Abstract
एन.के. सेल cytotoxicity एक व्यापक रूप से इस्तेमाल के उपाय एन.के. सेल समारोह पर बाहर के हस्तक्षेप के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए है। हालांकि, सटीकता और इस परख के reproducibility या तो उपयोगकर्ता की त्रुटियों की वजह से या प्रयोगात्मक हेरफेर करने के लिए एन.के. कोशिकाओं की संवेदनशीलता की वजह से अस्थिर माना जा सकता है। इन मुद्दों को खत्म करने के लिए, एक कार्यप्रवाह है कि उन्हें एक न्यूनतम करने के लिए कम कर देता है स्थापित किया गया था और यहाँ प्रस्तुत किया है। उदाहरण देकर स्पष्ट करने के लिए, हम रक्त के नमूने प्राप्त धावकों से विभिन्न बिंदुओं पर समय, (एन = 4) कि व्यायाम के लिए एक गहन मुक्केबाज़ी को प्रस्तुत किया गया। सबसे पहले, एन.के. कोशिकाओं को एक साथ पहचान की है और CD56 टैगिंग और चुंबकीय आधारित छँटाई के माध्यम से अलग-थलग, पूरे रक्त से सीधे और के रूप में छोटे रूप में एक मिली लीटर से हैं। हल किया एन.के. कोशिकाओं किसी भी अभिकर्मक या कैपिंग एंटीबॉडी के हटा रहे हैं। वे क्रम में खून की मिली लीटर प्रति एक सटीक एन.के. कोशिकाओं की संख्या की स्थापना के लिए गिना जा सकता है। दूसरी बात, हल एन.के. कोशिकाओं (प्रभावोत्पादक कोशिकाओं या ई) 3,3'-Diotade के साथ मिलाया जा सकता हैcyloxacarbocyanine Perchlorate (Dio) टैग किए गए K562 कोशिकाओं (लक्ष्य कोशिकाओं या टी) एक परख-इष्टतम 1: 5 टी: ई अनुपात, और विश्लेषण एक इमेजिंग प्रवाह कोशिकामापी कि प्रत्येक घटना के दृश्य और किसी भी झूठी सकारात्मक के उन्मूलन के लिए अनुमति देता का उपयोग या (जैसे दोहरी या प्रेरक कोशिकाओं के रूप में) झूठी नकारात्मक। इस कार्यप्रवाह में के बारे में 4 घंटे के लिए पूरा किया जा सकता है, और बहुत स्थिर परिणाम भी जब मानव नमूनों के साथ काम करने के लिए अनुमति देता है। जब उपलब्ध हो, शोध टीमों मानव विषयों में कई प्रयोगात्मक हस्तक्षेप का परीक्षण, और डेटा की अखंडता समझौता किए बिना कई बार अंक के पार माप की तुलना कर सकते हैं।
Introduction
प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं सहज प्रतिरक्षा प्रणाली का एक अनिवार्य तत्व हैं। जबकि वे बहुत ही नियंत्रित किया जाता है, वे क्षमता को पहचाना और सेल करने वाली सेल संपर्क के माध्यम से और पूर्व सक्रियण 1 बिना असामान्य कोशिकाओं को खत्म करने की है। जैसे, वे संक्रमण के खिलाफ रक्षा की एक त्वरित लाइन फार्म। व्यायाम, विशेष रूप से तीव्र, क्षणिक प्रतिरक्षा प्रणाली 2, 3, 4, 5 दबाना दिखाया गया है। एन.के. कोशिकाओं को विशेष रूप से इस आशय 4, 6, 7 से ग्रस्त हैं, प्रभावी रूप से बीमारी के लिए बढ़ाया संवेदनशीलता की एक खिड़की बनाने। इसलिए, हस्तक्षेप के अध्ययन से पहले, के दौरान या एन.के. सेल समारोह पर इसके प्रभाव को कम करने के लक्ष्य के साथ गहन अभ्यास के बाद एथलीटों के बाद प्रतियोगिताओं के कल्याण के लिए विशेष ब्याज की है।
8, सफेद रक्त कोशिका डिब्बे के बारे में 1% से कम कर रहे हैं; 2) एन.के. कोशिकाओं तनाव के लिए बहुत संवेदनशील होते हैं और शारीरिक शर्तों के लिए लगातार जोखिम पर भरोसा प्रयोग के दौरान व्यवहार्य और स्थिर रहने के लिए; और 3) मानक assays ऐसे Ficoll ढ़ाल के रूप में 9 एन.के. सेल cytotoxicity का निर्धारण, और रिलीज assays 10, अविश्वसनीय और असंगत हैं। मानव नमूनों के निहित परिवर्तनशीलता ही इन मुद्दों को यौगिक। ताजा मानव हस्तक्षेप के दौरान एकत्र नमूनों, काफी विनियमित और मुश्किल खरीद करने के लिए कम से कम जब जानवर नमूने या अमर सेल लाइनों की तुलना में। यह प्रयोगों को दोहराना या अध्ययन पलटन के लिए प्रतिभागियों को जोड़ने में महत्वपूर्ण सांख्यिकीय थ्रेसहोल्ड तक पहुंचने के लिए करने के लिए अवसर कम कर देता है। सामूहिक रूप से, इन मुद्दों को एक सुव्यवस्थित प्रोटोकॉल कि के लिए अनुमति देता है के लिए जरूरत का समर्थनआर दोनों उच्च throughput और मानव नमूनों में एन.के. सेल अपघट्य गतिविधि के एक उच्च विश्वसनीयता विश्लेषण।
हम एक कार्यप्रवाह है कि समय की पहचान मानव पूरे रक्त से अलग और परीक्षण एन.के. कोशिकाओं जबकि बाहरी कारकों के जोखिम को कम करने के लिए आवश्यक shortens की स्थापना की। कम हो जाती है या एन.के. सेल cytotoxicity की बढ़ जाती है का पता लगाने के लिए अनुमति देने के लिए ई अनुपात: विधि दो उपकरणों, एक चुंबकीय आधारित सेल सॉर्टर और एक इमेजिंग प्रवाह कोशिकामापी, और एक परख-विशिष्ट, अनुकूलित टी के उपयोग का अनुकूलन।
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Protocol
नोट: सभी रक्त संग्रह की प्रक्रिया के दिशा-निर्देशों Appalachian राज्य विश्वविद्यालय (ASU) संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) द्वारा उल्लिखित के अनुसार आयोजित किया गया।
1. पूरे रक्त संग्रह
