Summary
Dieses Protokoll beschreibt, wie die Expression einer großen Reihe von Genen auf der klonalen Ebene zu bewerten. Einzellige RT-qPCR produziert höchst zuverlässige Ergebnisse mit einer starken Empfindlichkeit für Hunderte von Proben und Gene.
Abstract
Die Genexpression Heterogenität ist ein interessantes Feature in lymphatischen Populationen zu untersuchen. Genexpression in diesen Zellen variiert während der Zellaktivierung, Stress oder Stimulation. Einzelzell - multiplex Genexpression ermöglicht die gleichzeitige Beurteilung von zehn Gene 1, 2, 3. Auf der Ebene einzelner Zellen, Multiplex - Genexpression bestimmt Bevölkerung Heterogenität 4, 5. Es ermöglicht die Unterscheidung der Bevölkerungs Heterogenität durch sowohl die wahrscheinliche mix von unterschiedlichen Vorstufen unter reifen Zellen und auch die Vielfalt von Zellantworten auf Stimuli zu bestimmen.
Angeborene lymphatischen Zellen (ILC) wurden als eine Population der angeborenen Effektoren der Immunantwort 6, 7 kürzlich beschrieben. In diesem Protokoll Zell Heterogenität der ILC erPatic Fach wird während der Homöostase untersucht.
Derzeit ist die am weitesten verbreitete Technik Genexpression zu bewerten ist RT-qPCR. Bei dieser Methode wird die Genexpression nur ein Gen zu einem Zeitpunkt. Darüber hinaus kann dieses Verfahren nicht Heterogenität der Genexpression abzuschätzen, da mehrere Zellen für einen Test benötigt werden. Dies führt zu der Messung des mittleren Genexpression der Bevölkerung. Wenn eine große Zahl von Genen, die Beurteilung, RT-qPCR wird ein zeit-, reagenzien und Probenaufwändige Methode. Daher begrenzen die Trade-offs, die Anzahl der Gene oder Zellpopulationen, die ausgewertet werden können, wodurch das Risiko von der globalen Bild fehlt.
Diese Handschrift beschreibt, wie Einzelzellen-Multiplex-RT-qPCR verwendet werden können, um diese Beschränkungen zu überwinden. Diese Technik wurde von den letzten Mikrofluidik technologischen Fortschritt profitiert 1, 2. Reaktionen auftreten in Multiplex-RT-qPCR-Chips nicht EXCNano--Ebene eed. Daher können Einzelzell Genexpression sowie gleichzeitige multiple Genexpression in einer reagenziendurchgeführt werden, Proben- und kostengünstige Weise. Es ist möglich , Zellen Gen - Signatur Heterogenität an der klonalen Ebene zwischen den Zell - Untergruppen in einer Population in verschiedenen Entwicklungsstadien oder unter verschiedenen Bedingungen 4, 5 zu testen. Die Arbeit an seltenen Populationen mit einer großen Anzahl von Bedingungen auf der Ebene einzelner Zellen ist nicht mehr eine Einschränkung.
Introduction
In den letzten Jahren, angeborene lymphatischen Zellen (ILC) wurden zunehmend untersucht. Trotz ihres Mangels an antigenspezifischen Rezeptoren, sie gehören zu der lymphoiden Abstammungslinie und stellen wichtige sentinels für Gewebe-Homöostase und Entzündung. ILCs werden derzeit in drei Gruppen unterteilt auf der Grundlage ihrer Expression spezifischer Transkriptionsfaktor - Kombinationen und auf ihrer Fähigkeit , Cytokine 7 6, zu erzeugen.
ILCs tragen zu zahlreichen Homöostase und pathophysiologischen Situationen in den verschiedenen Organen über spezifische Zytokin - Produktion 8, 9. Um die Rolle dieser Zellen zu verstehen, ist es wichtig, die verschiedenen Subpopulationen ILC pro Organ zu bestimmen und deren Entwicklungsbeziehungen zu identifizieren. Zusätzlich wurden Phänomene der Plastizität zwischen den verschiedenen Untergruppen verwandt. Durch die Heterogenität des Studiumsder Zellen, die in einem Organ, ist es möglich, die Reifungsstufe zu begrenzen und ihre spezifischen Funktionen zu unterscheiden.
