoxicitet, såsom Ficoll-gradienter 9 och släppa analyser 10, är opålitliga och inkonsekventa. Den inneboende variationen i humana prover bara förvärrar dessa frågor. Färska humana prover som tagits under interventioner är tämligen reglerad och svåra att anskaffa, åtminstone i jämförelse med djurprover eller odödliggjorda cellinjer. Detta minskar möjligheterna att upprepa experiment eller lägga till deltagare i studien kohort att nå betydande statistiska trösklar. Tillsammans står dessa frågor stöder behovet av en strömlinjeformad protokoll som gör det möjligt for både hög genomströmning och en hög tillförlitlighetsanalys av NK-cell lytisk aktivitet i prover från människa.
Vi etablerade ett arbetsflöde som förkortar den tid som behövs för att identifiera, isolera och testa NK-celler från humant helblod samtidigt minimera exponeringen för yttre faktorer. Metoden optimerar användningen av två instrument, en magnetisk-baserad cellsorterare och en avbildnings flödescytometer, och en analys-specifika, optimerad T: E-förhållandet för att möjliggöra detektion av minskningar eller ökningar av NK-cell cytotoxicitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla förfaranden blodinsamlingsgenomfördes i enlighet med de riktlinjer som anges av Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB).
1. Helblod Collection
- Ha ett certifierat phlebotomist dra blod enligt Världshälsoorganisationens riktlinjer.
- Dra blod in i en 4 ml bloduppsamlingsrör innehållande Di-Kalium Etylendiamintetraättiksyra (K 2 EDTA). Vänd bloduppsamlingsröret enligt tillverkarens anvisningar. Hålla bloduppsamlingsröret vid rumstemperatur på en bänk-top rocker tills separation.
2. Framställning av DiO-märkta målceller
- Växa K562-celler i fullständigt Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) utökat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin streptomycin i flera veckor före analysen för att säkerställa hälsa av cellerna. Justera Koncentration av cellerna till 3 x 10 5 celler / ml dagligen genom fullbordandet av en cell räkna och efterföljande passage av celler. Utför en komplett media förändring var två till tre dagar.
- På dagen för analysen, utför en cellräkning med användning av en 1: 1 hemocytometer.
- Ta 10 mikroliter från K562 kolven och placera i 1,5 ml rör.
- Tillsätt 10 mikroliter av trypanblått färgämne in i samma 1,5 ml rör för en utspädningsfaktor på 1: 1.
- Knacka försiktigt röret för att blanda K562-celler och trypanblått.
- Tillåt K562 cell trypanblått färgämne inkubera under 1 min vid rumstemperatur.
- Ta 15 mikroliter av färgade K562-celler från röret.
- Pipett på hemocytometer för cellräkning.
- Räkna celler i de fyra hörnrutorna samt mitten kvadrat för totalt fem rutor.
- Beräkna cellräkning genom att använda ekvationen:
Totalt celler / ml = totala celler räknades X (spädningsfaktor / antal rutor) X 10.000 / ml
- För ofärgade K562 målceller, tillsätt 10 ml K562 målceller till en 15 ml rör vid en densitet av 1 x 10 6 celler / ml för totalt 10 x 10 6 K562 celler. Placera i en 37 ° C inkubator med 5% CO2 tills klar för användning.
- För DiO stained K562 målceller, tillsätt 10 ml K562 riktar celler till ett 15 ml rör vid en densitet av 1 x 10 6 celler / ml för totalt 10 x 10 6 K562-celler.
- Tillsätt 1 mikroliter av DiO cellmärkning lösning per ml cellsuspensionen i 15 ml rör utsetts för DiO färgning och försiktigt virvel. Till exempel lägga till 10 mikroliter av DiO cellmärkning lösning till 10 x 10 6 K562 celler / ml i en volym av 1 x 10 6 celler / ml.
- Inkubera K562-DiO lösning under 20 min vid 37 ° C med 5% CO2 i ett 15 ml rör.