- एक प्रमाणित phlebotomist विश्व स्वास्थ्य संगठन के दिशा निर्देशों के अनुसार रक्त आकर्षित किया है।
- एक 4 मिलीलीटर रक्त संग्रह Di पोटेशियम ethylenediaminetetraacetic एसिड युक्त ट्यूब (कश्मीर 2 EDTA) में रक्त ड्रा। निर्माता के निर्देशों के अनुसार उलटें रक्त संग्रह ट्यूब। जुदाई जब तक एक बेंच शीर्ष घुमाव पर कमरे के तापमान पर रक्त संग्रह ट्यूब रखें।
2. डियो-लेबल लक्ष्य कोशिकाओं की तैयारी
- में K562 कोशिकाओं को विकसित पूरा Iscove संशोधित Dulbecco बार मीडिया (IMDM) परख करने से पहले कोशिकाओं के स्वास्थ्य को सुनिश्चित करने के लिए कई हफ्तों के लिए 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1% पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक। concentrat समायोजित करें3 एक्स 10 5 कोशिकाओं के लिए कोशिकाओं की आयन / एमएल दैनिक एक सेल के माध्यम से पूरा भरोसा है और कोशिकाओं के बाद पारित होने के। हर 2 से 3 दिनों के लिए एक पूरा मीडिया परिवर्तन प्रदर्शन करना।
- 1 hemocytometer: परख के दिन, एक 1 का उपयोग कर एक कोशिका गिनती प्रदर्शन करते हैं।
- K562 कुप्पी से 10 μL निकालें और 1.5 एमएल ट्यूब में जगह है।
- trypan नीले रंग की डाई के 10 μL 1 के एक कमजोर पड़ने कारक के लिए एक ही 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें: 1।
- धीरे झटका ट्यूब K562 कोशिकाओं मिश्रण और नीले रंग की डाई trypan करने के लिए।
- K562 सेल trypan नीले रंग की डाई कमरे के तापमान पर 1 मिनट के लिए सेते दें।
- ट्यूब से सना हुआ K562 कोशिकाओं के 15 μL निकालें।
- सेल गिनती के लिए hemocytometer पर पिपेट।
- चार कोने वर्गों में कोशिकाओं के रूप में अच्छी तरह के रूप में पांच चौकों की कुल के लिए मध्यम वर्ग की गणना करें।
- समीकरण का उपयोग करके कोशिकाओं की संख्या की गणना:
कुल कोशिकाओं / एमएल = कुल कोशिकाओं की गिनती एक्स (कमजोर पड़ने कारक / चौकों की संख्या) एक्स 10,000 / एमएल
- बेदाग K562 लक्ष्य कोशिकाओं के लिए, 10 x 10 6 K562 कोशिकाओं की कुल के लिए 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब को K562 लक्ष्य कोशिकाओं के 10 एमएल जोड़ें। 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इस्तेमाल के लिए तैयार है जब तक में रखें।
- डियो दाग K562 लक्ष्य कोशिकाओं के लिए, 10 x 10 6 K562 कोशिकाओं की कुल के लिए 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल के घनत्व पर 10 एमएल जोड़ने के K562 एक 15 एमएल ट्यूब कोशिकाओं लक्ष्य।
- सेल निलंबन के एमएल प्रति 1 डियो की μL सेल लेबलिंग समाधान डियो धुंधला और धीरे भंवर के लिए नामित 15 मिलीलीटर ट्यूब में जोड़ें। उदाहरण के लिए, 1 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की मात्रा में 10 x 10 6 K562 कोशिकाओं / एमएल डियो सेल लेबलिंग समाधान के 10 μL जोड़ें।
- सेते K562-डियो एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए समाधान।
- का पालन करेंआईएनजी ऊष्मायन, 15 मिलीलीटर ट्यूब युक्त K562-डियो समाधान के लिए कमरे के तापमान फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 3 मिलीलीटर जोड़ें।
- कमरे के तापमान पर 135 XG पर 10 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- ध्यान से एक 1,000 μl मात्रा समायोज्य पिपेट के साथ सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
- ताजा IMDM के 10 एमएल सेल गोली युक्त 15 मिलीलीटर ट्यूब को जोड़ें।
- धीरे भंवर ट्यूब कोशिकाओं resuspend।
- दोहराएँ 2.7 2.10 के लिए दो से अधिक बार कदम।
- 5% सीओ 2 के साथ एक 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में इस्तेमाल के लिए तैयार है जब तक में स्टोर कोशिकाओं।
नोट: प्रकोष्ठों अप करने के लिए 24 घंटे के लिए इनक्यूबेटर में रखा जा सकता है लेकिन यह एक ही दिन पर उन का उपयोग करने के लिए बेहतर है।
3. नियंत्रण की तैयारी
- अलग और उचित लेबल 1.5 मिलीलीटर ट्यूबों में निम्नलिखित स्थानांतरण:
- जोड़ें ताजा IMDM के 500 μL resuspended युक्त "डबल सकारात्मक" लेबल 1.5 एमएल ट्यूब में डियो लेबल K562 कोशिकाओं।
- ताजा IMDM के 500 μL जोड़े "केवल डियो" में resuspended डियो लेबल K562 कोशिकाओं से युक्त लेबल 1.5 एमएल ट्यूब।
- ताजा में resuspended लेबल हटाया गया K562 कोशिकाओं से युक्त IMDM के 500 μL जोड़े "Propidium आयोडाइड (पीआई) केवल" लेबल 1.5 एमएल ट्यूब।
- डबल सकारात्मक और पीआई केवल ट्यूबों के 5 मिनट के लिए एक 55 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में रखें।
- बाद 5 मिनट बीत गया है, ट्यूब को हटाने और 70% इथेनॉल के साथ नीचे पोंछ।
- डबल सकारात्मक करने के लिए पीआई और पीआई केवल 1.5 एमएल ट्यूबों के 10 एल जोड़ें।
- 30 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में सभी तीन K562 लक्ष्य सेल नियंत्रण रखें।
