Summary
이 프로토콜은 클론 수준에서 유전자의 큰 어레이의 식을 평가하는 방법을 설명한다. 단일 셀 RT-qPCR에 샘플과 유전자의 수백에 대한 강한 감도와 신뢰성이 높은 결과를 얻을 수 있습니다.
Abstract
유전자 발현의 이질성은 림프 인구에서 조사 할 수있는 흥미로운 기능입니다. 이들 세포에서의 유전자 발현은 세포 활성화, 스트레스, 또는 자극하는 동안 변화한다. 단일 셀 다중 유전자 발현 유전자 1, 2, 3, 수십의 동시 평가를 가능하게한다. 단일 세포 수준에서 다중 유전자 발현 인구 얼룩이 -4,5- 판정한다. 그것은 성숙 세포 사이의 다양한 전구체 단계의 가능성 혼합 또한 자극에 대한 세포 반응의 다양성을 모두 결정함으로써 인구의 이질성의 구별이 가능합니다.
선천성 림프 세포 (ILC)는 최근 면역 반응 6,7 내재 이펙터 집단으로 설명되었다. ILC 그는이 프로토콜에서, 세포 이질성상호 작용이있다 함은 항상성 동안 조사 하였다.
현재, 유전자 발현을 평가하기 위해 가장 널리 사용되는 기술은 RT-qPCR에있다. 이 방법은 측정의 유전자 발현 한 번에 하나의 유전자. 복수의 셀이 하나의 시험이 필요하기 때문에 또한이 방법은 유전자 발현의 이질성을 예측할 수 없다. 이는 집단의 평균 유전자 발현의 측정을 이끈다. 유전자의 다수의 평가시, RT-qPCR에이 시간이, reagent- 및 샘플이 걸리는 방법이된다. 따라서, 트레이드 오프는 글로벌 화상 누락의 위험을 증가시키는, 평가 될 수있는 유전자 또는 세포 집단의 수를 제한한다.
이 논문은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 이러한 한계를 극복 할 수있는 방법을 설명한다. 이 기술은 최근 미세 유체 기술 진보 1, 2에서 혜택을 받았다. 멀티 플렉스 RT-qPCR에 칩에서 발생하는 반응은 EXC을하지 않습니다나노 리터 수준을 EED. 따라서, 단일 세포 유전자 발현뿐만 아니라, 동시에 복수의 유전자 발현은 메가 샘플하는 reagent- 수행하고 비용 효율적인 방식으로 할 수있다. 이 5 가지 개발 단계 또는 상이한 조건 하에서 4 집단 내 세포의 서브 세트 사이의 클론 세포 수준에서 유전자 서명 이질성을 테스트 할 수있다. 단일 세포 수준에서 조건의 많은 수의 희귀 한 집단에서 작업하는 것은 더 이상 제한되지 않습니다.
Introduction
지난 몇 년 동안, 선천성 림프 세포 (ILCs)는 점점 더 조사되었다. 항원 특이 적 수용체의 부족에도 불구하고, 그들은 림프 계보에 속하는 조직 항상성 및 염증 중요한 센티넬 나타낸다. ILCs 현재 특정 전사 인자 결합의 발현과 사이토 카인 (6, 7)을 생성하는 능력에 따라 세 개의 그룹으로 분할된다.
ILCs 특정 사이토 카인 생산 8, 9를 통해 다양한 기관에서 다수의 항상성 및 병태 생리 학적 상황에 기여한다. 이러한 세포의 역할을 이해 할 수있게하기 위해, 기관마다 다양한 ILC 개체군을 결정하고, 그 발달 관계를 파악하는 것이 중요하다. 또한, 서로 다른 서브 세트들 사이에서 가소성 현상은 서로 관련되어있다. 이질성을 연구하여한 기관에 존재하는 세포, 그들의 성숙 단계를 구분하고, 특정 기능을 구별 할 수있다.
단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에의 기술을 설명하기 위해 간 ILCs는 같은 ILC 그룹 (유형 1 ILC) (10) 내 자신의 이질성에 특히 중점을두고 선택되었다. 첫째, 유동 세포 계측법을 사용하여, 세 가지 ILC 인구 간 특징 하였다. 다른 두 집단 간 희귀 ILC 인구 (선천성 이펙터의 5 % 미만) 동안 1 군 ILC는 타고난 이펙터의 약 80 %를 나타낸다. 그 인구는 ILC 인구의 널리 표현 세포 표면 마커를 사용하여 분류 하였다. 그 결과, ILC 집단 간 다른 대체로 유사 하나 볼 정렬.
