Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे प्रतिरूप के स्तर पर जीनों का एक बड़ा सरणी की अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए। एकल कोशिका RT-qPCR नमूने और जीनों के सैकड़ों के लिए एक मजबूत संवेदनशीलता के साथ अत्यधिक विश्वसनीय परिणाम पैदा करता है।
Abstract
जीन अभिव्यक्ति विविधता लसीकावत् आबादी में जांच करने के लिए एक दिलचस्प सुविधा है। इन कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति सेल सक्रियण, तनाव, या उत्तेजना के दौरान बदलता रहता है। एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स जीन अभिव्यक्ति जीन 1, 2, 3 के दसियों के एक साथ मूल्यांकन सक्षम बनाता है। एकल कोशिका के स्तर पर, मल्टीप्लेक्स जीन अभिव्यक्ति आबादी विविधता 4, 5 को निर्धारित करता है। यह दोनों परिपक्व कोशिकाओं के बीच विविध अग्रदूत चरणों के संभावित मिश्रण और भी उत्तेजनाओं को सेल प्रतिक्रिया की विविधता का निर्धारण करके जनसंख्या विविधता के गौरव के लिए अनुमति देता है।
जन्मजात लसीकावत् कोशिकाओं (आईएलसी) ने हाल ही प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया 6, 7 की सहज प्रभावोत्पादक की आबादी के रूप में वर्णित किया गया है। इस प्रोटोकॉल में, आईएलसी वह सेल विविधताPatic डिब्बे homeostasis के दौरान जांच की है।
वर्तमान में, सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल तकनीक जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने के लिए RT-qPCR है। इस विधि के उपायों जीन अभिव्यक्ति एक समय में केवल एक ही जीन। साथ ही, इस विधि जीन अभिव्यक्ति की विविधता अनुमान नहीं कर सकते, क्योंकि कई कोशिकाओं को एक परीक्षण के लिए आवश्यक हैं। इस आबादी की औसत जीन अभिव्यक्ति की माप की ओर जाता है। जब जीनों की बड़ी संख्या का आकलन करने, आर टी-qPCR एक समय, reagent-, और नमूना लेने वाली विधि बन जाता है। इसलिए, व्यापार-नापसंद, जीन या सेल आबादी है कि मूल्यांकन किया जा सकता की संख्या को सीमित वैश्विक तस्वीर लापता का खतरा बढ़ रही है।
इस पांडुलिपि का वर्णन कैसे एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR इन सीमाओं को पार करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तकनीक को हाल ही में तकनीकी विकास microfluidics 1, 2 से लाभ हुआ है। मल्टीप्लेक्स RT-qPCR चिप्स में होने वाली प्रतिक्रियाओं exc नहीं हैnanoliter स्तर eed। इसलिए, एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति, साथ ही एक साथ कई जीन अभिव्यक्ति, एक reagent- में, sample- किया जा सकता है, और लागत प्रभावी ढंग से। यह 5, विभिन्न विकासात्मक चरणों में या अलग अलग परिस्थितियों 4 के तहत आबादी के भीतर सेल सबसेट के बीच प्रतिरूप स्तर पर सेल जीन हस्ताक्षर विविधता का परीक्षण करने के लिए संभव है। एकल कोशिका के स्तर पर स्थिति की बड़ी संख्या के साथ दुर्लभ आबादी पर काम करना अब कोई प्रतिबंध नहीं है।
Introduction
पिछले कुछ वर्षों में, जन्मजात लसीकावत् कोशिकाओं (आईएलसीएस) तेजी से जांच की गई है। विशिष्ट प्रतिजन रिसेप्टर्स की कमी के बावजूद, वे लसीकावत् वंश के हैं और ऊतक homeostasis और सूजन के लिए महत्वपूर्ण प्रहरी प्रतिनिधित्व करते हैं। आईएलसीएस वर्तमान में तीन विशिष्ट प्रतिलेखन कारक संयोजनों की उनकी अभिव्यक्ति पर और उनके साइटोकिन्स 6, 7 उत्पादन करने की क्षमता के आधार पर समूहों में विभाजित हैं।