Um die Technik der Single-Cell - Multiplex - RT-qPCR illustrieren, wurden Leber ILCs gewählt, mit einem besonderen Schwerpunkt auf ihre Heterogenität innerhalb der gleichen ILC Gruppe (Typ 1 ILC) 10. Zuerst wird durch die Verwendung von Durchflusszytometrie, drei verschiedene ILC-Populationen wurden in der Leber gekennzeichnet. Gruppe 1 ILC entspricht rund 80% der angeborenen Effektoren, während die beiden anderen Populationen sind selten Leber ILC Populationen (weniger als 5% der angeborenen Effektoren). Diese Populationen wurden unter Verwendung allgemein ausgedrückt Zelloberflächenmarker von ILC Populationen sortiert. Als Ergebnis sortiert ILC-Populationen in der Leber weitgehend ähnlich aussehen einem zum anderen.
Einzellige Multiplex - RT-qPCR hat sich als eine der besten Techniken entstanden, umgehend die Heterogenität dieser Populationen 11 untersuchen
Als nächstes wird durch alle Zellen mit einem globalen ILC Phänotyp Sortierung, eine breite Übersicht über die Mehr Genexpression der Leber ILC Populationen erhalten wird, auch wenn sie extrem selten Populationen repräsentieren. Ein Mikrofluidik-basierten Chip ermöglicht das Experimentieren mit selbsteine geringe Menge an Zellmaterial. Als Folge können die Genexpressionsprofile von seltenen Zellpopulationen erhalten werden. Mit Online-Gen-Signatur-Analyse-Software, Zellpopulation Cluster und mögliche Zell Beziehungen untersucht werden. Folglich können Funktionstests durchgeführt werden , um die Cluster - Daten auf der in - vivo - Ebene zu überprüfen.
Zehn Genexpressionen werden könnten gleichzeitig auf Hunderte oder mehr einzelne Zellen auf dem gleichen Chip 3, 11, 12 bewertet. Design des Assays ist der längste und wichtigste Teil des Experiments. Die Bestimmung der Gene, die für die Hypothese getestet werden, ist von größter Bedeutung relevante Ergebnisse zu erhalten. Zweitens, die interne Kontrolle (wie bekannte Oberflächenmarker für das Sortieren verwendet) und spezifische Kontrollen erforderlich sind. Dies ist entscheidend, um die Primer-Amplifizierung Spezifität zu testen, die Effizienz der Amplifikation und ter ohne Primer Wettbewerb. Daher arbeitet mit Einzelzell Multiplex-RT-qPCR ist ein zeitsparendes Verfahren, das als Multiple-Genexpression einer Zelle zur gleichen Zeit beurteilt wird.
Mit dem gleichen Chip und Mischung von Reagenzien für alle Zellen begrenzt die möglichen Fehler der Manipulation und ermöglicht die Reproduzierbarkeit zwischen den Proben. Insgesamt lassen sich die verschiedenen Aspekte der Einzelzellen-Multiplex-RT-qPCR zur Herstellung von hochzuverlässige Ergebnisse auf der klonalen Ebene mit einem hohen Grad an Empfindlichkeit für eine Vielzahl von Proben und Genen. Die erzielten Ergebnisse bieten leistungsfähige und robuste Daten für biostatistischen Tests.
Dies kann aufgrund der mikrofluidischen Aspekt des Verfahrens erreicht werden, was auf sehr geringe Mengen an Material für die Arbeit ermöglicht und führt zu erschöpfende Ergebnisse. Schließlich Online-Software verwenden, ist es möglich, die gewünschten Populationen zu vergleichen.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden vom Institut Pasteur Sicherheitsausschuss in Übereinstimmung mit dem Französisch Landwirtschaftsministerium und die EU-Richtlinien genehmigt.
1. Bereiten Sie eine 96-Well-Einzellige Sortierplatte
- Bereiten Vorverstärkung Mischung in einem 1,5-ml-Röhrchen durch Zugabe von 5,0 ul spezifischen Retrotranskriptionspuffer 1,3 & mgr; l niedrigen Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) TE-Puffer (10 mM TE-Lösung, pH 8, und 0,1 mM EDTA-Lösung, 0,2 & mgr; M filtriert ) und 0,2 ul Taq DNA - Polymerase pro Vertiefung (Abbildung 1a).