싱글 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 신속하게 이러한 인구 (11)의 이질성을 조사하기 위해 가장 좋은 방법 중 하나로 떠오르고있다
다음으로, 글로벌 ILC 표현형의 모든 세포를 분류함으로써, 간이 ILC 인구 다중 유전자 발현의 넓은 개요가 극히 드문 인구를 나타내는 경우에도 얻어진다. 미세 유체 기반 칩도 함께 실험을 할 수 있습니다셀 재가 소량. 결과적으로, 희귀 세포 집단의 유전자 발현 프로파일을 얻을 수있다. 온라인 유전자 서명 분석 소프트웨어 세포군 및 전위 클러스터 셀의 관계를 사용하는 것이 검토된다. 결과적으로, 기능 시험은 생체 레벨에서 클러스터 데이터를 검증하기 위해 수행 될 수있다.
유전자 발현 수십 동일한 칩 (3), 11, 12에서 수백 이상의 단셀에 부수적으로 평가 될 수있다. 분석의 디자인 실험의 가장 길고 가장 중요한 부분입니다. 테스트 할 가설에 관련된 유전자의 판정이 적절한 결과를 얻기 위해 가장 중요하다. 둘째, 특정 컨트롤 (예 : 정렬에 사용 알려진 표면 마커 등) 내부 통제가 필요하다. 이 프라이머 증폭 특이성, 증폭의 효율 및 t을 테스트하기 위해 매우 중요하다프라이머 경쟁 그는 부재. 셀의 다중 유전자 발현을 동시에 평가된다 따라서, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 작업하면, 절약 해주는 기술이다.
모든 셀에 대한 시약의 동일한 칩과 믹스를 사용하여 조작 가능한 오류를 제한하고 샘플 간의 재현성 수 있습니다. 전체적으로 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에의 다른 측면은 샘플 및 유전자의 다양한 감도의 중대한 레벨, 클론 레벨에서 신뢰성이 높은 결과의 생산을 허용한다. 얻어진 결과는 biostatistical 테스트를위한 강력하고 견고한 데이터를 제공합니다.
이는 물질의 매우 작은 양의 작업을 허용하고 완전한 결과를 유도하는 방법의 미세 형태로 달성 될 수있다. 마지막으로, 온라인 소프트웨어를 사용하면, 목적하는 집단과 비교하는 것이 가능하다.
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Protocol
모든 동물 실험은 프랑스 농업 장관과 유럽 연합 (EU)의 지침에 따라 파스퇴르 연구소 안전위원회의 승인되었습니다.
1. 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트를 준비합니다
- 구체적인 역 전사 완충액 5.0 ㎕의 낮은 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) TE 완충액 (10 mM의 TE 용액의 pH 8, 0.1 mM의 EDTA 용액 13 μl를 첨가하여 1.5 ㎖의 튜브에 미리 증폭 믹스 준비 0.2 μM 여과 )과의 Taq DNA 중합 효소 웰 당 (도 1a 0.2 μL).
- 96 웰 플레이트에 각 웰 (최대 48 우물)에 미리 증폭 믹스의 6.5 μl를 배포 할 수 있습니다. 이 판을 96 웰 단일 셀 정렬 판이다.
참고 : 전자 피펫을 사용하여이 프로토콜을 사용하는 것이 좋습니다. 그것은 정확하고 재현성있는 볼륨 측정을 가능하게하고 시간을 절약 할 수 있습니다.
2. 단일 세포 해리 3. 단일 세포 형광 활성화 셀 정렬 (FACS) 4. 사전 증폭 5. 96 웰 샘플 플레이트를 준비 6. 96 웰 분석 플레이트를 준비 7. 단일 세포 유전자 발현 칩 8. 실행하여 칩 9. 데이터 분석 
주 : 9 μL되어야 96- 웰 샘플 플레이트의 각 웰의 최종 부피.