आईएलसीएस विशिष्ट साइटोकाइन उत्पादन 8, 9 के माध्यम से विविध अंगों में कई होमियोस्टैटिक और pathophysiological स्थितियों के लिए योगदान करते हैं। इन कोशिकाओं की भूमिका को समझने में सक्षम हो, यह अंग प्रति विभिन्न आईएलसी उप-जनसंख्या निर्धारित करने के लिए और उनके विकास के रिश्तों की पहचान करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके अलावा, विभिन्न सबसेट के बीच प्लास्टिसिटी की घटना से संबंधित कर दिया गया है। विविधता का अध्ययन करकेएक अंग में मौजूद कोशिकाओं की, यह परिपक्वता के अपने मंच परिसीमित करने के लिए और उनके विशिष्ट कार्यों भेद करने के लिए संभव है।
एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR की तकनीक वर्णन, यकृत आईएलसीएस उनकी विविधता पर, एक ही चुने गए हैं आईएलसी समूह (1 प्रकार आईएलसी) 10 के भीतर एक विशेष जोर देने के साथ। सबसे पहले, प्रवाह cytometry के उपयोग के माध्यम से, तीन अलग आईएलसी आबादी जिगर में विशेषता थे। समूह 1 आईएलसी, जन्मजात प्रभावोत्पादक का लगभग 80% का प्रतिनिधित्व करता है, जबकि दो अन्य आबादी दुर्लभ यकृत आईएलसी आबादी (जन्मजात प्रभावोत्पादक के कम से कम 5%) कर रहे हैं। उन आबादी आईएलसी आबादी के लिए व्यापक रूप से व्यक्त सेल सतह मार्कर का उपयोग कर हल किया गया। नतीजतन, हल जिगर में आईएलसी आबादी दूसरे के लिए मोटे तौर पर इसी तरह की एक देखो।
एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR सबसे अच्छा तकनीकों में से एक के रूप में उभरा है तुरंत इन आबादी 11 की विविधता जांच करने के लिए
अगले, एक वैश्विक आईएलसी phenotype के साथ सभी कोशिकाओं छँटाई द्वारा, जिगर आईएलसी आबादी के कई-जीन अभिव्यक्ति की एक विस्तृत अवलोकन प्राप्त की है, भले ही वे अत्यंत दुर्लभ आबादी का प्रतिनिधित्व करते हैं। एक microfluidic आधारित चिप के साथ भी प्रयोग की अनुमति देता हैसेल सामग्री की एक छोटी राशि। एक परिणाम के रूप में, दुर्लभ सेल आबादी के जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल प्राप्त किया जा सकता है। ऑनलाइन जीन हस्ताक्षर विश्लेषण सॉफ्टवेयर, सेल की आबादी समूहों और संभावित सेल संबंधों का उपयोग कर जांच की जा सकती है। नतीजतन, कार्यात्मक परीक्षण में विवो स्तर पर क्लस्टरिंग डेटा को मान्य करने के लिए किया जा सकता है।
जीन अभिव्यक्ति के दसियों सैकड़ों या एक ही चिप 3, 11, 12 के बारे में अधिक एकल कक्षों पर समन्वित रूप से मूल्यांकन किया जा सकता है। परख का डिजाइन प्रयोग की सबसे लंबी और सबसे महत्वपूर्ण हिस्सा है। परीक्षण किया जा करने के लिए प्रासंगिक परिकल्पना जीनों के निर्धारण प्रासंगिक परिणाम प्राप्त करने के लिए सर्वोपरि है। दूसरे, और विशिष्ट नियंत्रण (जैसे छँटाई के लिए इस्तेमाल किया जाना जाता सतह मार्कर के रूप में) आंतरिक नियंत्रण की जरूरत है। इस किताब प्रवर्धन विशिष्टता, प्रवर्धन की क्षमता है, और टी परीक्षण के लिए महत्वपूर्ण हैवह प्राइमर प्रतियोगिता का अभाव। इसलिए, एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR के साथ काम कर रहे एक timesaving तकनीक, के रूप में एक सेल के कई-जीन अभिव्यक्ति एक ही समय पर मूल्यांकन किया जाता है।
सभी कोशिकाओं के लिए एक ही चिप और अभिकर्मकों के मिश्रण का उपयोग हेरफेर के संभावित त्रुटियों को सीमित करता है और नमूनों के बीच reproducibility के लिए अनुमति देता है। कुल मिलाकर, एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR के विभिन्न पहलुओं के नमूने और जीन की एक विस्तृत विविधता के लिए संवेदनशीलता का एक बड़ा स्तर के साथ, प्रतिरूप स्तर पर अत्यधिक विश्वसनीय परिणाम के उत्पादन के लिए अनुमति देता है। प्राप्त परिणामों biostatistical परीक्षण के लिए शक्तिशाली और मजबूत डेटा प्रदान करते हैं।