- Följing inkubation, tillsätt 3 ml rumstemperatur fosfatbuffrad saltlösning (PBS) till K562-DiO lösning innehållande 15 ml rör.
- Centrifugera i 10 min vid 135 xg vid rumstemperatur.
- Försiktigt bort supernatanten utan att störa cellpelleten med en 1000 l volym justerbar pipett.
- Tillsätt 10 ml av färskt IMDM till cellpelleten innehållande 15 ml rör.
- Försiktigt Vortexrör att resuspendera cellerna.
- Upprepa steg 2,7 till 2,10 två gånger.
- Lagra celler i ett 37 ° C inkubator med 5% CO2 tills klar för användning.
OBS: Celler kan lagras i inkubator under upp till 24 h, men det är föredraget att använda dem på samma dag.
3. Framställning av kontroller
- Överför följande i separata och på lämpligt sätt märkta 1,5 ml rör:
- Tillsätt 500 mikroliter av färsk IMDM innehållande suspenderades DiO-märkta K562-celler i "Double Positive" märkt 1,5 ml rör.
- Tillsätt 500 mikroliter av färsk IMDM innehållande suspenderades DiO-märkta K562-celler i "DiO bara" märkt 1,5 ml rör.
- Tillsätt 500 mikroliter av färsk IMDM innehållande resuspenderade omärkta K562-celler i "propidiumjodid (PI) endast" märkt 1,5 ml rör.
- Placera det dubbla Positiv och PI endast rör i ett 55 ° C vattenbad i 5 min.
- Efter 5 minuter har förflutit, avlägsna rören och torka med 70% etanol.
- Lägga 10 L av PI till Double Positiv och PI endast 1,5 ml rör.
- Placera alla tre K562 målceller kontrollerna i inkubator vid 37 ° C under 30 min.
- Efter 30 min inkubation har förflutit, centrifug alla tre K562 målceller kontroller i 2 min vid 163 x g.
- Försiktigt bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Resuspendera varje kontroll med 20 mikroliter av färsk IMDM cellodlingsmedia, och lämna i 37 ° C inkubator med 5% CO2 under åtminstone30 min för optimal DiO-signal.
OBS: Kontrollerna är nu redo att köras genom avbildning flödescytometer.
4. NK Cell Automatiserad Separation
- Slå på cellseparator och låta startcykeln för att avsluta.
- Se till att alla vätskeflaskor belysningar är grönt och att avfallsflaskan är tom.
- Skaffa en rumstemperatur 15 ml rör rack.
OBS: Urvalet baseras på provvolymer. Till exempel, för en volym mindre än 3 ml använder en 15 ml provrörsställ och en volym mer än 3 ml använder en 50 ml rör rack. - Etikett provrör därefter (Upprepa per prov / deltagare): Deltagare 1 Hela blodprov; Deltagare 1 Negativ fraktion; Deltagare 1 Positiv fraktion.
- pipett försiktigt 1,5 ml helblod från steg 1,2 till "Whole blodprov" 15 ml rör.
- Placera lämpligt märkt 15 ml "Whole blodprov" rör från steg 4,5 och märkt 15 ml "Negativ Bråk" och"positiva fraktionen" rör från steg 4,4 i provrörsställ. Använd thefollowing provstället set-up: Row (R1) A: Hela Blodprov, Row (R2) B: Negativ, omärkt fraktion, Row (R4) C: Positiv, magnetiskt märkt fraktion.
- Sätt separatorn rack på MiniSampler för autolabeling.
- Välj "Reagent" i menyn och markera det läge där ampullen kommer att placeras i separatorn rack.
- Välj "Läs reagens" för att aktivera 2D-kodläsare.
- Placera en lämplig reagenskärlet framför 2D kodläsaren mellan 0,5-2,5 cm från kodläsare kåpan.
OBS: Till exempel är reagens för NK cellseparation CD56. - Håll reagensflaskan i en vinkel framför 2D kodläsare för optimal behandling.