참고 : 널리 표현 ILC 세포 표면 마커를 사용하는 경우, 세 인구가 정의됩니다 NKp46 + IL-7Rα - NKp46 + IL-7Rα +, 및 NKp46 - IL-7Rα +를. 모든 인구 계보를 분류되어 있습니다 - CD3 - CD4 - CD45.2 +.
참고 : 다른 세포 유형이 동일한 96 웰 단일 셀 정렬 판에 정렬 할 수 있습니다 (그림 2).
참고 : 96 웰 단일 셀 정렬 플레이트의 각 셀의 적절한 위치 결정이 필수적이다. 접시 레이아웃은 스프레드 시트 소프트웨어에 보관해야합니다. 플레이트 레이아웃은 다음의 여러 단계 (도 1B) (14)에 사용된다. 세포없이 96 웰 샘플 접시에 하나 잘 포함하여 0.2 배씩 분석 믹스와 프리 앰프 믹스를 남겨주세요. 이 웰 노 입력 제어로서 사용된다. cDNA의 희석 6 우물의 두 행을 둡니다. 이 우물은 프라이머 효율 (그림 1b)에 대한 컨트롤로 사용된다. 
그림 3 : 사전 증폭 프로그램입니다. 충분한 재료를 갖기 위해, 정렬 된 단일 세포에 대한 표적 유전자의 프리 앰프가 필요하다. 96- 웰 단일 셀 정렬 판은 사전 증폭 프로그램을 수행하기 위하여 열 순환기에로드된다. 전치 증폭 생성물은 낮은 EDTA TE 완충액으로 희석 한 즉시 사용하거나 -20 ℃에서 냉동 될 수있다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
주 : 프라이머의 반복 동결 융해를 방지 사전 증폭 믹스의 프라이머를 배포하고 96 아에 대한하려면동시에 L 개의 분석 플레이트.
참고 : 액체가 칩을 통해 유출 될 수 없습니다. 
그림 4 : 단일 셀 다중 유전자 발현 칩로드. 이 단계는 g를 필요로특히 단일 셀 다중 유전자 발현 칩으로 96 웰 플레이트의 전송 중에 reat 정밀도. 로드 오류와 오 배치를 방지하려면, 매우 순차적으로 작동하는 것이 좋습니다. 각 전송 걸리는 부피 피펫 팅 과정을 제어한다. 마지막으로, 임의의 기포를 방지하고 형성시에 제거하는 것이 중요하다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
주 : "기본적으로 10 분 - Hotstart.pcl"은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 대한 가장 일반적으로 사용되는 프로그램이다.
ΔCT = 코네티컷 샘플 - 코네티컷 내부 통제
(ΔCtsample - ΔCtnegative 제어) - 변경 = 2 배
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Representative Results
림프 인구는 유전자 발현의 다양성을 표시합니다. 이 프로토콜에서, 간 ILC 실 얼룩이은 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 유전자 발현을 사용하여 조사 하였다. 다른 유전자 발현 기술과는 달리, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 유전자 발현을 동시에조차 희귀 여러 집단 작업을 허용한다. 클론 수준에서 높은 감도와 결합이 특이도는 인구 내에서 유전자 서명의 차이의 조사 및 희귀 집단 사이에 있습니다. 예를 들어, 4 주령 생쥐의 간에서 3 ILC 인구 유전자 서명을 평가 하였다. 다른 두 간에서 (계통 음성 세포의 1 % 미만) 희귀 한 반면 인구를 쉽게 식별 할 정도로 빈번하다.
96 웰 단일 셀 정렬 플레이트 96 웰 플레이트 분석 간 dissectio 이전에 제조 된n 및 해리 (그림 1). 각각의 혼합 멸균 후드를 준비하고 볼륨 정확성과 재현성을위한 전자 피펫과 함께 배포했다. 모든 시약은 동질성을 유지하기 위해 피펫 전에 텍싱 하였다. 제조 후, 96 웰 세포 플레이트를 정렬 셀 정렬 될 때까지 고정 될 수 있고, 96 웰 세포 분석 플레이트 IFC 로딩 될 때까지 고정 될 수있다.