इस विधि है, जो सामग्री की बहुत छोटी मात्रा पर काम करने के लिए अनुमति देता है और संपूर्ण परिणाम होता है की microfluidic पहलू के कारण प्राप्त किया जा सकता है। अंत में, ऑनलाइन सॉफ्टवेयर का उपयोग कर, यह संभव वांछित आबादी की तुलना है।
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Protocol
सभी पशु प्रयोगों फ्रेंच कृषि मंत्रालय और यूरोपीय संघ के दिशा निर्देशों के अनुसार पाश्चर संस्थान सुरक्षा समिति द्वारा की अनुमोदित किया गया।
1. एक 96 अच्छी तरह से एकल सेल छंटनी थाली तैयार
- विशिष्ट रेट्रो-प्रतिलेखन बफर के 5.0 μl, कम ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) ते बफर (10 मिमी ते समाधान, 8 पीएच, और 0.1 मिमी EDTA समाधान के 1.3 μl जोड़कर एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में पूर्व प्रवर्धन मिश्रण तैयार करें; 0.2 माइक्रोन फ़िल्टर ), और Taq डीएनए पोलीमरेज़ प्रति अच्छी तरह से (चित्रा 1 ए के 0.2 μl)।
- एक 96 अच्छी तरह से थाली पर, प्रत्येक अच्छी तरह से (अप करने के लिए 48 कुओं) में पूर्व प्रवर्धन मिश्रण के 6.5 μl वितरित। यह प्लेट 96 अच्छी तरह से एकल कोशिका छँटाई थाली है।
नोट: एक इलेक्ट्रॉनिक विंदुक का प्रयोग इस प्रोटोकॉल के लिए सिफारिश की है। यह सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य मात्रा माप के लिए अनुमति देता है और समय की बचत होती है।
2. एकल सेल हदबंदी 3. एकल सेल प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छंटनी (FACS) 4. पूर्व प्रवर्धन 5. एक 96 अच्छी तरह से नमूना थाली तैयार 6. एक 96 अच्छी तरह से परख थाली तैयार 7. एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति चिप 8. भागो चिप 9. डेटा विश्लेषण 
नोट: 96 अच्छी तरह से नमूना थाली के प्रत्येक कुएं में अंतिम मात्रा 9 μl होना चाहिए।
नोट: व्यापक रूप से व्यक्त आईएलसी सेल सतह मार्कर का उपयोग करते हैं, 3 आबादी परिभाषित कर रहे हैं: NKp46 + आईएल 7Rα - NKp46 + आईएल 7Rα +, और NKp46 - आईएल 7Rα +। सभी आबादी वंश क्रमबद्ध हैं - CD3 - सीडी 4 - सीडी 45.2 +।
नोट: विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं में ही 96 अच्छी तरह से एकल कोशिका छँटाई प्लेट पर हल किया जा सकता है (चित्रा 2)।
नोट: 96 अच्छी तरह से एकल कोशिका छँटाई प्लेट पर प्रत्येक कोशिका के उचित स्थिति के लिए आवश्यक है। एक थाली लेआउट एक स्प्रेडशीट सॉफ्टवेयर पर रखा जाना चाहिए। थाली लेआउट अगले कई कदम (चित्रा 1 बी) के 14 में इस्तेमाल किया जाएगा। कोशिकाओं के बिना एक अच्छी तरह से युक्त 0.2X परख मिश्रण और 96 अच्छी तरह से थाली पर नमूना पूर्व प्रवर्धन मिश्रण छोड़ दें। यह अच्छी तरह से एक नहीं, इनपुट नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता है। एक सीडीएनए कमजोर पड़ने के लिए 6 कुओं की दो पंक्तियों को छोड़ दें। इन कुओं प्राइमर दक्षता (चित्रा 1 बी) के लिए नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल कर रहे हैं। 
चित्रा 3: पूर्व प्रवर्धन कार्यक्रम। आदेश में पर्याप्त सामग्री है करने के लिए, हल एकल कक्षों पर विशिष्ट लक्ष्य जीन के पूर्व प्रवर्धन की आवश्यकता है। 96 अच्छी तरह से एकल कोशिका छँटाई प्लेट पूर्व प्रवर्धन कार्यक्रम का पालन करने के लिए एक thermocycler पर भरी हुई है। पूर्व प्रवर्धन उत्पादों तो कम EDTA ते बफर के साथ पतला कर रहे हैं और तुरंत इस्तेमाल किया जा सकता है या -20 डिग्री सेल्सियस पर जमे हुए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