- Placera reagensflaskan i rätt separator rack position.
- Markera de önskade positionerna under fliken Separation på skärmen.
- Från Märkning menyn, tilldela en autolabeling program.
- Tilldela cellseparationsreagens CD56 mikropärlor att rack positionerna 1, 2, 3, och 4.
- Välj "posselwb" separation program.
- Välj "spola" diskprogram.
- Sätt en provvolym på 1500 mikroliter i "Volym" undermeny med det numeriska tangentbordet.
- Välj "Enter" alternativ på knappsatsen.
- Välj "Run" för att starta cellseparation.
- Välj "OK" för att bekräfta att det finns tillräckligt buffert är tillgänglig för bearbetning av alla prover.
5. NK Cell Count Efter Cell Separation
- Omedelbart efter cellseparation med cellseparator, hämta den positiva fraktionen. Låt stå i rumstemperatur. Denna fraktion innehåller den önskade rena NK-cellpopulationen.
- För varje enskilt prov, utför en cellräkning med hjälp av en hemocytometer enligt steg 2,2.
- Efter beräkningar, spela celltal.
6. Cytotoxicitet Assay Provframställning
- Förbered och märka 1,5 ml rör för varje prov / deltagare i enlighet därmed.
- Pipett önskade förhållandet mellan NK-celler och DiO-labled K562-celler i varje rör.
OBS: Till exempel är det önskade förhållandet mellan K562 målceller och NK effektorceller 1: 5. - Centrifugera i 5 minuter vid 135 x g.
- Försiktigt bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Resuspendera NK-DiO-märkt K562 cellblandningen i 500 mikroliter av NK-cellmedia utan interleukin-2 (IL-2) och 2-merkaptoetanol (2-ME) (ofullständig NK-cellkulturmedia).
OBS: Den ofullständiga NK cellodlingsmedier är Minimum Essential Medium Eagle med natriumbikarbonat, utan L-glutamin, ribonukleosider och deoxiribonukleosider. - Tillsätt 5 | il av PI till varje rör.
- Centrifugera i 2 minuter vid 163 x g.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C under 2 h.
- Efter två timmars inkubation, centrifugeGE under 2 minuter vid 163 x g.
- Försiktigt bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Resuspendera cellerna i 25 mikroliter ofullständigt NK-cellkulturmedia.
7. Framställning av Spontan ( "S") Prov
- Pipettera 500 pl av DiO-märkta K562-celler (koncentration av 1 x 10 6 celler / ml) i 1,5 ml rör.
- Tillsätt 10 mikroliter av PI till varje rör.
- Centrifugrör under 2 minuter vid 163 x g.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C under 2 h.
- Efter 2 h inkubation, centrifugera i 2 min vid 163 x g.
- Försiktigt bort supernatanten utan att störa cellpelleten.
- Resuspendera cellerna i 25 | il ofullständig alfa-minimalt essentiellt medium (α-MEM) cellkulturmedia.
8. Data Acquisition med Imaging flödescytometer
- Tryck på den gröna knappen innanför ytterdörren av bild flödescytometer för att slå på instrumentet.
- Slå på all datorer i samband med bild flödescytometer.
- Starta avbildnings flödescytometer programvara.
- Klicka på "Start" -knappen för att spola systemet och förbereda provledningen.
- När "Startup" är klar stänger ut "Kalibrering" fönstret.
- Tilldela kanaler: på toppen vänster sida, klicka på varje kanal för att tilldela dem.
- På höger sida, klicka på punktdiagram för att skapa 4 scatterplots: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, rå Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, rå Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 och FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01.
- Börja analysera prover genom att först använda "dubbelpositiva" kontroll.
- Klicka på "Load".
- Placera 1,5 ml rör med "dubbla positiva" prov från steg 3,4 till 3,9 i provlastaren.
- Välj 40X objektiv under "Förstoring" -fliken.
- Slå på 405 mW och642 mW laser.
- Slå på "Bright" kanal.
- Klicka på "Välj intensitet."