간 절개 및 단일 세포 현탁액 내로 해리 하였다. 세포 염색 및 해동 96 웰 단일 셀 정렬 판에 정렬했다. FACS를 사용하여, 3 ILC 인구 널리 표현 ILC 마커를 기반으로 (그림 2) 분류 하였다. 셀 정렬 후, cDNA를 합성하고, 표적 유전자는 (도 3 및 표 2)을 증폭시켰다. 사전 - 증폭 단계 후에, cDNA를 둘러 EDTA TE 완충액에 희석 하였다. 하나의 세포로부터 프라이머 및 cDNA를 인터넷합니다 (IFC 칩에 탑재 된gures 4, 5A). 얻어진 결과 (도 7a)는 쉽게 읽고 분석 (도 7b)에 대한 단순화 하였다. 제대로 있거나 잘못 장착 칩의 예는 (그림 5) 표시됩니다. 다른 증폭 신호와 제대로로드 칩 (그림 6)의 FAM 그림이 표시됩니다.
그 결과 적절한 셀 정렬 사전 증폭, 로딩 후에 ILC 성인 인구 야생형 마우스의 간에서의 유전자 발현 (도 7)에 대한 이종 나타나는 것을 보여준다. 온라인 소프트웨어, 세포 특이 유전자 발현 서명 (도 7 및 8) 및 세포군 관계 (도 8)를 사용하는 것이 확인 될 수 있었다. 각 정렬 인구는 유전자 발현이 풍부한 특정 유전자의 특성을 갖는다. 예를 들어, 세포가 NKp46로 분류 - IL-7Rα + 전자가Rorc, 3 군 ILCs의 주요 전사 인자의 nriched 표현; RORA하는 Rorc -homologous 전사 인자; 및 IL-23R과 Cxcr6, 간에서 그룹 3 ILC 간 마커의 두 가지 중요한 수용체. 같은 관측은 NKp46 + IL-7Rα로 만들 수 있습니다 - 그리고 NKp46 + IL-7Rα + 인구. 각 셀은 유효하지 않은 우물을 제외 하우스 키핑 유전자 발현 (HPRT, 법, 및 GAPDH)을 검사한다; 적어도 두 개의 하우스 키핑 유전자는 유효한 것으로 값을 고려하는 표현해야합니다.
흥미롭게도,이 기술은 NKp46 + IL-7Rα의 두 개체군의 정의를 허용 - 유전자 서명을 기반으로. 두 서명 간의 차이는 상이한 기능의 다른 세트의 실험에 의해 검증되어야한다.
![그림 2]("/files/ftp_upload/54858/54858fig2.jpg"/>)
그림 2 : FACS 세포 전략. 이미지는 4 주령 생쥐에서 분리 간세포 대표. (a) FSC-A / SSC-A 게이팅, (b) FSC-H / FSC-W 이중 차별 (C, D 및 E) 살아 계통 제외 CD45.2 + CD4 - CD3 - 게이팅 셀. - NKp46 + IL-7Rα +, 및 NKp46 - IL-7Rα + NKp46 + IL-7Rα : (f)에 널리 표현 ILC 세포 표면 마커를 사용하여, 우리는 세 인구를 정의했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5 : 제대로의 ROX 수치 (A) 부적절 (b) 칩을로드. (가) 제대로로드 단일 셀 다중 유전자 발현 칩은 직선과 행이 나타납니다. 각각의 반응 챔버는 가득 동일한 치수를 갖는다. (b)에 잘못로드 단일 셀 다중 유전자 발현 칩. 빈 라인과 반응 챔버의 행 (녹색 광장)뿐만 아니라, 벤딩 라인 (파란색 사각형)를 나타납니다. 이러한 기능은 부적절 "PRIME"또는 "LOAD"단계로 인해뿐만 아니라 IFC 우물에 잔류 거품에 할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6 : FAM 제대로로드 칩 (형광의 amidite) 그림. 몇주기 후 (샘플과 프라이머에 따라 ) 평가 S, 반응 챔버의 밝기의 차이가 나타납니다. 증폭 신호에 반응 챔버 없거나 낮은 증폭 신호 (녹색 광장)과의 반응 챔버보다 밝게 (파란색 사각형)을 표시해야한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 7 (a) 및 후 (b)의 수정 전의 열지. (a)에 직접 열지도 분석 또는 분석 / 샘플 주문의 수정없이 얻을. (b)에 수정 된 열지도 샘플 및 분석 이름 정의 후의. 더 증폭이 발생하지 않는 경우에는 입력 우물 (파란색 사각형)를 수득되지 않습니다. 비효율적 인 프라이머 (녹색 광장). cDNA를 희석 시험 (보라색 사각형). e.com/files/ftp_upload/54858/54858fig7large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 8 : 단일 세포 인구 클러스터링. 