- के बाद 30 मिनट ऊष्मायन पर 163 x जी 2 मिनट के लिए बीत गया है, सेंट्रीफ्यूज सभी तीन K562 लक्ष्य सेल नियंत्रित करता है।
- ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
- ताजा IMDM सेल संस्कृति मीडिया के 20 μL के साथ प्रत्येक नियंत्रण Resuspend, और कम से कम के लिए 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में छोड़इष्टतम डियो संकेत के लिए 30 मिनट।
नोट: नियंत्रण अब इमेजिंग के माध्यम से प्रवाह कोशिकामापी चलाने के लिए तैयार हैं।
4. एन.के. सेल स्वचालित पृथक्करण
- सेल सेपरेटर पर मुड़ें और स्टार्ट-अप चक्र खत्म करने के लिए अनुमति देते हैं।
- सुनिश्चित करें कि सभी तरल पदार्थ की बोतलें illuminations हरे और कहा कि बेकार की बोतल खाली है।
- एक कमरे के तापमान 15 एमएल ट्यूब रैक प्राप्त करते हैं।
नोट: चयन नमूना संस्करणों पर आधारित है। उदाहरण के लिए, एक मात्रा के लिए कम से कम 3 मिलीलीटर एक 15 मिलीलीटर ट्यूब रैक का उपयोग करें और एक मात्रा के लिए अधिक से अधिक 3 एमएल 50 एमएल ट्यूब रैक का उपयोग करें। - लेबल नमूना ट्यूबों के हिसाब से (नमूना / भागीदार प्रति दोहराएँ): प्रतिभागी 1 पूरे रक्त के नमूने; प्रतिभागी 1 नकारात्मक अंश; प्रतिभागी 1 सकारात्मक अंश।
- धीरे "पूरे रक्त के नमूने" 15 मिलीलीटर ट्यूब में 1.2 चरण से पूरे रक्त के 1.5 एमएल पिपेट।
- 4.5 कदम से उचित लेबल 15 एमएल "पूरे रक्त के नमूने" ट्यूब प्लेस और 15 एमएल "नकारात्मक अंश" लेबल औरट्यूब रैक में कदम 4.4 से "सकारात्मक अंश" ट्यूबों। पंक्ति (आर 1) एक:: thefollowing नमूना रैक सेट-अप का उपयोग पूरे रक्त के नमूने, पंक्ति (R2) बी: नकारात्मक, लेबल हटाया गया अंश, पंक्ति (R4) सी: सकारात्मक, चुंबकीय लेबल अंश।
- autolabeling के लिए विभाजक रैक MiniSampler पर डालें।
- मेनू पर "अभिकर्मक" का चयन करें और स्थिति जहां शीशी विभाजक रैक में रखा जाएगा पर प्रकाश डाला।
- चयन 2 डी कोड रीडर सक्रिय करने के लिए "पढ़ें अभिकर्मक"।
- कोड रीडर कवर से 0.5-2.5 सेमी के बीच 2 डी कोड पाठक के सामने उचित अभिकर्मक शीशी रखें।
नोट: उदाहरण के लिए, एन.के. सेल जुदाई के लिए आवश्यक अभिकर्मक CD56 है। - इष्टतम पढ़ने के लिए 2 डी कोड पाठक के सामने एक कोण पर अभिकर्मक शीशी पकड़ो।
- अभिकर्मक शीशी उचित विभाजक रैक स्थिति में रखें।
- स्क्रीन पर पृथक्करण टैब के तहत वांछित पदों पर प्रकाश डाला।
- लेबल सबमेनू से, एक Au आवंटितtolabeling कार्यक्रम।
- सेल जुदाई अभिकर्मक CD56 microbeads के निरुपित पदों 1, 2, 3, और 4 रैक के लिए।
- "Posselwb" जुदाई प्रोग्राम का चयन करें।
- "कुल्ला" धोने प्रोग्राम का चयन करें।
- एक नमूना न्यूमेरिक कीपैड का उपयोग "वॉल्यूम" मेन्यू में 1,500 μL की मात्रा डालें।
- "Enter" कीपैड पर विकल्प का चयन करें।
- सेल जुदाई शुरू करने के लिए "भागो" का चयन करें।
- इस बात की पुष्टि करने के लिए कि पर्याप्त बफर सभी नमूनों के प्रसंस्करण के लिए उपलब्ध है "ठीक है" का चयन करें।
5. एनके कोशिका गिनती के बाद सेल जुदाई
- इसके तत्काल बाद सेल सेपरेटर के साथ सेल जुदाई के बाद, सकारात्मक अंश निकालते हैं। कमरे के तापमान पर छोड़ दें। यह अंश वांछित शुद्ध एन.के. सेल की आबादी शामिल है।
- प्रत्येक व्यक्ति के नमूने लिए, प्रति 2.2 चरण के रूप में एक hemocytometer का उपयोग एक कोशिका गिनती प्रदर्शन करते हैं।
- गणना के बाद, कोशिकाओं की संख्या रिकॉर्ड है।
6. cytotoxicity परख नमूना तैयार
- तैयार है और उसके अनुसार प्रत्येक नमूना / भागीदार के लिए लेबल 1.5 एमएल ट्यूबों।
- पिपेट प्रत्येक ट्यूब में वांछित एन.के. कोशिकाओं और डियो-चिट्ठा K562 कोशिकाओं का अनुपात।
नोट: उदाहरण के लिए, K562 लक्ष्य कोशिकाओं और एन.के. प्रेरक कोशिकाओं के वांछित अनुपात 1: 5। - 135 x जी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
- Resuspend एन.के.-डियो इंटरल्यूकिन -2 (IL-2) और 2-मर्केप्टोइथेनाल (2-इ) (अधूरा एन.के. सेल संस्कृति मीडिया) के बिना एन.के. सेल मीडिया के 500 μL में K562 सेल मिश्रण लेबल।
नोट: अधूरा एन.के. सेल संस्कृति मीडिया सोडियम बाइकार्बोनेट के साथ न्यूनतम आवश्यक मध्यम ईगल है, एल glutamine, ribonucleosides और deoxyribonucleosides के बिना। - पीआई के 5 μL प्रत्येक ट्यूब में जोड़े।
- पर 163 x जी 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र।
- 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
- 2 घंटे ऊष्मायन के बाद, Centrifuपर 163 x जी 2 मिनट के लिए जीई।
- ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
- 25 μL अधूरा एन.के. सेल संस्कृति मीडिया में Resuspend कोशिकाओं।
7. स्वतःस्फूर्त की तैयारी ( "एस") नमूना
- डियो लेबल K562 कोशिकाओं की पिपेट 500 μl 1.5 एमएल ट्यूब में (1 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता)।