- Baserat på "dubbelpositiva" kontrollprov, bestämma den önskade intensiteten för 405 mW laser så detektorn inte överbelastas.
Obs: Till exempel var den optimala intensiteten för detta experiment fastställdes till 11 mW.
- Efter den önskade set-up uppnås, förvärva data.
- Under fliken "File Acquisition", anger i en anpassad filnamn text. Välj en mapp för att spara datafilen (s).
- Ange antalet celler att förvärva bredvid "Samla". Vanligtvis antalet varierar mellan 1.000 till 10.000.
- Klicka på "Acquire".
OBS: När det önskade antalet celler förvärvas, är datafilen sparas automatiskt i den tidigare valda mappen.
- Efter förvärvet är klar, ladda nästa kontrollprovet - DiO endast kontroll.
- Klicka på "Load".
- Placera 1,5 ml rör med "DiO bara" provet i provlastaren.
- Låt 40X objektiv under "Förstoring" -fliken vald.
- Lämna 405 mW laser påslagen.
- Stäng av 642 mW laser och "Bright" kanal.
OBS: Nu när den önskade set-up har uppnåtts, kan data förvärvas. - Under "File Acquisition" -fliken, anger i en anpassad filnamn text och välj en mapp för att spara datafilen (s). Ange antalet celler att förvärva bredvid "Collect.". Typiskt detta antal är 1000.
- Klicka på "Acquire".
OBS: När det önskade antalet celler förvärvas datafilen sparas automatiskt i den tidigare valda mappen.
- Upprepa steg 8,10 för "PI bara" kontrollprov. De experimentella proverna är nu redo att tas ut.
- Hantera remaining experimentprover, inklusive den "spontana" S "Prov" enligt följande:
- Låt 40X objektiv under "Förstoring" -fliken vald.
- Slå på 405 mW och 642 mW laser.
- Slå på "Bright" kanal.
- Klicka på "Set Intensity."
- Under "File Acquisition" -fliken, anger i en anpassad filnamn text och välj en mapp för att spara datafilen (s). Ange i en anpassad filnamn text.
- Ange antalet celler att förvärva bredvid "Collect."
- Klicka på "Acquire" -knappen.
OBS: När det önskade antalet celler förvärvas datafilen sparas automatiskt i den tidigare valda mappen.
- Upprepa steg 8,12 för alla experimentella prover.
- Efter har samlat alla experimentella data och filer, klicka på "Stäng" -knappen för att sterilisera systemet.
9. Imaging flödescytometer Provanalys
- Öppna bild flödescytometer analys programvara.
- Under "File", öppna en experimentell .RIF fil.
- Bygga en ny matris med hjälp av enstaka färg .RIF filer (DIO-bara kontrollera och PI enbart kontroll, skapades under steg 8.10 och 8.11) genom att välja "Skapa en ny matris" under fliken Ersättning bild flödescytometern programvara.
OBS: Programvaran kommer att fråga för urvalet av de enskilda färgfiler och slå samman dem för att skapa en matris fil (.ctm filnamnstillägg), det vill väljas för att tillämpa kanalkompensation. - Skapa punktdiagram genom att använda "byggstenar" funktion av programvaran.
- Skapa en dot-plot (BrightFieldGradient_RMS vs frekvens) till gate fokuserade celler. Ring gate "Focus" (Figur 1A).
- Med hjälp av "Focus" gate, skapa ett punktdiagram av Bright Field Area vs ljusa fält Proportioner till g åt de singcellerna. Ring gate "Single" (Figur 1B).
- Med hjälp av "Single" gate, skapa ett punktdiagram av Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Använd denna kurva för att identifiera och gate DiO-positiva endast celler (mål, levande) och PI-DiO dubbel positiva celler (mål, döda) (Figur 1C).
OBS: Samtliga tomter som beskrivs i steg 9.4.1, 9.4.2 och 9.4.3 kan skapas genom att använda "byggstenar" funktion av programvaran.