नोट: 96 wel के लिए दोहराया ठंड और प्राइमरों के विगलन से बचने के लिए, पूर्व प्रवर्धन मिश्रण के लिए प्राइमरों वितरित करने औरएक ही समय में एल परख थाली।
नोट: कोई तरल चिप पर गिरा दिया जाना चाहिए। 
चित्रा 4: एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स जीन अभिव्यक्ति चिप लोड हो रहा है। ये कदम जी की आवश्यकता होती हैreat सटीक, विशेष रूप से एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स अभिव्यक्ति जीन-चिप के लिए 96 अच्छी तरह से थाली के स्थानांतरण के दौरान। लोड हो रहा है त्रुटियों और misplacements से बचने के लिए, यह अत्यधिक क्रमिक रूप से काम करने के लिए सिफारिश की है। मात्रा हर हस्तांतरण के लिए ले जाया pipetting प्रक्रिया के दौरान नियंत्रित किया जाना चाहिए। अंत में, यह किसी भी बुलबुले से बचने के लिए और उन्हें गठन के मामले में दूर करने के लिए महत्वपूर्ण है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
नोट: "डिफ़ॉल्ट-10min-Hotstart.pcl" सबसे अधिक इस्तेमाल एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR के लिए कार्यक्रम तैयार किया है।
ΔCt = सीटी नमूना - सीटी आंतरिक नियंत्रण
मोड़ो बदलें = 2 - (ΔCtsample-ΔCtnegative नियंत्रण)
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Representative Results
Lymphoid आबादी जीन अभिव्यक्ति में महान विविधता प्रदर्शित करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, जिगर आईएलसी डिब्बे विविधता एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR जीन अभिव्यक्ति का उपयोग कर जांच की गई। अन्य जीन अभिव्यक्ति तकनीक के विपरीत, एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR जीन अभिव्यक्ति काम कई आबादी पर भी नायाब, की अनुमति देता है, एक ही समय में। यह विशिष्टता, प्रतिरूप स्तर पर एक उच्च संवेदनशीलता के साथ मिलकर, एक आबादी के भीतर जीन हस्ताक्षर में मतभेद की जांच के लिए और दुर्लभ आबादी के बीच की अनुमति देता है। एक उदाहरण के रूप में, 4 सप्ताह पुराने चूहों के यकृत से 3 आईएलसी आबादी के जीन हस्ताक्षर का मूल्यांकन किया गया। एक आबादी, लगातार पर्याप्त आसानी से पहचाना जा रहा है दो अन्य हैं, जबकि दुर्लभ (वंश नकारात्मक कोशिकाओं के कम से कम 1%) जिगर में।
एक 96 अच्छी तरह एकल कोशिका छँटाई प्लेट और एक 96 अच्छी तरह से परख थाली जिगर dissectio करने से पहले तैयार किए गएn और हदबंदी (चित्रा 1)। प्रत्येक मिश्रण एक बाँझ हुड के तहत तैयार की मात्रा और शुद्धता और reproducibility के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक विंदुक के साथ वितरित किया गया। सभी अभिकर्मकों एकरूपता बनाए रखने के लिए pipetting से पहले vortexed थे। तैयारी के बाद, 96 अच्छी तरह से सेल छँटाई की थाली तक सेल छँटाई जमे हुए किया जा सकता है, और 96 अच्छी तरह से सेल परख थाली आईएफसी लोड हो रहा है जब तक जमे हुए किया जा सकता है।