- Auf einer 96-Well-Platte, verteilen 6,5 ul Vorverstärkung Mischung in jeder Vertiefung (bis zu 48 Wells). Diese Platte ist der 96-Loch-Einzelzellsortierplatte.
HINWEIS: eine elektronische Pipette wird für dieses Protokoll empfohlen. Es ermöglicht eine genaue und reproduzierbare Volumenmessungen und spart Zeit.
2. Einzel Zelldissoziationsmedium 3. Einzellige Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS) 4. Vorverstärkung 5. Bereiten Sie eine 96-Well-Probenplatte 6. Bereiten Sie eine 96-Well-Assayplatte 7. Einzelzellen-Gen-Expression Chip 8. Führen Sie den Chip 9. Datenanalyse 
HINWEIS: Das Endvolumen in jeder Vertiefung der 96-Well-Probenplatte sollte 9 & mgr; l sein.
HINWEIS: Wenn die weithin ausgedrückt ILC Zelloberflächenmarkern, 3 Populationen sind definiert: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + und NKp46 - IL-7Rα +. Alle Populationen sind sortiert Linie - CD3 - CD4 - CD45.2 +.
HINWEIS: Verschiedene Zelltypen können auf dem gleichen 96-well Einzelzellsortierplatte (2) sortiert werden.
HINWEIS: Die richtige Positionierung jeder Zelle auf der 96-Loch-Einzelzellsortierplatte ist von wesentlicher Bedeutung. Eine Platte Layout sollte auf einem Tabellenkalkulations-Software gehalten werden. Die Plattenlayout wird in den nächsten Schritten (Abbildung 1b) 14 verwendet werden. Eine Vertiefung enthält 0,2x Assay-Mix und Vorverstärkung-Mix auf der 96-Well-Probenplatte ohne Zellen. Das gut als nicht-Eingangskontrolle verwendet. Verlassen zwei Reihen von 6 Vertiefungen für eine cDNA-Verdünnung. Diese Vertiefungen werden als Kontrollen für die Primereffizienz (1b) verwendet. 
Abbildung 3: Vorverstärkung Programm. Um genügend Material, Pre-Amplifikation spezifischer Zielgene auf sortierte Einzelzellen aufweisen muss. Die 96-Loch-Einzelzellensortierplatte wird auf einem Thermocycler geladen, um die Vorverstärkung Programm zu folgen. Die vorge Amplifikationsprodukte werden dann mit niedrigen EDTA TE-Puffer verdünnt und kann sofort oder bei -20 ° C eingefroren werden. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
HINWEIS: Zum wiederholtem Einfrieren und Auftauen der Primer zu vermeiden, verteilen die Primer für die Vorverstärkung Mischung und für die 96-well Assayplatte zur gleichen Zeit.
HINWEIS: Keine Flüssigkeit sollte über den Chip verschüttet werden. 
Abbildung 4: Ein-Zellen - Multiplex - Gen-Expression Chip Laden. Diese Schritte erfordern great Präzision, vor allem während der Übertragung der 96-Well-Platte in die Einzelzellen-Multiplex-Gen-Expression-Chip. Um das Laden von Fehlern und Fehlstellungen zu vermeiden, ist es dringend empfohlen, sequentiell zu arbeiten. Das Volumen für jede Übertragung genommen sollte während des Pipettierprozeß gesteuert werden. Schließlich ist es wichtig, jegliche Luftblasen zu vermeiden, und sie im Falle der Bildung zu entfernen. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
HINWEIS: "Default-10min-Hotstart.pcl" ist der am häufigsten verwendete Programm für die Einzelzell-Multiplex-RT-qPCR.