- Klicka på statistikfunktion punktdiagrammet att få tillgång till cellantal för varje port.
- Beräkna den procentuella andelen döda mål i den spontana provet och experimentella prover med användning av följande formel:
% döda mål i provet = (#dead mål x 100) / (# levande måltavlor + #dead mål) - Beräkna cytotoxicitet med hjälp av följande formel:
% Cytotoxicitet = [(experimentell dött Spontan döda) / (100-Spontan döda)] x100
Figur 1: Representativa histogram, spridningsdiagram och bilder för cytotoxisk aktivitet analys. (A) fokuscellanalys. (B) enskild cell analys. (C) målcell färgningsanalys. Alla beslut fattas med hjälp av bild som hör till varje händelse. Detta kan nås i analysprogram genom att klicka på händelsen på grafer. (D) representativ bild av en dubb händelse, visar en apoptotiska NK-celler och en levande K562 mål. Ch01, Brightfield. CH02, DiO. CH05, PI. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bestämning av NK-celltalet
Effekten av tung trafik på NK-celltalet i helblod mättes, med användning av övningsprotokollet som beskrivs i fig 2. Blodprover togs före träning, strax efter träning, 1,5 h efter träning, och slutligen 24 och 48 h efter den initiala bloddragningen. Koncentrationen av NK-celler per milliliter helblod mättes för varje löpare (figur 3A) och i genomsnitt (figur 3B) för varje tidpunkt.
Våra resultat (figur 3A) visar att löpare 1, 2 och 4 förekommer ett liknande mönster med en liten ökning av NK celler efter träning, omedelbart följt av en kraftig minskning, innan sakta återvända till det normala efter 24 och 48 timmar. Denna trend var särskilt synliga genom att rita medelvärden NK-celler för den grupp av löpare, men ingen signifikant skillnad frånpre-motion nivåer upptäcktes. Runner 3 presenterade en mycket hög räkna från början, som minskade kraftigt efter träning och 1,5 timmar efter träning, innan sakta återvända till det normala efter 24 och 48 timmar. I genomsnitt, NK-celltalet (figur 3B) minskade 1,5 h efter träning (om än icke väsentligt) men var tillbaka till nära normala nivåer efter 24 timmar.
Bestämning av NK-cell cytotoxicitet
Efter beräkning celltal NK, var NK-celler omedelbart inrättas för att bestämma deras cytotoxiska aktivitet som beskrivs i avsnitt 6 i protokollet. Resultaten presenteras i figur 4A för varje enskild löpare, med figur 4B som visar den genomsnittliga NK cytotoxicitet. Våra resultat visar att genomsnittlig NK cytotoxicitet minskade något efter träning och 1,5 h efter träning (om än icke-signifikant), men ökade signifikant efter 24 h. NK cytotoxicitet fortsatt hög jämfört med före-Motion nivåer, om än icke-signifikant (delvis på grund av det låga antalet deltagare i detta pilotprojekt).
Figur 2: Motion protokoll. Bloddragningar (röda pilar) utfördes på n = 4 löpare.
Figur 3: NK-celler räknas före träning, efter träning, 1,5 h och 21 h efter träningen. (A) NK cell räkna per milliliter helblod för varje enskild löpare. (B) medel NK kroppar per milliliter helblod. N = 4; Skalstrecken = standardfel.
Figur 4:NK-celler cytotoxicitet före träning, efter träning, 1,5 h och 21 h efter träningen. (A) NK cellcytotoxicitet (uttryckt i procent av döda målceller) för varje enskild löpare. (B) genomsnittlig NK cellcytotoxicitet (uttryckt i procent av döda målceller). N = 4; Skalstrecken = standardfel; *: P <0,05; **: P <0,005.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den metod som beskrivs i denna studie mäter direkt den specifika aktiviteten hos en individs NK-celler som svar på stimuli (i detta fall, långvarig träning). Normalt är NK-celler isolerade från ett blod med användning av densitetsgradienter eller cellsortering genom att använda en kombination av markörer. Även om dessa metoder används allmänt, de har många nackdelar: de är tidskrävande, involverar multipla manipulationer, och är kraftigt användarberoende. Som ett resultat, är onödig stress placeras på de isolerade NK-celler, vilket kan resultera i ökad variabilitet från experiment till experiment, eller till och med inom samma experiment. I detta papper, beskrev vi ett protokoll som utnyttjar magnetisk baserad isolering. Detta möjliggör en snabb och tillförlitlig sortering av ett stort antal av NK-celler i en individs helblod, samtidigt minimera blod eller NK-cellmanipulering.