데이터 분석 소프트웨어 개체군의 클러스터를 결정하는 데 사용된다. 무료 클러스터링 소프트웨어는 온라인으로 사용할 수 있습니다. 단일 셀의 전체 발현 프로파일을 평가함으로써, 소프트웨어는 유전자 서명 및 세포군 관계를 표시 할 수있다. , 빨간 NKp46 + IL-7Rα +, 그리고 녹색 NKp46- IL-7Rα +입니다 - 블루 NKp46 + IL-7Rα 있습니다 : 각 사각형 셀을 나타냅니다. 각각의 인구는 특정 유전자 서명이있다. NKp46 + IL-7Rα 내 - 인구,이 서명은 인구의 이질성을 증명, 볼 수 있습니다.4858 / 54858fig8large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 프라이머 | |
| ACTB | IL-23R |
| AES | IL-2ra |
| AHR | IL-가 존재 함 |
| 에서 Bcl2 | II-7ra |
| C-myc의 | Klr5 |
| Cbfb | Lef1 |
| CD27 | Ncr1 |
| Cd49a | Nfil3 |
| Cd49b | Notch1 |
| CXCR5 | Notch2 |
| Cxcr6 | RORA |
| Eomes | Rorc |
| Ets1 | RUNX3 |
| Foxo1 | Tbx21 |
| GAPDH | Tcf3 |
| GATA3 | Tcf7 |
| GM-CSF | Tle1 |
| Hes1 | Tle3 |
| HPRT | Tsc22d3 |
| ID2 | Tnfrsf11a |
| IL-12rb2 | 독극물 |
| IL-18r1 | Zbtb16 |
| IL-1rl1 | Zbtb7b |
| IL-22 | |
표 1 : 프라이머 목록입니다.
표 2 : 사전 증폭 프로그램입니다. 사전 - 증폭 과정의 각 단계의 사이클 시간, 온도 및 횟수에 관한 완전한 정보를 나타낸다.
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Discussion
이 프로토콜은 클론 수준에서 완전한 유전자 발현 정보를 획득하는 방법을 설명한다. 여기, 우리가 간 ILC 함 이질성을 조사 하였다. (넓게 표현 ILC 표면 마커에 기초하여) 상이한 ILC 인구 단세포 정렬 후, 샘플을 특정 사전 선택된 유전자 사전 증폭 하였다. 이어서, 수득 된 cDNA와 프라이머를 멀티 플렉스 RT-qPCR의 마이크로 유체 칩 상에 로딩 하였다. 마지막으로, 우리는 48 하나의 세포에서 48 다른 유전자의 발현을 획득했습니다. 유전자 발현 결과 유전자 서명 및 세포 집단의 관계를 조사하는 온라인 소프트웨어를 통해 분석 하였다.
이 기술의 주요 장점은 동시에 다수의 유전자의 발현을 평가하는 기능이다. 또한 클론 수준에서 매우 드문 인구에 대한 작업을 할 수 있습니다. 유전자 발현 클론 수준으로 평가되기 때문에, 종래의 RT-qPCR의 방법과 달리, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에, 아니 평균화 효과가 없다. 그러므로, 집단 내의 얼룩이 검출 및 분석 될 수있다. 매우 소수의 세포가 유전자 발현에 대한 폭 넓은 정보를 얻기 위해 필요하기 때문에 단일 셀 RT-qPCR의 표현은 매우 드문 인구에 대한 작업을 할 수 있습니다. 또한, 세포 개체군은 같은 플레이트에서 테스트 될 수있다. 이것은 온라인 데이터 툴 세포군 관계의 평가에, 집단간에 유전자 서명 차이의 검출을 가능하게하고. 이 기술은 다른 이점을 제공한다. 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에가 최근 미세 진보의 이점을 갖는다. IFC 챔버에 필요한 볼륨은 나노 리터 수준을 초과하지 않습니다. 따라서, 낮은 시약의 양은 실험의 비용을 절감 사용된다. 마지막으로, 피펫 팅 단계의 전체 개수는 이에 피펫 오류의 가능성을 제한 감소된다. 단계는 모든 셀을 동시에하고 빠르고 시간 절약 방식으로 작업을 가능하게하는 멀티 채널 피펫으로 수행 될 수있다. 에서 얻어진 결과클론 레벨 신뢰성 재현하고, 강인 데이터 분석을 수행 할 수있다.