- पीआई के 10 μL प्रत्येक ट्यूब में जोड़े।
- पर 163 x जी 2 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र ट्यूब।
- 2 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को सेते हैं।
- 2 घंटे ऊष्मायन, पर 163 x जी 2 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज के बाद।
- ध्यान से सेल गोली परेशान बिना सतह पर तैरनेवाला हटा दें।
- 25 μl अधूरा अल्फा न्यूनतम आवश्यक मध्यम (α-सदस्य) सेल संस्कृति मीडिया में Resuspend कोशिकाओं।
8. इमेजिंग प्रवाह cytometer के साथ डाटा अधिग्रहण
- कोशिकामापी प्रवाह साधन को चालू करने की इमेजिंग के सामने के दरवाजे के अंदर हरे बटन दबाएँ।
- अल चालू करेंएल इमेजिंग के साथ जुड़े कंप्यूटरों कोशिकामापी प्रवाह।
- सॉफ्टवेयर कोशिकामापी इमेजिंग प्रवाह लॉन्च।
- सिस्टम फ्लश और नमूना रेखा तैयार करने के लिए "स्टार्टअप" बटन पर क्लिक करें।
- एक बार "स्टार्टअप" पूरा हो गया है, "Calibrations" खिड़की से बाहर बंद कर दें।
- चैनल नियत: शीर्ष बाएं हाथ की ओर, आदेश में उन्हें आवंटित करने के लिए प्रत्येक चैनल पर क्लिक करें।
- कच्चे मैक्स पिक्सेल _MC_6 बनाम Area_M06, कच्चे मैक्स पिक्सेल _MC_2 बनाम Area_M02, कच्चे मैक्स पिक्सेल _MC_5 बनाम Area_M05 और FieldArea_M01 बनाम AspectRatio_M01: दाहिने हाथ की तरफ, 4 scatterplots बनाने के लिए तितर बितर साजिश बटन पर क्लिक करें।
- पहले "डबल सकारात्मक" नियंत्रण का उपयोग करके नमूनों का विश्लेषण शुरू करो।
- पर क्लिक करें "लोड।"
- "डबल सकारात्मक" चरण में 3.4 से 3.9 के लिए नमूना लोडर में नमूने के साथ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब रखें।
- "बढ़ाई" टैब के अंतर्गत 40x उद्देश्य का चयन करें।
- 405 मेगावाट पर मुड़ें और642 मेगावाट लेज़रों।
- "Brightfield" चैनल पर मुड़ें।
- पर क्लिक करें "तीव्रता का चयन करें।"
- "डबल सकारात्मक" नियंत्रण नमूने के आधार पर, 405 मेगावाट लेजर के लिए वांछित तीव्रता का निर्धारण इसलिए डिटेक्टर अतिभारित नहीं है।
नोट: उदाहरण के लिए, इस प्रयोग के लिए इष्टतम तीव्रता 11 मेगावाट पर स्थापित किया गया था।
- बाद वांछित सेट-अप हासिल की है, डेटा प्राप्त।
- "फ़ाइल अधिग्रहण" टैब के अंतर्गत, एक कस्टम फ़ाइल नाम पाठ में दर्ज करें। डेटा फ़ाइल (ओं) को बचाने के लिए एक फ़ोल्डर का चयन करें।
- "लीजिए" के बगल में प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की संख्या दर्ज करें। आमतौर पर इस संख्या को 10,000 से 1,000 के बीच होती है।
- पर क्लिक करें "मोल।"
नोट: एक बार कोशिकाओं की वांछित संख्या प्राप्त कर लिया है, डेटा फ़ाइल स्वचालित रूप से पहले से चयनित फ़ोल्डर में सहेजा गया है।
- डियो केवल नियंत्रण - अधिग्रहण के समाप्त होने के बाद, लोड अगले नियंत्रण नमूना।
- पर क्लिक करें "लोड।"
- नमूना लोडर में "डियो केवल" नमूने के साथ 1.5 एमएल ट्यूब रखें।
- चयनित "बढ़ाई" टैब के अंतर्गत 40x उद्देश्य छोड़ दें।
- छोड़ दो 405 मेगावाट लेजर पर दिया।
- 642 मेगावाट लेजर और "Brightfield" चैनल बंद करें।
नोट: अब जब कि वांछित सेट-अप हासिल किया गया है, डेटा प्राप्त किया जा सकता है। - "फ़ाइल अधिग्रहण" टैब के अंतर्गत, एक कस्टम फ़ाइल नाम पाठ में दर्ज करें और डेटा फ़ाइल (ओं) को बचाने के लिए एक फ़ोल्डर का चयन करें। के बगल में प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की संख्या दर्ज करें "लीजिए।"। आमतौर पर यह संख्या 1,000 है।
- पर क्लिक करें "मोल।"
नोट: एक बार कोशिकाओं की वांछित संख्या अधिग्रहण कर लिया है डेटा फ़ाइल स्वचालित रूप से पहले से चयनित फ़ोल्डर में सहेजा गया है।
- "पीआई केवल" नियंत्रण नमूना के लिए दोहराएँ चरण 8.10। प्रयोगात्मक नमूने अब एकत्र होने के लिए तैयार हैं।
- remaini हैंडलप्रयोगात्मक नमूने एनजी, "उठना, 'एस' नमूने" के रूप में शामिल है:
- चयनित "बढ़ाई" टैब के अंतर्गत 40x उद्देश्य छोड़ दें।
- पर 405 मेगावाट और 642 मेगावाट लेज़रों मुड़ें।
- "Brightfield" चैनल पर बारी।
- पर क्लिक करें "तीव्रता सेट करें।"
- "फ़ाइल अधिग्रहण" टैब के अंतर्गत, एक कस्टम फ़ाइल नाम पाठ में दर्ज करें और डेटा फ़ाइल (ओं) को बचाने के लिए एक फ़ोल्डर का चयन करें। एक कस्टम फ़ाइल नाम पाठ में दर्ज करें।
- के बगल में प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं की संख्या दर्ज करें "लीजिए।"
- "अधिग्रहण" बटन पर क्लिक करें।
नोट: एक बार कोशिकाओं की वांछित संख्या अधिग्रहण कर लिया है डेटा फ़ाइल स्वचालित रूप से पहले से चयनित फ़ोल्डर में सहेजा गया है।
- सभी प्रयोगात्मक नमूने के लिए कदम दोहराएँ 8.12।
- सभी प्रयोगात्मक डेटा और फ़ाइलों को एकत्र किया गया है के बाद, सिस्टम बाँझ "शट डाउन" बटन पर क्लिक करें।