ACt = Ct Probe - Ct interne Kontrolle
Fold Change = 2 - (ΔCtsample-ΔCtnegative Kontrolle)
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Representative Results
Lymphatische Populationen zeigen eine große Vielfalt in der Genexpression. In diesem Protokoll wurde ILC Kompartiment Leber Heterogenität untersucht unter Verwendung von Expressionseinzelzell-Multiplex-RT-qPCR-Gens. Im Gegensatz zu anderen Techniken Genexpression ermöglicht Single-Cell-Multiplex-RT-qPCR Genexpression Arbeiten an mehreren Populationen, auch die seltensten, zugleich. Diese Spezifität, gekoppelt mit einer hohen Empfindlichkeit bei der klonalen Ebene, ermöglicht die Untersuchung der Unterschiede in der Gen-Signaturen innerhalb einer Population und zwischen seltenen Populationen. Als Beispiel wurden die Gensignaturen von 3 ILC Populationen aus den Lebern von 4 Wochen alten Mäusen bewertet. Eine Population ist häufig genug, um leicht identifiziert werden können, während die beiden anderen sind selten (weniger als 1% der Lineage-negativen Zellen) in der Leber.
Ein 96-Loch-Einzelzellensortierplatte und einer 96-Well-Assayplatte wurden vor der Leber DISSECTIO vorbereitetn und Dissoziation (Abbildung 1). Jede Mischung wurde unter einer sterilen Haube hergestellt und mit einer elektronischen Pipette für Volumen Präzision und Reproduzierbarkeit verteilt. Alle Reagenzien wurden verwirbelt vor Homogenität aufrechtzuerhalten Pipettieren. Nach der Herstellung der kann 96-Well-Zellsortierplatte, bis die Zellsortierung und der 96-Well-Zellassay Platte bis IFC Belastung kann eingefroren werden eingefroren werden.
Lebern wurden in Einzelzellsuspensionen präpariert und dissoziiert. Die Zellen wurden auf getaut 96-Well-Einzelzellsortierplatten gefärbt und sortiert. Verwendung von FACS, 3 ILC Populationen wurden auf Basis von allgemein ausgedrückt ILC Marker (Figur 2) sortiert. Nach der Zellsortierung, wurde cDNA synthetisiert und spezifische Zielgene wurden amplifiziert (Abbildung 3 und Tabelle 2). Nach der Vorverstärkung Schritt wurde cDNA in niedrigen EDTA TE Puffer verdünnt. Grundierungen und cDNA , die aus einzelnen Zellen wurden auf dem IFC Chip geladen (FiFiguren 4 und 5a). Die erhaltenen Ergebnisse (7a) für das Lesen zu vereinfachen und Analyse (Abbildung 7b) vereinfacht. Beispiele für richtig oder falsch geladen Chips gezeigt (Abbildung 5). Ein FAM Figur eines ordnungsgemäß geladen Chip (Abbildung 6) mit unterschiedlichen Verstärkungssignale gezeigt.
Die Ergebnisse zeigen , dass nach einer geeigneten Zellsortierung, Vorverstärkung und das Laden, das ILC Bevölkerung für die Genexpression in der Leber von erwachsenen Wildtyp - Mäusen (Abbildung 7) heterogen erscheint. Verwendung von Online - Software, zellspezifischen Genexpression Signaturen (7 und 8) und Zellpopulation Beziehungen (8) identifiziert werden konnten. Jede sortiert Bevölkerung hat eine spezifische Gen-Signatur in der Genexpression angereichert. Zum Beispiel, sortierten Zellen als NKp46 - IL-7Rα + Enriched Ausdruck RORC, der wichtigsten Transkriptionsfaktor der Gruppe 3 ILCs; Rora, ein RORC -homologous Transkriptionsfaktor; und IL-23R und CXCR6 zwei wichtige Rezeptoren der Gruppe 3 ILC Leber Marker in der Leber. Die gleichen Beobachtungen können mit NKp46 + IL-7Rα gemacht werden - und NKp46 + IL-7Rα + Populationen. Jede Zelle ist für Housekeeping - Gen - Expression geprüft (Hprt, Act und GAPDH) ungültig Brunnen auszuschließen; mindestens zwei Housekeeping-Gene müssen ausgedrückt werden die Werte als gültig zu betrachten.
Interessanterweise erlaubt diese Technik für die Definition von zwei Subpopulationen von NKp46 + IL-7Rα - basierend auf Gensignaturen. Unterschiede zwischen diesen beiden Signaturen durch andere Sätze von verschiedenen funktionellen Experimente validiert werden.