단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에, 그러나, 어떤 제한을 제시 않는다. 첫째로,이 기술은 마이크로 유체 칩, 마이크로 유체 칩 제어기, 특정 열 순환기로 고가 특정 장치를 필요로한다. 종래 RT-qPCR에 더불어 많은 연구가 통계적으로 의미있는 비교를 얻기 위해 필요하다 때문에 종래 RT-qPCR의 방법과는 달리,이 기술은 시간 및 시약 절감이다. 이 프로토콜에서, 우리는 48 유전자의 유전자 발현을 얻을 수있는 방법을 제시한다. 96-96 멀티 플렉스 RT-qPCR에 마이크로 유체 칩을 사용할 수 있습니다. 이러한 칩 동시에 96 셀 96 유전자의 유전자 발현을 평가할 수있다. 정밀 세포 순도 최대되어야하므로 셀 정렬 동안, 시작 셀의 최소 개수는 필요하다. 그러나, 세포 수가 적은, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR의 유전자 Exp를 정렬하는 것이 여전히 가능하다ression (단계 3). 마지막으로, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 민감한 방법이다. 다른 테스트는 실험을 시작하기 전에 수행해야합니다. 예를 들어, 프라이머 대상 특이성, 프라이머는 증폭 효율과 목표에 대한 상대적 경쟁 테스트해야합니다.
프로토콜의 여러 단계를주의하여 수행해야합니다. 피펫 실수의 위험을 증가시키는 동시에 시료와 분석을 다수 결합 소량의 조작을한다 (단계 1, 4, 5, 6, 7). 모든 시약과 혼합하여 균일 한 용액을 확보하기 위해 이전 피펫을 볼 텍싱한다. 사전 - 증폭 (단계 4) 동안 증발은 최종 결과에 영향을 미칠 수있다. 플레이트는 항상 제대로 적절한 커버 필름으로 밀봉해야한다. 전략을 정렬하면 판 내의 우물에서 죽은 세포 또는 여러 셀을 피하기 위해 매우 정확한 (3 단계)해야합니다. 기계를 정렬 FACS는 이제 단일 셀 정렬 공업을 갖추고 있습니다또한 각 분류 된 특정하는 세포 녹음 할 수 있습니다 전 소프트웨어. 이 새로운 툴 서명 유전자가 세포 표면 마커의 강도에 상관되는지 여부를 결정하기위한 관심이 될 것이다. 칩 샘플 분석 위치는이 실험에 필수적이기 때문에, 심하게 편성 (1 ~ 5 단계, 6)되어야한다. 최종적으로, 프라이머 (단계 1 및 6)의 선택은 중요한 단계이다. 모든 프라이머는 전술 한 결과 또는 예상 된 결과들에 기초하여 선택되어야한다. 평가 유전자의 프라이머 세트에서의 임의의 선택은 실험의 최종 판독을 방해 할 수있다. 또한, 세포 분류에 사용되는 세포 표면 마커 상관 관계 프라이머는 하우스 키핑 유전자와 대조군으로 사용되어야한다.
