Summary
تضيق بعد إجراءات القلب والأوعية الدموية (جراحة الالتفافية، قسطرة، أو الدعامات) هو مشكلة كبيرة تقلل من متانة هذه الإجراءات. العلاج المثالي من شأنه أن تمنع الخلايا العضلية الملساء (فسمك) انتشار مع تعزيز تجديد البطانة. نحن تصف نموذجا للتقييم في وقت واحد من انتشار فسمك والوظيفة البطانية في الجسم الحي.
Abstract
إعادة بناء الشرايين، سواء قسطرة أو جراحة الالتفافية، ينطوي على صدمة علاجي المنشأ تسبب اضطراب البطانية والأوعية الدموية الخلايا الملساء العضلات (فسمك) انتشار. نماذج الفئران الشائعة دراسة السفن الصغيرة مثل الشرايين السباتية والفخذية. هنا نحن تصف نظام في الجسم الحي الذي كل من انتشار فسمك والوظيفة حاجز بطانية يمكن تقييمها في وقت واحد في وعاء كبير. درسنا استجابة الأبهر إنفرارينال للإصابة في C57BL / 6 الفئران. أصيب الشريان الأورطي من الوريد الكلوي الأيسر إلى التشعب الأبهر بواسطة 30 سحق ترانزميورال من 5 ثوان مدة مع قضيب القطن ذات الرؤوس. تم تقييم التغيرات المورفولوجية مع الأنسجة التقليدية. تم قياس سمك الجدار الأبهر من سطح اللمعية إلى أدفنتيتيا. تم استخدام إيدو التكامل ومكافحة تلطيخ مع دابي وألفا أكتين لإثبات انتشار فسمك. تنشيط ERK1 / 2، وهو مشرف معروف من تشكيل تضخم باطنة، وردعالملغومة بواسطة تحليل لطخة الغربية. تم تحديد تأثير الالتهاب بواسطة المناعية للخلايا البائية، والخلايا التائية، والضامة . في مواجهة أقسام من البطانة تم تصور مع المجهر الإلكتروني المسح (سيم). تم تحديد وظيفة الحاجز البطانية مع تلطيخ ايفانز الأزرق. أسفرت إصابات ترانسمورال في سماكة الجدار الأبهر. هذه الإصابة الناجم عن انتشار فسمك، والأكثر بروزا في 3 أيام بعد الإصابة، والتفعيل المبكر ل ERK1 / 2 وانخفض التعبير p27 kip1. لم تسبب الإصابة في زيادة خلايا B، خلايا T، أو تسلل الضامة في جدار الوعاء الدموي. تسببت إصابة جزئية البطانية خلية التعكر وفقدان خلية الخلية الاتصال. أسفرت الإصابة عن خسارة كبيرة في وظيفة الحاجز البطانية، والتي عادت إلى خط الأساس بعد سبعة أيام. يوفر نموذج إصابة الشريان الأبهر حادة الفئران نظام فعال لدراسة في وقت واحد على حد سواء انتشار فسمك وظيفة الحاجز البطانية في وعاء كبير.
Introduction
عودة التضيق في أعقاب إجراءات القلب والأوعية الدموية (جراحة الالتفافية، قسطرة، أو الدعامات) هي مشكلة كبيرة تقلل من متانة هذه الإجراءات. يعاني جميع عمليات إعادة التوعي من إعادة التضيق. الاستراتيجيات الحالية لمنع تضيق (الدعامات التي تطلق على المخدرات والبالونات المغلفة المخدرات) تمنع كل من خلايا العضلات الملساء الوعائية (فسمك) وتكاثر الخلايا البطانية (إيك). وبالتالي، فإن هذه التدخلات منع فسمك بوساطة تضيق، ولكن أيضا منع تجديد البطانة. دون بطانة سليمة، والمطلوب من المرضى أن يكون على وكلاء مضاد للصفيحات قوية للحد من خطر تخثر في الموقع في خطر حدوث مضاعفات النزيف. العلاج المثالي من شأنه أن يمنع انتشار فسمك مع تعزيز تجديد البطانة. وهكذا، هناك حاجة إلى دراسة في وقت واحد انتشار فسمك والحاجز البطانية وظيفة ط ن فيفو .
في الوقت الحاضر، هناك قطعنماذج الفأر من تضيق 1 . وتشمل هذه النماذج ربط السباتي وإصابة سلك الشريان الفخذي 2 . وتشمل نماذج الأبهر وضع الدعامة 3 ، إصابة البالون 4 ، والأبهر مزروع 5 . جميع النماذج الحالية محدودة. ربط السباتي يولد آفة نيوينتيمال بوساطة تدفق وليس لديها إصابة بطانية. بالإضافة إلى ذلك، كل من الشرايين السباتية والفخذية لديها العديد من أضعاف طبقات الخلايا أقل من الأوعية البشرية، مما يحد من قيمتها متعدية. الشريان الأورطي الماوس الذي هو ما يقرب من 1.3 ملم في القطر، هو السفينة الوحيدة التي تقترب سريريا ذات الصلة (الشريان التاجي) الشريان البشري (3).