![Figur 2]("/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg")
Abbildung 2: FACS Zellstrategie. Bilder sind repräsentativ für isolierte Leberzellen von 4 Wochen alten Mäusen. (A) FSC-A / SSC-A - Gating, (b) FSC-H / FSC-W Dublette Diskriminierung, (c, d und e) lebendig, abstammungs negativ CD45.2 + CD4 - CD3 - Zellen Gating. (F) Mit weit ausgedrückt ILC Zelloberflächenmarker, definierten wir drei Populationen: NKp46 + IL-7Rα -, NKp46 + IL-7Rα + und NKp46 - IL-7Rα +. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: ROX Zahlen richtig (a) Und falsch (b) geladen Chips. (A) ordnungsgemäß geladen Single-Cell - Multiplex - Gen-Expression - Chip sollte mit geraden Linien und Reihen erscheinen. Jede Reaktionskammer gefüllt ist und die gleiche Dimension. (B) Nicht ordnungsgemäß Single-Cell - Multiplex - Gen-Expression - Chip geladen. Leere Zeilen und Reihen von Reaktionskammern erscheinen (grünes Quadrat) sowie Biegelinien (blaues Quadrat). Diese Funktionen können durch unsachgemäße "PRIME" oder "LOAD" Schritte, sowie Restblasen in den IFC Vertiefungen sein. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: FAM (Fluorescein Amiditchemie) Figur eines ordnungsgemäß geladen Chip. Nach wenigen Zyklen (in Abhängigkeit von den Proben und auf der Grundierungs s beurteilt), sollten Unterschiede in der Reaktionskammer Helligkeit erscheinen. Reaktionskammern mit einem Verstärkungssignal sollte heller erscheinen (blaues Quadrat) als Reaktionskammern, die keine oder geringe Verstärkung Signale (grünes Quadrat). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 7: Wärmekarte erhalten vor (a) und nach (b) Änderungen. (A) Direkte Heatmap ohne Analyse oder Modifikation von Test / Beispielauftrag erhalten. (B) Modifizierte Heatmap nach Proben- und Testname Definition erhalten. Keine Eingangs Brunnen (blaues Quadrat) erhalten werden, wenn keine Verstärkung auftritt. Ineffiziente Primer (grünes Quadrat). cDNA Verdünnungstest (lila Quadrat). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 8: Einzel-Zell - Population Clustering. Eine Datenanalyse-Software wird verwendet, um die Clusterbildung zwischen Populationen zu bestimmen. Freie Clustering-Software sind online verfügbar. Durch das gesamte Expressionsprofil einer einzelnen Zelle Beurteilung kann die Software Gensignaturen und Zellpopulation Beziehungen anzuzeigen. Jedes Quadrat stellt eine Zelle: blau sind NKp46 + IL-7Rα -, rot sind NKp46 + IL-7Rα + und grün sind NKp46- IL-7Rα +. Jede Bevölkerung hat eine spezifische Gen-Signatur. Innerhalb des NKp46 + IL-7Rα - Bevölkerung, zwei Unterschriften können attestiert Heterogenität Bevölkerung gesehen werden.4858 / 54858fig8large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Grundierungen | |
| actb | Il-23r |
| Aes | Il-2RA |
| Ahr | Il-2RB |
| Bcl - 2 | II-7RA |
| c-myc | Klr5 |
| CBFB | LEF1 |
| CD27 | Ncr1 |
| CD49a | Nfil3 |
| CD49b | Notch1 |
| CXCR5 | Notch2 |
| CXCR6 | Rora |
| Eomes | RORC |
| Ets1 | runx3 |
| FOXO1 | Tbx21 |
| GAPDH | TCF3 |
| Gata3 | TCF7 |
| GM-CSF | TLE1 |
| Hes1 | Tle3 |
| Hprt | Tsc22d3 |
| Id2 | Tnfrsf11a |
| Il-12rb2 | Tox |
| Il-18r1 | Zbtb16 |
| Il-1rl1 | Zbtb7b |
| Il-22 | |
Tabelle 1: Primer - Liste.