클론 수준에서 다중 유전자 발현을 평가하는 것은 기존 연구에 비해 간 ILC 이종 구획의 더 나은 특성을 제공합니다. 온라인 소프트웨어에 의해 공급이 기술은,보다 정확하게 설명 D단지 세포 표면 마커를 사용하여 연구보다 항상성에서 간에서 ILC의 ifferent 집합. 또한, 세포 집단의 관계를 고려 분화 네트워크를 구축 할 수있다. 단일 세포의 유전자 발현에 기초한 유전자 서명은 또한 세포 집단의 특성을 식별하고 잠재적 인 역할을 조사하기 위해 중요한 수단이다. 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 안정적인 데이터를 획득하는 유전자 발현 분석을위한 가장 좋은 방법 중 하나이다. 이러한 데이터는 생물 정보학 소프트웨어 (15)와 쉽게 관리 할 수 있습니다. 이러한 마이크로 어레이 또는 RNA 서열로서 유전자 발현 연구를위한 다른 기술들에 대해, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 고감도를 제공한다. 단일 세포 분석 다른 방법이 설명되어 있고, 단일 셀 멀티 플렉스 RT-qPCR에 (15, 16)로 보완 기술을 이용할 수있다. 또한,이 기술은 allowin 임의의 프라이머의 조합으로 수행 될 수있다g 사용자는 개인 유전자 서명을 볼 수 있습니다. 많은 다른 애플리케이션이 기술을 사용할 수있다. 예를 들면, 현상에 걸쳐 세포의 시간 코스 유전자 발현이 발달 동안에 분자 프로파일의 변형을 평가하기 위해 수행 될 수있다. 세포에 대한 약물의 효과는 유전자 발현에 약물 효율 임계치를 결정하는 약물 희석액으로 조사 할 수있다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cells Direct One Step qRT-PCR kit | Applied Biosystems | 11753100 | Primer probe detection kit.Contains 2x reaction mix, SSIII Platinium enzyme. |
| Low TE EDTA Buffer | Affymetrix | 75793 100ML | |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| Cover film | Dominique Dutscher | 106570 | aluminium cover film; avoid contamination and evaporation |
| Actb | Thermofisher Scientific | Mm00607939_s1 | 20x primer |
| Aes | Thermofisher Scientific | Mm01148854_s1 | 20x primer |
| Ahr | Thermofisher Scientific | Mm00478932_s1 | 20x primer |
| Bcl2 | Thermofisher Scientific | Mm00477631_s1 | 20x primer |
| c-myc | Thermofisher Scientific | Mm00487804_s1 | 20x primer |
| Cbfb | Thermofisher Scientific | Mm01251026_s1 | 20x primer |
| Cd27 | Thermofisher Scientific | Mm01185212_s1 | 20x primer |
| Cd49a | Thermofisher Scientific | Mm01306375_s1 | 20x primer |
| CD49b | Thermofisher Scientific | Mm00434371_s1 | 20x primer |
| Cxcr5 | Thermofisher Scientific | Mm00432086_s1 | 20x primer |
| Cxcr6 | Thermofisher Scientific | Mm02620517_s1 | 20x primer |
| Eomes | Thermofisher Scientific | Mm01351985_s1 | 20x primer |
| Ets1 | Thermofisher Scientific | Mm01175819_s1 | 20x primer |
| Foxo1 | Thermofisher Scientific | Mm00490672_s1 | 20x primer |
| Gapdh | Thermofisher Scientific | Mm03302249_s1 | 20x primer |
| Gata3 | Thermofisher Scientific | Mm00484683_s1 | 20x primer |
| Gm-csf | Thermofisher Scientific | Mm01136644_s1 | 20x primer |
| Hes1 | Thermofisher Scientific | Mm01342805_s1 | 20x primer |
| Hprt | Thermofisher Scientific | Mm00446968_s1 | 20x primer |
| Id2 | Thermofisher Scientific | Mm01293217_s1 | 20x primer |
| Il-12rb2 | Thermofisher Scientific | Mm00711781_s1 | 20x primer |
| Il-18r1 | Thermofisher Scientific | Mm00515178_s1 | 20x primer |
| Il-1rl1 | Thermofisher Scientific | Mm00434237_s1 | 20x primer |
| Il-22 | Thermofisher Scientific | Mm001226722_s1 | 20x primer |
| Il-23r | Thermofisher Scientific | Mm00519943_s1 | 20x primer |
| Il-2ra | Thermofisher Scientific | Mm01340213_s1 | 20x primer |
| Il-2rb | Thermofisher Scientific | Mm01195267_s1 | 20x primer |
| IL-7r | Thermofisher Scientific | Mm00434295_s1 | 20x primer |
| Klr5 | Thermofisher Scientific | Mm04207528_s1 | 20x primer |
| Lef1 | Thermofisher Scientific | Mm00550265_s1 | 20x primer |
| Ncr1 | Thermofisher Scientific | Mm01337324_s1 | 20x primer |
| Nfil3 | Thermofisher Scientific | Mm01339838_s1 | 20x primer |
| Notch1 | Thermofisher Scientific | Mm00435249_s1 | 20x primer |
| Notch2 | Thermofisher Scientific | Mm00803069_s1 | 20x primer |
| Rora | Thermofisher Scientific | Mm01173766_s1 | 20x primer |
| Rorc | Thermofisher Scientific | Mm01261022_s1 | 20x primer |