Denna metod är särskilt lämpad för humanstudier där prover är gles, menPå baksidan metoden blir ganska svårt när alltför mycket prover måste behandlas tillsammans. I själva verket måste fönstret i förvärv för cytotoxisk analys typiskt vara inom 30 minuter efter slutet av inkubationen, som enligt vår erfarenhet översätta till 5 prover i taget samtidigt. Om många prover ska behandlas, är det viktigt att upprätta en svindlande schema för att ge tillräcklig tid för flödescytometri förvärv. En annan nackdel med denna metod kan vara kostnaden för reagens som är ganska hög och kan konsumeras snabbt om mer mängd blod behandlas för högre NK avkastning. Vi tror dock att dessa kostnader uppvägs av den betydande mängd tid sparas.
De kritiska steg i detta protokoll är de som är mest öppna för ändringar. Det är kritiskt att bibehålla blodet vid rumstemperatur och att bearbeta inom en timme av ritningen att undvika NK cellstress. Efter isolering, är extremt kritisk för cellräkningresultat noggrannhet, så metoden att räkna bör vara konstant, till exempel för trypanblått analys ser till att flera rutor räknas på hemocytometer, och att användaren eller labbet använder samma identifieringsparametrar. Protokollet som presenteras här använder 1,5 ml av blod och prov NK-cell cytotoxicitet vid en T: E-förhållande av 1: 5, men dessa parametrar kan optimeras beroende av den önskade analysen och den tillgängliga mängden blod: om mindre blod är tillgängligt då det är möjligt att använda lägre förhållanden såsom 1: 4 eller till och med 1: 3 till fortfarande har rimlig insamlingstid. I vår erfarenhet lägre förhållanden kan vara otillräcklig för att möjliggöra en lämplig cytotoxisk aktivitet. På grund av provvariationen, händer det att antalet celler NK är mycket lägre än väntat; som svar, är det nödvändigt att sänka mängden av målceller i reaktionsrören för att bibehålla samma T: E-förhållande i hela ett experiment. Under resultatanalys, är det mest kritiska steget att tillbringa så mycket tid som behövs för atterhålla en god matris. Detta kan bara uppnås om stor försiktighet vidtas för att förbereda de kontroller som anges i steg 3 i protokollet. När portarna har etablerats som beskrivs i steg 9, kan filer doseras tillsammans och analyserades i serie med mycket lite variation. Om du är osäker, ska användaren alltid hänvisa till bildgalleriet genom att klicka på någon händelse ritas på ett diagram (sett i figur 1C), för att kontrollera att alla lämpliga händelser ingår i rätt gate.
De representativa resultat i figur 2A visade att 3 löpare av 4 presenteras ett liknande mönster. Mönstret av den 4: e löpare var förmodligen specifikt för den enskilde och inte utgör en felaktig åtgärd. NK-cellantal för denna person var vid den övre änden av det accepterade intervallet i humant helblod både före motion och 48 h efter träning. Detta visar en av styrkorna med den metod som beskrivs i detta dokument, där NK calnar noggrant kan erhållas. Dessutom, förmågan att erhålla nativa celler genom en enda märkningssteget möjliggör minimal stress och ändringar av NK-celler. Detta är särskilt kritisk när NK cellcytotoxicitet mäts under fysiologiska stressförhållanden.