Tabelle 2: Vorverstärkung Programm. Jeder Schritt des Vorverstärkung Programm wird mit dem alle Informationen bezüglich der Zeit, der Temperatur und der Anzahl der Zyklen dargestellt.
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Discussion
Dieses Protokoll beschreibt, wie erschöpfend Genexpression Informationen auf der klonalen Ebene zu erhalten. Hier untersuchten wir ILC Kompartiment Heterogenität Leber. Nach einer Einzelzellsortierung verschiedener ILC Populationen (basierend auf weit ILC Oberflächenmarker ausgedrückt) wurden die Proben für bestimmte vorgewählte Gene vorverstärkt. Dann wurden die erhaltenen cDNA-Primer und geladen auf ein Multiplex-RT-qPCR mikrofluidischen Chip. Schließlich erhalten wir die Expression von 48 verschiedenen Genen aus 48 Einzelzellen. Die Genexpression Ergebnisse wurden über eine Online-Software analysiert, um Gen-Signatur und Zellpopulation Beziehungen untersuchen.
Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, gleichzeitig mehrere Genexpression zu bewerten. Es ermöglicht auch die Arbeit an der klonalen Ebene und in sehr seltenen Populationen. Im Gegensatz zu herkömmlichen RT-qPCR Methoden, hat Single-Cell-Multiplex-RT-qPCR keine Mittelungseffekt, da die Genexpression auf der klonalen Ebene bewertet wird. SoHeterogenität innerhalb einer Population erfasst und analysiert werden. Einzellige RT-qPCR-Expression ermöglicht ein Arbeiten in sehr seltenen Populationen, da es nur sehr wenige Zellen benötigt breite Information über die Genexpression zu erhalten. Darüber hinaus können verschiedene Populationen von Zellen auf der gleichen Platte getestet werden. Dies ermöglicht die Erfassung von Unterschieden in der Gen-Signatur zwischen den Populationen und mit Online-Daten-Tools, die Beurteilung der Zellpopulation Beziehungen. Diese Technik stellt andere Vorteile. Einzellige Multiplex-RT-qPCR hat den Vorteil der jüngsten mikrofluidischen Fortschritte. Volumes in den IFC Kammern benötigt nicht die Nano--Ebene nicht überschreiten. Somit geringere Mengen an Reagenzien verwendet, um die Kosten von Versuchen zu verringern. Schließlich wird die Gesamtzahl der Pipettierschritte reduziert, wodurch die Möglichkeit der Pipettierfehler begrenzen. Die Schritte sind simultanen für alle Zellen und kann mit einer Mehrkanalpipette durchgeführt werden, so dass Arbeit in eine schnelle und zeitsparende Weise. Die erhaltenen Ergebnisse beidie klonalen Ebene sind reproduzierbar, zuverlässig und verwendet werden können, robuste Datenanalysen durchzuführen.
Einzelzell-Multiplex-RT-qPCR hat jedoch einige Einschränkungen darstellen. Zunächst erfordert diese Technik teuer und spezielle Ausrüstung, wie beispielsweise einem Mikrofluidik-Chip, einem Mikrofluidik-Chip-Controller und einem spezifischen Thermocycler. Im Gegensatz zu konventionellen RT-qPCR Methoden, diese Technik ist zeit- und Reagenz sparend, da mit konventionellen RT-qPCR werden zahlreiche Studien erforderlich, um statistisch signifikante Vergleiche erhalten. In diesem Protokoll stellen wir ein Verfahren Genexpression für 48 Gene zu erhalten. 96-96 Multiplex-RT-qPCR Mikrofluidik-Chips zur Verfügung. Diese Chips können die Genexpression für 96 Gene aus 96 Zellen gleichzeitig zu bewerten. Während der Zellsortierung, werden eine minimale Anzahl von Ausgangszellen benötigt, da Präzision und Zell Reinheit maximal sein muß. Doch selbst mit einer kleinen Anzahl von Zellen, ist es immer noch möglich, Einzelzell-Multiplex-RT-qPCR-Gen exp zu sortierenression (Schritt 3). Schließlich ist Single-Cell-Multiplex-RT-qPCR eine empfindliche Methode. Verschiedene Tests müssen vor dem Start solcher Experimente durchgeführt werden. Beispielsweise für die Primerzielspezifität, Primer sollten für Amplifikationseffizienz und für die relative Wettbewerb für das Ziel getestet werden.