यकृत विच्छेदित और एकल कक्ष निलंबन में अलग किया गया। प्रकोष्ठों दाग और thawed 96 अच्छी तरह से एकल कोशिका छँटाई प्लेटों पर हल किया गया। FACS का उपयोग, 3 आईएलसी आबादी व्यापक रूप से व्यक्त आईएलसी मार्करों के आधार पर (चित्रा 2) हल किया गया। सेल छंटाई के बाद, सीडीएनए संश्लेषित किया गया था, और विशिष्ट लक्ष्य जीन (चित्रा 3 और तालिका 2) प्रवर्धित थे। पूर्व प्रवर्धन कदम के बाद, सीडीएनए कम EDTA ते बफर में पतला था। प्राइमर और सीडीएनए एकल कक्षों से (Fi आईएफसी चिप पर भरी हुई थीgures 4 और 5 ए)। प्राप्त परिणामों (चित्रा 7A) आसानी से पढ़ने और विश्लेषण (चित्रा 7B) के लिए सरल बनाया गया था। ठीक है या अनुचित तरीके से भरी हुई चिप्स के उदाहरण (चित्रा 5) दिखाए जाते हैं। एक ठीक से भरी हुई चिप (चित्रा 6) विभिन्न प्रवर्धन संकेतों के साथ के एक परिवार आंकड़ा दिखाया गया है।
परिणाम उचित सेल छँटाई, पूर्व प्रवर्धन, और लदान के बाद, आईएलसी आबादी वयस्क प्रकार के जंगली चूहों के जिगर में जीन की अभिव्यक्ति (चित्रा 7) के लिए विषम प्रतीत होता है कि दिखा। ऑनलाइन सॉफ्टवेयर, सेल विशिष्ट जीन अभिव्यक्ति हस्ताक्षर (आंकड़े 7 और 8) और सेल की आबादी के रिश्तों (8 चित्रा) का उपयोग कर पहचाना जा सकता है। प्रत्येक हल किया जनसंख्या एक विशेष जीन हस्ताक्षर जीन अभिव्यक्ति में समृद्ध है। उदाहरण के लिए, कोशिकाओं के रूप में NKp46 हल किया - आईएल 7Rα + E हैRorc, समूह 3 आईएलसीएस का मुख्य प्रतिलेखन कारक के nriched अभिव्यक्ति; Rora, एक Rorc -homologous प्रतिलेखन कारक; और इल 23R और Cxcr6, जिगर में समूह 3 आईएलसी यकृत मार्करों के दो महत्वपूर्ण रिसेप्टर्स। NKp46 + आईएल 7Rα + आबादी और - एक ही टिप्पणियों NKp46 + आईएल 7Rα के साथ बनाया जा सकता है। प्रत्येक कोशिका गृह व्यवस्था जीन अभिव्यक्ति (HPRT, अधिनियम, और GAPDH) अवैध कुओं को बाहर करने के लिए जाँच की है; कम से कम दो जीनों हाउसकीपिंग वैध रूप मूल्यों पर विचार करने के लिए व्यक्त किया जाना चाहिए।
दिलचस्प है, इस तकनीक NKp46 + आईएल 7Rα के दो उप-जनसंख्या की परिभाषा के लिए अनुमति देता है - जीन हस्ताक्षर के आधार पर। उन दो हस्ताक्षरों के बीच मतभेद विभिन्न कार्यात्मक प्रयोगों के दूसरे सेट द्वारा मान्य किया जाना है।
![चित्र 2]("/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg")
चित्रा 2: FACS सेल रणनीति। छवियाँ 4 सप्ताह पुराने चूहों से अलग जिगर की कोशिकाओं के प्रतिनिधि हैं। (क) एफएससी-ए / एसएससी-ए gating, (ख) एफएससी-एच / एफएससी-W नक़ल भेदभाव, (सी, डी और ई) जीवित है, वंश नकारात्मक CD45.2 + सीडी 4 - CD3 - कोशिकाओं gating। - NKp46 + आईएल 7Rα +, और NKp46 - आईएल 7Rα + NKp46 + आईएल 7Rα: (च) व्यापक रूप से व्यक्त आईएलसी सेल सतह मार्कर का उपयोग, हम 3 आबादी में परिभाषित किया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 5: ठीक से ROX आंकड़े (एक) और अनुचित तरीके से (ख) लोड चिप्स। (क) ठीक से भरी हुई एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स जीन अभिव्यक्ति चिप सीधे लाइनों और पंक्तियों के साथ दिखाई देनी चाहिए। प्रत्येक कक्ष प्रतिक्रिया भरा है और एक ही आयाम है। (ख) अनुचित लोड एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स जीन अभिव्यक्ति चिप। खाली लाइनों और प्रतिक्रिया कक्षों की पंक्तियों दिखाई देते हैं (हरी वर्ग), के रूप में अच्छी तरह से झुकने लाइनों (नीले वर्ग)। इन सुविधाओं को अनुचित "प्रधानमंत्री" या "लोड" कदम के कारण, साथ ही आईएफसी कुओं में अवशिष्ट बुलबुले के लिए हो सकता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 6: परिवार (Fluorescein amidite) एक ठीक से लोड चिप का आंकड़ा। कुछ चक्रों के बाद (नमूनों पर और प्राइमर के आधार पर मूल्यांकन एस), कक्ष प्रतिक्रिया चमक में मतभेद प्रकट करना चाहिए। एक प्रवर्धन संकेत के साथ रिएक्शन कक्षों नहीं या कम प्रवर्धन संकेतों (हरी वर्ग) के साथ प्रतिक्रिया कक्षों की तुलना में उज्जवल (नीले वर्ग) दिखाई देनी चाहिए। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 7: इससे पहले कि (क) और बाद में (ख) संशोधनों प्राप्त गर्मी नक्शा। (क) प्रत्यक्ष गर्मी नक्शा विश्लेषण या परख / नमूना आदेश के संशोधन के बिना प्राप्त की। (ख) संशोधित गर्मी नक्शा प्राप्त करने के बाद नमूना और परख नाम परिभाषा। अगर कोई प्रवर्धन होता है कोई इनपुट कुओं (नीले वर्ग) प्राप्त कर रहे हैं। अक्षम प्राइमरों (हरी वर्ग)। सीडीएनए कमजोर पड़ने टेस्ट (बैंगनी वर्ग)। e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
8 चित्रा: एकल सेल की आबादी क्लस्टरिंग। एक डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर आबादी के बीच क्लस्टरिंग निर्धारित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। फ्री क्लस्टरिंग सॉफ्टवेयर ऑनलाइन उपलब्ध हैं। एक एकल कोशिका की पूरी अभिव्यक्ति प्रोफ़ाइल का आकलन करके, सॉफ्टवेयर जीन हस्ताक्षर और सेल की आबादी रिश्तों को प्रदर्शित कर सकते हैं। प्रत्येक वर्ग के लिए एक सेल का प्रतिनिधित्व करता है: नीले NKp46 + आईएल 7Rα हैं - लाल कर रहे हैं NKp46 + आईएल 7Rα +, और हरा कर रहे हैं NKp46- आईएल 7Rα +। प्रत्येक जनसंख्या एक विशेष जीन हस्ताक्षर है। NKp46 + आईएल 7Rα भीतर - जनसंख्या, दो हस्ताक्षरों देखा जा सकता है, जनसंख्या विविधता के लिए attesting।4858 / 54858fig8large.jpg "लक्ष्य =" _blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
| प्राइमर | |
| Actb | इल 23R |
| एईएस | इल 2ra |
| Ahr | इल 2rb |
| Bcl2 | द्वितीय 7ra |
| सी-MYC | Klr5 |
| Cbfb | Lef1 |
| CD27 | Ncr1 |
| Cd49a | Nfil3 |
| Cd49b | Notch1 |
| Cxcr5 | Notch2 |
| Cxcr6 | Rora |
| Eomes | Rorc |
| Ets1 | Runx3 |
| Foxo1 | Tbx21 |
| GAPDH | Tcf3 |
| Gata3 | Tcf7 |
| जीएम- CSF | Tle1 |
| Hes1 | Tle3 |
| HPRT | Tsc22d3 |
| id2 | Tnfrsf11a |
| इल 12rb2 | Tox |
| इल 18r1 | Zbtb16 |
| इल 1rl1 | Zbtb7b |
| इल 22 | |
तालिका 1: प्राइमर सूची।
तालिका 2: पूर्व प्रवर्धन कार्यक्रम। पूर्व प्रवर्धन कार्यक्रम के हर कदम समय, तापमान, और चक्रों की संख्या के बारे में पूरी जानकारी के साथ दिखाया गया है।
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Discussion
इस प्रोटोकॉल का वर्णन प्रतिरूप स्तर पर संपूर्ण जीन अभिव्यक्ति जानकारी प्राप्त करने के लिए कैसे। यहाँ, हम जिगर आईएलसी डिब्बे विविधता की जांच की। अलग आईएलसी आबादी (व्यापक रूप से व्यक्त आईएलसी सतह मार्कर के आधार पर) की एकल कोशिका छंटाई के बाद, नमूने विशिष्ट पूर्व चयनित जीनों के लिए पूर्व प्रवर्धित थे। फिर, प्राप्त सीडीएनए और प्राइमरों एक मल्टीप्लेक्स RT-qPCR microfluidic चिप पर भरी हुई थी। अंत में, हम 48 एकल कक्षों से 48 विभिन्न जीनों की अभिव्यक्ति प्राप्त की। जीन एक्सप्रेशन परिणाम जीन हस्ताक्षर और सेल की आबादी संबंधों की जांच करने के लिए एक ऑनलाइन सॉफ्टवेयर के माध्यम से विश्लेषण किया गया।