Efter isolering, är NK-cellscytotoxicitet bestäms typiskt genom flödescytometri eller en assay radioaktiva utsläppet (krom-analys till exempel). Medan frisättningsanalyser anses vara en guldmyntfot, förlitar de sig på användning av radioaktiva isotoper och tillhörande utrustning, som är extremt dyra. Dessutom, regler för användning och bortskaffande av radioaktivt material lägga komplexitet till experiment som kräver tid effektivitet och precision. Användningen av en flödescytometri tillvägagångssätt vettigt men typiska försiktighetsåtgärder måste följas, inklusive laser inställningar och fluorokrom ersättning och grind. Detta gäller särskilt när 2 olika typer av celler är i sample, eftersom det är fallet för cytotoxiska analyser. Emellertid, i vårt fall användningen av en avbildnings flödescytometer tillåter en bild som skall infångas för varje händelse, och parameter storleksförhållandet tillåter separation av dubletter från enskilda celler. Detta är en kritisk punkt, eftersom den cytotoxiska analysen förlitar sig på fysisk kontakt mellan effektor och mål; mycket ofta dessa 2 typer av celler kommer fortfarande att vara tillsammans under flödesmätning, införa falska dubbla positiva till resultatet. Denna mycket punkt visas i figur 1D, som visar en dubblett som bildas av en (döende, PI positiva) NK-celler, och en (levande, DiO positiva, PI negativ) K562-celler. I traditionell flödescytometri, skulle denna händelse tillsättas till K562 celldödsräkning men är i själva verket ett falskt positivt. Ta bort data kan faktiskt vara problematiskt, men det är inte, om det görs konsekvent och använda mycket strikta parametrar från experiment till experiment (i detta fall "aspect ratio" parameter). I gengäld,de uppgifter som erhålls kommer att bli mycket mer stabil. Dessutom, visualisera alla händelser gör det möjligt att exakt grind (och räkna) för varje händelse på basis av parametrar, utan förlitar sig på styva grindar som traditionellt är etablerade med hjälp av kontroller och att inte ta hänsyn till den naturliga "data drift" som kan förekomma i flödescytometri. Den extra förmågan att avbilda varje enda mål händelse under förvärv, möjliggör en förbättrad grindning av en enda (DiO endast, som representerar de levande målceller) och dubbel-färgade populationen (DiO + PI färgade, som representerar de döda målceller).
Dessutom var arbetsflödet som presenteras här optimeras för att ta hänsyn till bristen på NK-celler i helblod och behovet av korrekta resultat. Medan traditionella NK cell cytotoxicitetsanalyser utforska den lytiska aktiviteten på flera T: E-tal, är det opraktiskt för ett par anledningar: 1) mängden tillgängliga NK-celler från helblod är begränsad och mycket variable och 2) mängden av målceller som behövs för analysen måste vara tillräckligt stor för att möjliggöra ganska snabbt förvärv av data. Flera tester vid olika förhållanden (ej visade här) visade att en 1: 5 T: E-tal, som översätter i 4 x 10 4 T / 2 x 10 5 E ger en optimal balans, och gör det möjligt för stora reproducerbarhet. Baserat på upprepade analyser med prover från olika individer (ej visade här), ger detta förhållande också en förväntad cytotoxiska aktiviteten hos 50-70% i normala prover, som erbjuder en betydande över och under fönstret för att mäta effekten av interventioner.