| Runx3 | Thermofisher Scientific | Mm00490666_s1 | 20x primer |
| Tbx21 | Thermofisher Scientific | Mm01299453_s1 | 20x primer |
| Tcf3 | Thermofisher Scientific | Mm01175588_s1 | 20x primer |
| Tcf7 | Thermofisher Scientific | Mm00493445_s1 | 20x primer |
| Tle1 | Thermofisher Scientific | Mm00495643_s1 | 20x primer |
| Tle3 | Thermofisher Scientific | Mm00437097_s1 | 20x primer |
| Tsc22d3 | Thermofisher Scientific | Mm01306210_s1 | 20x primer |
| Tnfrsf11a | Thermofisher Scientific | Mm00437132_s1 | 20x primer |
| Tox | Thermofisher Scientific | Mm00455231_s1 | 20x primer |
| Zbtb16 | Thermofisher Scientific | Mm01176868_s1 | 20x primer |
| Zbtb7b | Thermofisher Scientific | Mm00784709_s1 | 20x primer |
| qPCR Master mix | Applied BioSystems | P/N 4304437 | |
| 2x Assay Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000736 | Specific density medium to load assays in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 2x Sample Loading Reagent | Fluidigm | P/N 85000735 | Specific density medium to load samples in multiplex RT-qPCR microfluidic chip. |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip | Fluidigm | BMK-M-48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC for Gene Expression;chip for single cell multiplex RT-qPCR reaction |
| 48.48 mutliplex RT qPCR microfluidic chip controller | Fluidigm | 89000020 | 48.48 IFC Controller; control the chip internal fluidic system, load samples and assays in reaction chambers |
| mutliplex RT qPCR microfluidic thermocycler | Fluidigm | GE48.48 | 48.48 Dynamic Array IFC thermocycler |
| 96-well plates | Thermofisher Scientific | AB 1100 | 96-well plates adapted for cell sorting and thermocycling |
| C57Bl/6 mice | Janvier | C57Bl/6 miceJ@RJ | |
| 10 ml syringe | BD Biosciences | 309639 | |
| PBS | Life Technologies | 14040174 | |
| HBSS | Life Technologies | 24020133 | |
| RPMI | Life Technologies | 61870044 | |
| FCS | CVFSVF000U | Eurobio Abcys | Standard fetal calf serum |
| Potter tube | N/A | ||
| 15 ml tube | Corning | 352097 | |
| 1.5 ml tube | Sigma-Aldrich | T9661-1000EA | |
| FACS machine | N/A | ||
| centrifuge | Thermofisher Scientific | 75004538 | |
| 1,000 µl tips | Fisher Scientific | 10313272 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| Percoll | Dominique Dutscher | 17-0891-01 | |
| Facs tube | Falcon | 352235 | |
| anti-CD8 Biotin mouse antibody | Sony | 1103520 | lineage antibody |
| anti-CD19 Biotin mouse antibody | Sony | 1177520 | lineage antibody |
| anti-TCRab Biotin mouse antibody | BioLegend | 109204 | lineage antibody |
| anti-TCRgd Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553176 | lineage antibody |
| anti-Ter119 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553672 | lineage antibody |
| anti-Gr1 Biotin mouse antibody | BD Biosciences | 553125 | lineage antibody |
| anti-CD45.2 PerCPCy5.5 mouse antibody | BioLegend | 109828 | |
| anti-IL7ra PeCy7 mouse antibody | ebioSciences | 25-1271-82 | |
| anti-CD3 BV510 mouse antibody | BD Biosciences | 563024 | |
| anti-CD4 BV786 mouse antibody | BD Biosciences | 563727 | |
| anti-NKp46 PE mouse antibody | ebioSciences | 12-3351-82 | |
| Streptavidin | Sony | 2626025 | |
| Propidium Iodide | Sigma-Aldrich | P4864-10ML | |
| Electronic pipette | Eppendorf | 4986000017 | |
| Combitips 0.1 ml | Eppendorf | 30089405 | |
| Multichannel pipette | Rainin | L8-10XLS+ | |
| Accudrop | BD Biosciences | 345249 | verification beads for FACS |
References
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