9. कल्पना कीजिएजी प्रवाह cytometer नमूना विश्लेषण
- विश्लेषण सॉफ्टवेयर आवेदन कोशिकामापी इमेजिंग प्रवाह खोलें।
- "फाइल" के तहत, एक प्रयोगात्मक .RIF फ़ाइल खोलें।
- एक नए मैट्रिक्स का चयन करके ही रंग .RIF फ़ाइलें (डियो केवल नियंत्रित करने और पीआई केवल नियंत्रण, कदम 8.10 और 8.11 के दौरान बनाया) का उपयोग कर बनाने इमेजिंग सॉफ्टवेयर प्रवाह कोशिकामापी में मुआवजा टैब के तहत 'एक नए मैट्रिक्स बनाएँ "।
नोट: सॉफ्टवेयर एकल रंग फ़ाइलों के चयन के लिए संकेत है और एक मैट्रिक्स फ़ाइल (.ctm फाइल एक्सटेंशन) बनाने के लिए उन्हें विलय होगा, कि चैनल मुआवजा लागू करने के लिए चयन किया जाना है। - सॉफ्टवेयर की "इमारत ब्लॉकों" समारोह का उपयोग करके डॉट भूखंडों बनाएँ।
- एक डॉट साजिश फाटक के पास (BrightFieldGradient_RMS आवृत्ति बनाम) ध्यान केंद्रित कोशिकाओं बनाएँ। गेट "फोकस" (चित्रा 1 ए) कहते हैं।
- "फोकस" गेट का प्रयोग, उज्ज्वल क्षेत्र क्षेत्र की एक डॉट साजिश बनाम जी के लिए उज्ज्वल क्षेत्र पहलू अनुपात बनाने स्वेटर कोशिकाओं खा लिया। कॉल गेट "एकल" (चित्रा 1 बी)।
- "एकल" गेट का प्रयोग, बनाम Intensity_MC_Ch5 Intensity_MC_Ch02 की एक डॉट साजिश बनाने के लिए। की पहचान करने और गेट डियो पॉजिटिव केवल कोशिकाओं (लक्ष्य, जिंदा) और पीआई-डियो डबल सकारात्मक कोशिकाओं (लक्ष्य, मृत) (चित्रा 1 सी) के लिए इस साजिश का प्रयोग करें।
नोट: सभी भूखंडों कदम 9.4.1, 9.4.2 में वर्णित है, और 9.4.3 सॉफ्टवेयर के "इमारत ब्लॉकों" समारोह का उपयोग करके बनाया जा सकता है।
- प्रत्येक गेट के सेल नंबर का उपयोग करने के लिए डॉट साजिश के आंकड़े समारोह पर क्लिक करें।
- सहज नमूने में मृत लक्ष्य और प्रयोगात्मक नमूने निम्न सूत्र का उपयोग के प्रतिशत की गणना:
नमूने में% मृत लक्ष्यों = (#dead लक्ष्यों x 100) / (# रहते लक्ष्य + #dead लक्ष्य) - निम्न सूत्र का उपयोग cytotoxicity की गणना:
% Cytotoxicity = [(प्रायोगिक मृत उठना मृत) / (100-सहज मृत)] X100
चित्रा 1: प्रतिनिधि histograms, तितर बितर भूखंडों और साइटोटोक्सिक गतिविधि के विश्लेषण के लिए छवियों। (ए) फोकस सेल विश्लेषण। (बी) एकल कोशिका विश्लेषण। (सी) लक्ष्य सेल धुंधला विश्लेषण। सभी निर्धारण छवि प्रत्येक घटना से जुड़ी उपयोग किया जाता है। यह बस रेखांकन पर घटना पर क्लिक करके विश्लेषण सॉफ्टवेयर में पहुँचा जा सकता है। (डी) एक नक़ल घटना के प्रतिनिधि छवि, एक apoptotic एन.के. सेल और एक जीवित K562 लक्ष्य दिखा। Ch01, brightfield। CH02, डियो। Ch05, पीआई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Representative Results
एन.के. कोशिकाओं की संख्या का निर्धारण
पूरे रक्त में एन.के. सेल गिनती पर भारी चलाने का प्रभाव मापा गया था, चित्रा 2 में वर्णित व्यायाम प्रोटोकॉल का उपयोग। रक्त के नमूने, 24 और 48 घंटे प्रारंभिक रक्त ड्रॉ के बाद व्यायाम से पहले तैयार किया गया तुरंत बाद व्यायाम, व्यायाम के बाद 1.5 घंटे, और अंत में। पूरे रक्त की मिली लीटर प्रति एन.के. कोशिकाओं की एकाग्रता प्रत्येक धावक (चित्रा 3) के लिए और औसत (चित्रा 3 बी) पर हर समय बिंदु के लिए मापा गया था।
हमारे परिणाम (चित्रा 3 ए) बताते हैं कि 1 धावक, 2, और 4 उपस्थित व्यायाम के बाद एन.के. सेल गिनती के एक मामूली वृद्धि हुई है, तुरंत, एक तेज कमी के बाद से पहले धीरे धीरे के बाद 24 और 48 घंटे सामान्य करने के लिए लौटने के साथ एक समान पैटर्न। इस प्रवृत्ति को विशेष रूप से धावकों के समूह के लिए एन.के. सेल औसत साजिश रचने के द्वारा दिखाई, लेकिन कोई महत्वपूर्ण अंतर थापूर्व व्यायाम स्तरों का पता चला था। धावक 3 एक बहुत ही उच्च गिनती शुरू में तेजी से व्यायाम और 1.5 घंटे व्यायाम के बाद के बाद से कमी आई है कि प्रस्तुत किया, पहले धीरे धीरे के बाद 24 और 48 घंटे सामान्य करने के लिए लौट रहे। औसत में, एनके कोशिकाओं की संख्या (चित्रा 3 बी) व्यायाम के बाद 1.5 घंटे में कमी आई (गैर यद्यपि काफी), लेकिन 24 घंटे के बाद वापस सामान्य स्तर के पास करने के लिए किया गया था।
एन.के. सेल cytotoxicity का निर्धारण
एन.के. कोशिकाओं की संख्या की गणना के बाद, एन.के. कोशिकाओं तुरंत प्रोटोकॉल की धारा 6 में वर्णित के रूप में उनके साइटोटोक्सिक गतिविधि का निर्धारण करने के लिए स्थापित किए गए थे। परिणाम चित्रा 4 बी औसत एन.के. cytotoxicity चित्रण के साथ, प्रत्येक व्यक्ति के धावक के लिए चित्रा -4 ए में प्रस्तुत कर रहे हैं। हमारे परिणाम बताते हैं कि औसत एन.के. cytotoxicity व्यायाम और 1.5 घंटे व्यायाम के बाद (यद्यपि गैर काफी) के बाद थोड़ा कम है, लेकिन काफी 24 घंटे के बाद वृद्धि हुई है। एन.के. cytotoxicity पूर्व की तुलना में उच्च बनी-exercise स्तर (इस पायलट परियोजना में भाग लेने वालों की संख्या में छोटे होने के कारण भाग में) यद्यपि गैर काफी।