इस तकनीक का प्रमुख लाभ एक साथ कई जीन अभिव्यक्ति का आकलन करने की क्षमता है। यह भी प्रतिरूप के स्तर पर और बहुत ही दुर्लभ आबादी पर काम की अनुमति देता है। पारंपरिक RT-qPCR विधियों के विपरीत, एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR के बाद जीन अभिव्यक्ति प्रतिरूप स्तर पर मूल्यांकन किया है, कोई औसत प्रभाव पड़ता है। इस प्रकार, आबादी के भीतर विविधता का पता चला और विश्लेषण किया जा सकता है। एकल कोशिका RT-qPCR अभिव्यक्ति के बाद से ही बहुत कुछ कोशिकाओं जीन अभिव्यक्ति पर विस्तृत जानकारी प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं, बहुत दुर्लभ आबादी पर काम की अनुमति देता है। इसके अलावा, कोशिकाओं के विभिन्न आबादी एक ही थाली पर परीक्षण किया जा सकता है। इस ऑनलाइन डेटा उपकरण, सेल की आबादी के रिश्तों के आकलन के साथ आबादी के बीच जीन हस्ताक्षर में अंतर का पता लगाने के लिए सक्षम बनाता है और। इस तकनीक के रूप में अच्छी तरह से अन्य लाभ प्रस्तुत करता है। एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR हाल microfluidic अग्रिमों का लाभ दिया है। आईएफसी कक्षों में जरूरत वॉल्यूम nanoliter स्तर से अधिक नहीं है। इस प्रकार, अभिकर्मकों की कम मात्रा का इस्तेमाल किया जाता है, प्रयोगों की लागत को कम करने। अंत में, pipetting कदम की कुल संख्या कम हो जाता है, जिससे pipetting त्रुटियों की संभावना सीमित है। कदम सभी कोशिकाओं के लिए एक साथ होते हैं और एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ किया जा सकता है, एक तेजी से और समय की बचत ढंग से काम सक्षम करने से। पर प्राप्त परिणामोंप्रतिरूप स्तर प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य, विश्वसनीय हैं, और मजबूत डेटा का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR, हालांकि, कुछ सीमाओं को पेश करता है। सबसे पहले, इस तकनीक को इस तरह के एक microfluidic चिप, एक microfluidic चिप नियंत्रक, और एक विशिष्ट thermocycler के रूप में महंगा है और विशेष उपकरण की आवश्यकता है। पारंपरिक RT-qPCR विधियों के विपरीत, इस तकनीक, समय और अभिकर्मक की बचत है, क्योंकि पारंपरिक RT-qPCR के साथ, कई अध्ययनों सांख्यिकीय महत्वपूर्ण तुलना प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम 48 जीनों के लिए जीन अभिव्यक्ति प्राप्त करने के लिए एक प्रक्रिया प्रस्तुत करते हैं। 96-96 मल्टीप्लेक्स RT-qPCR microfluidic चिप्स उपलब्ध हैं। इन चिप्स एक ही समय में 96 कोशिकाओं से 96 जीनों के लिए जीन अभिव्यक्ति का आकलन कर सकते हैं। सेल छँटाई के दौरान शुरू की कोशिकाओं की एक न्यूनतम संख्या की जरूरत है, के बाद से सटीक और सेल शुद्धता अधिक से अधिक होना चाहिए। हालांकि, यहां तक की कोशिकाओं के एक छोटे समूह के साथ, यह अभी भी संभव एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR जीन विस्तार के लिए सुलझाने के लिए हैression (3 कदम)। अंत में, एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR एक संवेदनशील तरीका है। विभिन्न परीक्षणों ऐसे प्रयोगों शुरू करने से पहले किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, प्राइमर लक्ष्य विशिष्टता के लिए, प्राइमरों प्रवर्धन दक्षता के लिए और लक्ष्य के लिए रिश्तेदार प्रतियोगिता के लिए परीक्षण किया जाना चाहिए।
प्रोटोकॉल के कई कदम सावधानी के साथ किया जाना चाहिए। एक ही समय में नमूने और assays की एक बड़ी संख्या के साथ संयुक्त pipetting गलतियों का खतरा बढ़ छोटे संस्करणों की जोड़तोड़ (चरण 1, 4, 5, 6, और 7)। सभी अभिकर्मकों और घोला जा सकता है, ताकि एक समरूप समाधान सुनिश्चित करने के लिए pipetting से पहले vortexed किया जाना चाहिए। पूर्व प्रवर्धन (चरण 4) के दौरान वाष्पीकरण भी अंतिम परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं। प्लेटों हमेशा ठीक एक उपयुक्त कवर फिल्म के साथ बंद किया जाना चाहिए। छंटनी की रणनीति बहुत ही सटीक (चरण 3) प्लेटों के भीतर कुओं में मृत कोशिकाओं