Celltal NK var liknande vad som konstaterats i andra arbeten 11, 12, 13, och i linje med den accepterade intervallet frekvensen av NK-celler på blod 14. Emellertid är fördelen med denna nya arbetsflödet visat i figur 3B, där vi upptäckered en signifikant ökning av NK cytotoxicitet efter 24 h jämfört med före träning nivåer, trots en NK celler som var i genomsnitt (om än icke signifikant) lägre vid samma tidpunkt. Detta resultat skiljer sig från andra publicerade studier där cytotoxiska nivåer var mestadels identisk (eller ännu lägre) till pre-workout nivåer. Det tyder på att i stället för att vara deprimerad under en lång tidsperiod eftertränings, kanske NK-cell cytotoxicitet att kunna "rebound" till ännu högre nivåer efter så lite som 21 timmar efter träning. Denna observation med hjälp av en ny metod med rena, friska NK-celler, om de bekräftas i uppföljande studier, har potential att ändra den nuvarande perspektiv som tung ansträngning är immunsuppressiva. När NK-celler erhålls med användning av Ficoll-gradienter eller flödescytometri-baserad sortering, är antingen blandat med andra celltyper den resulterande populationen, innehålla flera skadade NK-celler och / eller NK-celler med modifierad respons. Dessa konsekvenser är att vänta eventutrymDering längd, hårdhet och / eller vagheten i de förutnämnda metoderna. Ta bort dessa frågor, och vistas nära fysiologiska förhållanden hela tiden, kommer att leda till experimentella resultat mer representativa för NK-celler in vivo beteende.
För att sammanfatta, beskrev vi ett integrerat arbetsflöde som möjliggör en snabb, noggrann isolering och detektion av NK cytotoxicitet från små humana blodprov som undviker några av de begränsningar som är förknippade med andra metoder. Medan blod var i fokus för detta arbete, är det värt att notera att denna metod kan tillämpas på djur blodprov. Det här arbetsflödet är mycket reproducerbar och kan upptäcka små variationer, som är särskilt värdefull för motion studier där deltagare nummer är begränsade och serieåtgärder blod förvärvas. Som understryks i de representativa resultat, har denna förbättrade metod potential att utmana och förbättra nuvarande kunskaper i tränings immunologi,och andra områden relaterade till NK immunövervakning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
- Cerwenka, A., Lanier, L. L. Natural killer cells, viruses and cancer. Nat Rev Immunol. 1 (1), 41-49 (2001).
- Nieman, D. C. Exercise, infection, and immunity. Int J Sports Med. 15, Suppl 3 131-141 (1994).
- Romeo, J., Warnberg, J., Pozo, T., Marcos, A. Physical activity, immunity and infection. Proc Nutr Soc. 69 (3), 390-399 (2010).
- Nieman, D. C. Marathon training and immune function. Sports Med. 37 (4-5), 412-415 (2007).
- Simpson, R. J., Kunz, H., Agha, N., Graff, R. Exercise and the Regulation of Immune Functions. Prog Mol Biol Transl Sci. 135, 355-380 (2015).
- Walsh, N. P., et al. Position statement. Part one: Immune function and exercise. Exerc Immunol Rev. 17, 6-63 (2011).
- Timmons, B. W., Cieslak, T. Human natural killer cell subsets and acute exercise: a brief review. Exerc Immunol Rev. 14, 8-23 (2008).
- Westermann, J., Pabst, R. Distribution of lymphocyte subsets and natural killer cells in the human body. Clin Investig. 70 (7), 539-544 (1992).
- Boyum, A. Isolation of leucocytes from human blood. Further observations. Methylcellulose, dextran, and ficoll as erythrocyteaggregating agents. Scand J Clin Lab Invest Suppl. 97, 31-50 (1968).
- McMillan, R., Scott, J. L. Leukocyte labeling with 51-Chromium. I. Technic and results in normal subjects. Blood. 32 (5), 738-754 (1968).
- Berk, L. S., et al. The effect of long endurance running on natural killer cells in marathoners. Med Sci Sports Exerc. 22 (2), 207-212 (1990).
- McAnulty, L. S., et al. Effect of blueberry ingestion on natural killer cell counts, oxidative stress, and inflammation prior to and after 2.5 h of running. Appl Physiol Nutr Metab. 36 (6), 976-984 (2011).
- Millard, A. L., et al. Brief Exercise Increases Peripheral Blood NK Cell Counts without Immediate Functional Changes, but Impairs their Responses to ex vivo Stimulation. Front Immunol. 4, 125 (2013).
- Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. 5th edn. , Garland Science. (2001).