चित्रा 2: व्यायाम प्रोटोकॉल। रक्त ड्रॉ (लाल तीर) एन = 4 धावकों पर प्रदर्शन किया गया।
चित्रा 3: एन.के. कोशिकाओं पूर्व कसरत, कसरत के बाद, 1.5 घंटे और 21 घंटे के बाद कसरत गिना जाता है। (ए) एन.के. सेल प्रत्येक व्यक्ति के धावक के लिए पूरे रक्त की मिली लीटर प्रति गिनती। (बी) के औसत एन.के. सेल पूरे रक्त की मिली लीटर प्रति गिनती। एन = 4; स्केल सलाखों = मानक त्रुटि।
चित्रा 4:एन.के. कोशिकाओं cytotoxicity पूर्व कसरत, कसरत के बाद, 1.5 घंटे और 21 घंटे के बाद कसरत। (ए) एन.के. सेल cytotoxicity (मृत लक्ष्य कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त) प्रत्येक व्यक्ति के धावक के लिए। (बी) के औसत एन.के. सेल cytotoxicity (मृत लक्ष्य कोशिकाओं के प्रतिशत के रूप में व्यक्त)। एन = 4; स्केल सलाखों = मानक त्रुटि; *: पी <0.05; **: पी <0.005।
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Discussion
विधि इस अध्ययन में वर्णित सीधे विशिष्ट उत्तेजनाओं के जवाब में एक व्यक्ति की एन.के. कोशिकाओं की गतिविधि (इस विशेष मामले में, लंबे समय तक व्यायाम) के उपाय। आमतौर पर, एन.के. कोशिकाओं घनत्व ढ़ाल या सेल मार्कर का एक संयोजन का उपयोग करके छँटाई का उपयोग कर किसी के खून से अलग कर रहे हैं। इन तरीकों में व्यापक रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं, वे कई कमियां हैं: वे समय लगता है, कई जोड़तोड़ शामिल है, और भारी उपयोगकर्ता निर्भर हैं। नतीजतन, अनुचित दबाव पृथक एन.के. कोशिकाओं है, जो प्रयोग से बढ़ाकर परिवर्तनशीलता में परिणाम कर सकते हैं प्रयोग करने के लिए, या यहां तक कि एक ही प्रयोग के भीतर पर रखा गया है। इस पत्र में, हम एक प्रोटोकॉल है कि इस्तेमाल चुंबकीय आधारित अलगाव का वर्णन किया। जबकि रक्त या एन.के. सेल में गड़बड़ी को कम से कम यह एक व्यक्ति की पूरे रक्त में एन.के. कोशिकाओं के एक उच्च संख्या के त्वरित और विश्वसनीय छँटाई के लिए अनुमति देता है।
इस विधि को, विशेष रूप से मानव अध्ययन जहां नमूने विरल हैं के लिए अनुकूल है, लेकिनदूसरा पहलू पर विधि काफी मुश्किल हो जाता है जब बहुत अधिक नमूने को एक साथ कार्रवाई की जा करने की जरूरत है। दरअसल, साइटोटोक्सिक परख के लिए अधिग्रहण की खिड़की के 30 मिनट के भीतर आम तौर पर ऊष्मायन, जो हमारे अनुभव में ज्यादा से ज्यादा एक समय में 5 नमूनों में अनुवाद के अंत के बाद किया जाना चाहिए। कई नमूने संसाधित करने के लिए कर रहे हैं, यह एक चौंका देने वाला अनुसूची स्थापित करने के लिए फ्लो का अधिग्रहण के लिए पर्याप्त समय की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है। इस पद्धति का एक और दोष अभिकर्मकों कि काफी अधिक हैं और जल्दी से सेवन किया जा सकता है, तो खून की अधिक मात्रा के उच्च एन.के. उपज के लिए कार्रवाई की है की लागत से हो सकता है। हालांकि, हम मानते हैं कि इन लागत को बचाया समय के महत्वपूर्ण राशि से संतुलित कर रहे हैं।
इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण कदम है कि लोगों को संशोधन करने के लिए सबसे खुले हैं। यह कमरे के तापमान पर बनाए रखने के लिए रक्त और एन.के. सेल तनाव से बचने के लिए ड्राइंग के एक घंटे के भीतर प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण है। अलगाव के बाद, सेल गिनती के लिए अत्यंत महत्वपूर्ण हैपरिणाम सटीकता, तो उनकी गिनती की विधि निरंतर होना चाहिए: trypan नीले परख के लिए उदाहरण के लिए यकीन है कि कई चौराहों hemocytometer पर गिना रहे हैं, और उपयोगकर्ता या प्रयोगशाला में एक ही पहचान मापदंडों का उपयोग कर रहा है। यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक टी पर रक्त परीक्षण और एन.के. सेल cytotoxicity के 1.5 एमएल का उपयोग करता है: 1 के ई अनुपात: 5, लेकिन इन मानकों को अनुकूलित किया जा सकता वांछित परख और रक्त की उपलब्ध राशि के आधार पर: अगर कम खून तो उपलब्ध है यह 4 या 1: 3 अभी भी उचित अधिग्रहण समय के लिए इस तरह के 1 के रूप में कम अनुपात का उपयोग करने के लिए संभव है। हमारे अनुभव में कम अनुपात के लिए एक उपयुक्त साइटोटोक्सिक गतिविधि की अनुमति के लिए अपर्याप्त हो सकता है। इसके अलावा, नमूना भिन्नता के कारण ऐसा होता है कि एनके कोशिकाओं की संख्या उम्मीद से काफी कम है; एक प्रयोग के दौरान ई अनुपात: जवाब में, यह प्रतिक्रिया ट्यूबों में लक्ष्य कोशिकाओं की मात्रा कम करने के लिए एक ही टी बनाए रखने के लिए आवश्यक है। परिणाम के विश्लेषण के दौरान सबसे महत्वपूर्ण कदम के लिए आवश्यक के रूप में ज्यादा समय खर्च करने के लिए हैएक अच्छा मैट्रिक्स प्राप्त करते हैं। यदि महान देखभाल प्रोटोकॉल के चरण 3 में वर्णित नियंत्रण तैयार करने के लिए लिया जाता है यह केवल प्राप्त किया जा सकता है। एक बार फाटक चरण 9 में वर्णित के रूप में स्थापित किया गया है, फ़ाइलों को एक साथ batched और बहुत थोड़ा बदलाव के साथ श्रृंखला में विश्लेषण किया जा सकता है। संदेह में, उपयोगकर्ता हमेशा किसी भी घटना पर क्लिक करके छवि गैलरी का उल्लेख करना चाहिए, तो जाँच करने के लिए है कि सभी उचित घटनाओं उचित गेट में शामिल किए गए हैं एक ग्राफ (चित्रा 1C पर देखा है) पर साजिश रची, क्रम में।