या एकाधिक कोशिकाओं से बचने के लिए किया जाना चाहिए। मशीनों छँटाई FACS अब एकल कोशिका छँटाई इंडस्ट्रीज़ से लैस हैंपूर्व सॉफ्टवेयर रिकॉर्ड कर सकते हैं जो कि विशेष सेल प्रत्येक में अच्छी तरह से हल किया गया था। इस नए उपकरण है कि क्या जीन हस्ताक्षर सेल सतह मार्कर तीव्रता को सहसंबद्ध होते हैं के निर्धारण के लिए ब्याज की हो जाएगा। चिप्स पर नमूना और परख पदों कुशलता का आयोजन किया जाना चाहिए के रूप में इस प्रयोग के लिए आवश्यक है (1 कदम, 5, और 6)। अंत में, प्राइमरों (चरण 1 और 6) के चयन के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। हर प्राइमर पहले से वर्णित परिणाम या अपेक्षित परिणाम के आधार पर चयनित किया जाना चाहिए। मूल्यांकन जीनों के सेट में प्राइमरों के एक यादृच्छिक विकल्प प्रयोग के अंतिम readout प्रभावित हो सकती है। इसके अलावा, प्राइमरों कि सेल सतह सेल छँटाई के लिए इस्तेमाल किया मार्कर के साथ संबंध स्थापित गृह व्यवस्था जीन के साथ नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा रहा है।
प्रतिरूप स्तर पर मल्टीप्लेक्स जीन अभिव्यक्ति का आकलन पिछले अनुसंधान में से जिगर आईएलसी विषम डिब्बे का एक बेहतर लक्षण वर्णन प्रदान करता है। इस तकनीक, ऑनलाइन सॉफ्टवेयर द्वारा आपूर्ति, और अधिक ठीक का वर्णन घकेवल सेल सतह मार्कर का उपयोग अध्ययन से homeostasis में जिगर में आईएलसी के ifferent सबसेट। इसके अलावा, यह सेल की आबादी के रिश्तों पर विचार करने और भेदभाव के नेटवर्क का निर्माण संभव है। जीन हस्ताक्षर, एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति पर आधारित है, यह भी महत्वपूर्ण उपकरण सेल की आबादी सुविधाओं विचार करने के लिए और संभावित भूमिका की जांच करने के लिए कर रहे हैं। एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR एक जीन अभिव्यक्ति परख विश्वसनीय डेटा प्राप्त करने के लिए सबसे अच्छा तकनीकों में से एक है। इन आंकड़ों से जैव सूचना विज्ञान सॉफ्टवेयर 15 के साथ आसानी से प्रबंध कर रहे हैं। इस तरह के प्रोटीन या आरएनए अनुक्रमण के रूप में जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए अन्य तकनीकों, के लिए सम्मान के साथ, एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR उच्च संवेदनशीलता प्रदान करता है। एकल कोशिका विश्लेषण के लिए अन्य तरीकों का वर्णन किया गया है और एकल कोशिका मल्टीप्लेक्स RT-qPCR 15, 16 के रूप में पूरक तकनीक का इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके अलावा, तकनीक, किसी भी प्राइमर संयोजन के साथ किया जा सकता है allowinजी उन व्यक्तिगत जीन हस्ताक्षरों को देखने के लिए। कई अन्य अनुप्रयोगों इस तकनीक के साथ प्रयोग किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, विकास के दौरान कोशिकाओं के समय पाठ्यक्रम जीन अभिव्यक्ति के विकास के दौरान आणविक प्रोफ़ाइल के संशोधन का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। कोशिकाओं पर दवा प्रभाव भी जीन अभिव्यक्ति पर दवा दक्षता की दहलीज निर्धारित करने के लिए दवा कमजोर पड़ने के साथ जांच की जा सकती है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 ml syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fetal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 ml tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1,000 µl tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
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