Mehrere Schritte des Protokolls muss mit Vorsicht durchgeführt werden. Die Manipulationen von kleinen Volumina mit einer großen Anzahl von Proben kombiniert und Assays zur gleichen Zeit das Risiko von Fehlern Pipettieren erhöhen (Schritte 1, 4, 5, 6 und 7). Alle Reagenzien und Mischungen sollten vor dem Pipettieren, um eine homogene Lösung zu gewährleisten, verwirbelt werden. Verdunstung während der Prä-Amplifikation (Schritt 4) kann auch die endgültigen Ergebnisse auswirken. Die Platten sollten immer richtig mit einem geeigneten Deckfolie versiegelt werden. Sortierstrategie muss sehr präzise sein (Schritt 3) tote Zellen oder mehrere Zellen in Vertiefungen in den Platten zu vermeiden. FACS Maschinen sortieren jetzt mit Single-cell sorting ind ausgestattetex-Software, die die spezifische Zelle sortiert wurde in jeder Vertiefung aufnehmen. Dieses neue Werkzeug wird zur Bestimmung der von Interesse sein, ob Gensignaturen an Zelloberflächenmarker Intensität korreliert sind. Proben- und Testpositionen auf Chips müssen sorgfältig organisiert werden, da dies für das Experiment wesentlich ist (Schritte 1, 5 und 6). Schließlich ist die Auswahl der Primer (Schritt 1 und 6) ein kritischer Schritt. Jeder Primer muss auf der Basis vorher beschriebenen Ergebnissen oder den erwarteten Ergebnissen ausgewählt werden. Eine zufällige Auswahl von Primern in der Menge der bewerteten Gene könnten die endgültige Auslesen des Experiments beeinträchtigen. Weiterhin Primern, die mit dem Zelloberflächenmarker für Zelle verwendet korrelieren Sortier müssen als Kontrollen mit Housekeeping-Genen verwendet werden.
Die Beurteilung Multiplex-Genexpression auf klonalen Ebene bietet eine bessere Charakterisierung der Leber ILC heterogenen Raum als in der bisherigen Forschung. Diese Technik, die von Online-Software geliefert wird, beschreibt genauer die different Teilmengen von ILC in der Leber bei der Homöostase als Studien nur Zelloberflächenmarker verwenden. Weiterhin ist es möglich, Zellpopulation Beziehungen zu betrachten und Differenzierungs Netzwerke aufzubauen. Die Gen-Signaturen, basierend auf Single-Cell-Genexpression, sind ebenfalls wichtige Werkzeuge Zellpopulation Merkmale zu erkennen und mögliche Rollen zu untersuchen. Einzelzellen-Multiplex-RT-qPCR ist eine der besten Techniken für eine Genexpressionsassay zuverlässige Daten zu erhalten. Diese Daten sind leicht handhabbar mit Bioinformatik - Software - 15. In Bezug auf andere Techniken für Genexpressionsstudien, wie Microarrays oder RNA-Sequenzierung bietet Single-Cell-Multiplex-RT-qPCR hohe Empfindlichkeit. Andere Ansätze zur Einzelzellanalyse wurden beschrieben und können als komplementäre Techniken Einzelzell Multiplex - RT-qPCR 15, 16 verwendet werden. Darüber hinaus kann die Technik mit einer beliebigen Primerkombination durchgeführt werden, allowing Benutzer bei personalisierten Gensignaturen zu suchen. Viele andere Anwendungen können mit dieser Technik verwendet werden. Zum Beispiel kann der Zeitverlauf der Genexpression von Zellen während der Entwicklung durchgeführt werden, um die Modifikation des Molekularprofil während der Entwicklung zu untersuchen. Arzneimittelwirkungen auf Zellen können auch mit Arzneimittelverdünnung untersucht werden, um die Schwelle der Arzneimitteleffizienz auf die Genexpression zu bestimmen.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 ml syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fetal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 ml tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1,000 µl tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
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