चित्रा 2A में प्रतिनिधि परिणामों से पता चला है कि 4 से बाहर 3 धावकों के एक समान पैटर्न प्रस्तुत किया। 4 वें धावक के पैटर्न शायद यह है कि व्यक्ति के लिए विशिष्ट था और एक गलत उपाय के प्रतिनिधित्व नहीं करता है। इस व्यक्ति के लिए एन.के. सेल गिनती पूरी मानव रक्त दोनों पूर्व व्यायाम और 48 घंटा के बाद व्यायाम में स्वीकार कर लिया सीमा के ऊपरी छोर पर था। इस विधि की ताकत इस पत्र है, जहां एन.के. ग में वर्णित में से एक को दर्शाता हैएल सही प्राप्त किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, क्षमता एक एकल लेबलिंग कदम के माध्यम से देशी कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए, कम से कम तनाव और एन.के. कोशिकाओं के लिए संशोधन के लिए अनुमति देता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है जब एन.के. सेल cytotoxicity शारीरिक तनाव की स्थिति के तहत मापा जा रहा है।
अलगाव के बाद, एन.के. सेल cytotoxicity आम तौर से फ्लो या एक रेडियोधर्मी रिलीज परख (उदाहरण के लिए क्रोमियम परख) द्वारा निर्धारित किया जाता है। रिलीज assays एक स्वर्ण मानक माना जाता है, वे रेडियोधर्मी आइसोटोप और संबंधित उपकरण, जो बेहद महंगे हैं के उपयोग पर भरोसा करते हैं। इसके अतिरिक्त, उपयोग और रेडियोधर्मी सामग्री के निपटान के लिए नियमों प्रयोगों है कि समय-कुशलता और सटीक आवश्यकता के लिए जटिलता जोड़ें। दृष्टिकोण एक प्रवाह cytometry का उपयोग समझ में आता है लेकिन ठेठ सावधानियों लेजर सेटिंग्स सहित पालन किया जाना चाहिए, और fluorochrome मुआवजा और gating। यह विशेष रूप से सच है जब कोशिकाओं के 2 अलग अलग प्रकार के एसए में हैंmple, यह साइटोटोक्सिक assays के लिए मामला है। हालांकि, हमारे मामले में एक इमेजिंग प्रवाह के उपयोग की अनुमति देता है कोशिकामापी एक छवि प्रत्येक घटना के लिए कब्जा कर लिया है, और आकार के अनुपात पैरामीटर एकल कक्षों से दोहरी की जुदाई की अनुमति देता है। बाद साइटोटोक्सिक परख प्रेरक और लक्ष्य के बीच शारीरिक संपर्क पर निर्भर करता है यह एक महत्वपूर्ण बिंदु है; बहुत बार कोशिकाओं के इन 2 प्रकार अभी भी प्रवाह माप के दौरान एक साथ हो जाएगा, परिणाम में झूठी डबल सकारात्मक शुरू। यह बहुत ही एक बिंदु (लाइव, डियो सकारात्मक, पीआई नकारात्मक) K562 कोशिकाओं चित्रा -1, जो एक नक़ल एक (मर रहा है, पीआई सकारात्मक) एन.के. सेल का गठन करके चलता में सचित्र है, और। पारंपरिक प्रवाह cytometry में, इस घटना K562 कोशिका मृत्यु गिनती में शामिल किया जाएगा, लेकिन एक झूठी सकारात्मक तथ्य में है। हटाने डेटा वास्तव में समस्याग्रस्त किया जा सकता है, लेकिन यह है, अगर यह लगातार किया और प्रयोग से बहुत सख्त मापदंडों का उपयोग प्रयोग करने के लिए (इस मामले में, "पहलू अनुपात" पैरामीटर) है नहीं है। बदले में,डेटा प्राप्त और अधिक स्थिर हो जाएगा। इसके अतिरिक्त, सभी घटनाओं visualizing सटीक gating के लिए (और गिनती) की अनुमति देता है रंग मापदंडों के आधार पर प्रत्येक घटना की कठोर फाटकों कि परंपरागत रूप से नियंत्रण का उपयोग कर स्थापित किया है और कर रहे हैं कि खाते में प्राकृतिक "डेटा बहाव" उस में हो सकता है नहीं लेते पर निर्भर बिना फ़्लो साइटॉमेट्री। अधिग्रहण के दौरान हर एक लक्ष्य घटना इमेजिंग का जोड़ा क्षमता, एकल के एक उन्नत gating के लिए अनुमति देता है (डियो ही, लाइव लक्ष्य कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व) और डबल दाग आबादी (डियो + पीआई दाग, मृत लक्ष्य कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व)।
इसके अतिरिक्त, यहाँ प्रस्तुत कार्यप्रवाह खाते में पूरे रक्त में एन.के. कोशिकाओं की कमी और सटीक परिणाम के लिए जरूरत लेने के लिए अनुकूलित किया गया था। हालांकि पारंपरिक एन.के. सेल cytotoxicity assays के कई टी पर अपघट्य गतिविधि का पता लगाने के लिए: 1) पूरे रक्त से उपलब्ध एन.के. कोशिकाओं की मात्रा सीमित है और बहुत वी है: ई अनुपात, यह कई कारणों में से एक जोड़ी के लिए अव्यावहारिक हैariable और 2) लक्ष्य विश्लेषण के लिए आवश्यक कोशिकाओं की मात्रा काफी बड़े डेटा की काफी जल्दी अधिग्रहण के लिए अनुमति देने के लिए किया जाना चाहिए। विभिन्न अनुपात (यहाँ नहीं दिखाया गया है) पर कई परीक्षणों से पता चला है कि एक 1: 5 टी: ई अनुपात, जो 4 एक्स 10 4 टी / 2 x 10 5 ई में अनुवाद कर एक इष्टतम संतुलन देता है, और महान reproducibility के लिए अनुमति देता है। विभिन्न व्यक्तियों (यहाँ नहीं दिखाया गया है), इस अनुपात भी एक उम्मीद साइटोटोक्सिक जिस पर और खिड़की के नीचे एक महत्वपूर्ण प्रदान करता हस्तक्षेप के प्रभाव को मापने के लिए सामान्य नमूनों में 50-70% की गतिविधि प्रदान करता है से नमूनों के साथ दोहराया assays के आधार पर।
एन.के. सेल गिनती क्या अन्य कार्य के लिए 11, 12, 13 में मिला था के समान था, और लाइन में रक्त 14 पर एन.के. कोशिकाओं की आवृत्ति की स्वीकृत सीमा के साथ। हालांकि, इस नए कार्यप्रवाह का लाभ चित्रा 3 बी, जहाँ हम पता लगाने में प्रदर्शन किया हैएड के लिए एक महत्वपूर्ण है कि एक ही समय बिंदु पर 24 घंटे पूर्व कसरत स्तर की तुलना में बाद एन.के. सेल cytotoxicity की वृद्धि हुई है, एक एन.के. सेल गिनती कि औसत में था के बावजूद (हालांकि काफी गैर) कम है। इस परिणाम के अन्य प्रकाशित अध्ययन जहां साइटोटोक्सिक स्तरों ज्यादातर पूर्व कसरत के स्तर को समान (या भी कम) थे से अलग है। यह पता चलता है कि समय के बाद व्यायाम की एक लंबी अवधि में उदास होने के बजाय, एन.के. सेल cytotoxicity "पलटाव" के रूप में छोटा रूप में 21 घंटे के बाद व्यायाम के बाद भी उच्च स्तर के लिए सक्षम हो सकता है। शुद्ध, स्वस्थ एनके कोशिकाओं के साथ एक उपन्यास पद्धति का उपयोग करते हुए इस अवलोकन, अगर अनुवर्ती अध्ययन में पुष्टि की है, संभावित वर्तमान परिप्रेक्ष्य बदलने के लिए है कि भारी परिश्रम immunosuppressive है। एन.के. कोशिकाओं Ficoll ढ़ाल या प्रवाह cytometry आधारित छँटाई का उपयोग कर प्राप्त कर रहे हैं, जिसके परिणामस्वरूप जनसंख्या अन्य प्रकार की कोशिकाओं के साथ या तो मिश्रित है, कई क्षतिग्रस्त एन.के. कोशिकाओं और / या संशोधित प्रतिक्रिया के साथ एन.के. कोशिकाओं होते हैं। इन परिणामों consi उम्मीद की जा रही हैंलंबाई, कठोरता और / या ऊपर उल्लिखित तरीकों की अस्पष्टता dering। इन मुद्दों को हटाने, और सभी समय पर शारीरिक शर्तों के करीब रह रही है, प्रयोगात्मक परिणामों को विवो व्यवहार में एन.के. कोशिकाओं के अधिक प्रतिनिधि नेतृत्व करेंगे।
संक्षेप में, हम एक एकीकृत कार्यप्रवाह है कि छोटे मानव रक्त के नमूने से एक तेजी से, सही अलगाव और एन.के. सेल cytotoxicity का पता लगाने कि अन्य तरीकों के साथ जुड़े सीमाओं के कुछ बचा जाता है के लिए अनुमति देता है का वर्णन किया। जबकि मानव रक्त इस काम का ध्यान केंद्रित किया गया है, यह है कि इस पद्धति पशुओं के रक्त के नमूने लिए लागू किया जा सकता है उल्लेखनीय है। इस कार्यप्रवाह बेहद प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और छोटे बदलाव है, जो व्यायाम के अध्ययन जहां भागीदार संख्या सीमित और धारावाहिक रक्त उपायों का अधिग्रहण कर रहे हैं के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है पता लगा सकते हैं। जैसा प्रतिनिधि परिणामों में रेखांकित किया, यह बेहतर तरीका चुनौती और व्यायाम इम्यूनोलॉजी में वर्तमान ज्ञान में सुधार करने की क्षमता है,और एन.के. इम्युनो-निगरानी से संबंधित अन्य क्षेत्रों।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| K-562 lymphoblasts | ATCC | CCL-243 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Media | ATCC | 30-2005 | High glucose, with L-Glutamine, with HEPES, Sterile-filtered |
| Alpha Minimum Essential medium | ATCC | CRL-2407 | Without ribonucleosides and deoxyribonucleosides but with 2 mM L-glutamine and 1.5 g/L sodium bicarbonate |
| Trypan Blue Solution 0.4% | Amresco | K940-100ML | Tissue culture grade |
| Propridium Iodide Staining Solution | BD Pharmingen | 51-66211E | |
| Vybranto DiO cell-labeling solution | Vybranto | V-22886 | |
| autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| autoMACS Running Buffer | Miltenyi Biotec | 130-091-221 | |
| autoMACS Washing Buffer | Miltenyi Biotec | 130-092-987 | |
| autoMACS Columns | Miltenyi Biotec | 130-021-101 | |
| Whole Blood CD56 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-090-875 | |
| ImageStream X Mark II Imaging Flow Cytometer | EMD Millipore | ||
| Speedbeads | Amnis Corporation | 400030 | |
| 0.4-0.7% Hypochlorite (Sterilizer) | VWR | JT9416-1 | |
| Coulter Clenz | Beckman Coulter | 8546929 | |
| 70% Isopropanol (Debubbler) | EMD Millipore | 1.3704 | |
| D-PBS (Sheath fluid) | EMD Millipore | BSS-1006-B (1X) | No calcium or magnesium |
| INSPIRE Software | EMD Millipore | Version Mark II, September 2013 | |
| Ideas Application Software | EMD Millipore | Version 6.1, July 2014 |
References
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