على الرغم من إمكانيات متعدية من النماذج الأبهرية الفئران من المرض، والنماذج الحالية لديها قيود. هذه النماذج تتطلب المهارات المجهرية المتقدمة والمعدات المتخصصة مثل بالونات الأوعية الدموية والدعامات. هنا، نقدمرواية، تقنية استنساخ لحث في وقت واحد انتشار فسمك وتعطيل وظيفة الحاجز البطانية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
بيان الأخلاق: تمت الموافقة على بروتوكولات التعامل مع الحيوانات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام (إاكوك) من جامعة ماريلاند (بروتوكول رقم 0416009) وأجريت وفقا لمعايير آلاك الدولية.
1. الإجراء الجراحي
- تقنية التخدير
- تعقيم جميع الأدوات المستخدمة في جراحة البقاء على قيد الحياة مع التعقيم بالبخار عند 121 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
- تخدير التخدير عن طريق خزان الحث مع 100٪ O 2 و 2.5٪ إيسوفلوران تسليمها عن طريق المرذاذ الدقة. بعد الحث، وقف إيسوفلوران ودافق الغرفة مع O 2 . الحفاظ على التخدير مع 1.5-2٪ إيسوفلوران عن طريق قناع الوجه و 1 L / دقيقة O 2 عن طريق الاستنشاق.
- إرفاق كل من غرفة التعريفي وقناع الوجه إلى زبال الفحم ل امتزاز الغاز النفايات لحماية الموظفين. ضمان مستوى مخدر كاف من قبل ديمونترمع عدم وجود استجابة للمؤثرات الضارة (أخمص القدمين قرصة).
- إنشاء حقل منطوق يتكون من علبة جراحية مع وسادة متساوية الحرارة لتوفير الدعم الحراري أثناء الجراحة. وهناك وسادة متساوية الحرارة إضافية توفر الدعم الحراري للحيوانات في قفص الانتعاش بهم.
- إعداد الحيوان
- إجراء التحقيق التالية على 10-12 أسابيع من العمر الذكور C57BL / 6 الفئران.
- إزالة الشعر على سطح بطني البطن من الحيوان من القص إلى المنطقة الإربية مع وكيل مزيل الشعر أو المقص الكهربائية مع عدد 40 شفرة.
- في حالة وكيل مزيل الشعر، وتطبيق هذا المركب إلى منطقة الجراحية لمدة 2-3 دقائق ثم إزالته مع القطن. نحن نستخدم مركب متاح تجاريا من هيدروكسيد الكالسيوم وهيدروكسيد الصوديوم.
- الإعدادية المنطقة على الكتف مع 70٪ الكحول وحقن تحت الجلد كاربروفين (5 ملغ / كلغ) مع 25 قياس أو أصغر إبرة تتحمل. هذهوالعلاج توفر تسكين بعد العملية الجراحية للحيوان.
- نقل الحيوان إلى الحقل الجراحي وموقف في الاستلقاء الظهري.
- إعداد الموقع الجراحي عن طريق الغسل 8-12٪ بروفيد اليود مع قضيب القطن نظيفة أو القطن الشاش. ثم شطف الجلد مرتين مع الكحول 70٪.
- مكان زيوت التشحيم العين في كلا العينين للحد من حدوث جفاف القرنية. تغطية الموقع الجراحي مع ثنى العقيمة.
- تقنية المنطوق
- جعل وسط البطن البطن شق حوالي 2-2.5 سم في الطول مع مشرط بداية الذيلية فورا عملية الخنجري وتمتد نحو الحوض.
- حشد الأمعاء الدقيقة والاثني عشر وتعكس أفقيا إلى اليمين. نشمر شريط من القطن معقمة معقمة وغارقة مع محلول ملحي معقم للحقن للسماح للتعبئة من الأحشاء لتحسين التعرض.
- مع الأمعاء الدقيقة حشدت إلى الجانب الأيمن منالبطن، وفضح خلف الصفاق و فضح الشريان الأورطي البطني من الوريد الكلوي الأيسر إلى التشعب الأبهر ( الشكل 1 ).
- مع قضيب معقمة القطن ذات الرؤوس، وتقديم 30 سحق متتالية، كل خمس ثوان في المدة.
- إزالة التعبئة والسماح للأحشاء للعودة إلى وضعهم الأصلي.
- إغلاق اللفافة مع تشغيل 4-0 خياطة حيدة لامتصاص (بوليديوكسانون). يتم إغلاق الجلد مع تشغيل 6-0 غير قابلة للامتصاص خياطة حيدة (النايلون).
- الإنعاش والرعاية ما بعد الإجراءات
- بعد هذا الإجراء، ضع الحيوان في قفص الانتعاش مع الفراش نظيفة على وسادة متساوية الحرارة لمواصلة الدعم الحراري حتى الحيوان قادر على أمبولات بشكل طبيعي. لا تترك الحيوان غير المراقب حتى أنه يدل على القدرة على الحفاظ على الاستلقاء القصية.
- مراقبة الحيوان كل ساعة لمدة 4 ساعات الأولى بعد الجراحة. مرة واحدة في الحيوان هو الإسعاف العودة عادة ط t إلى غرفة التربية المخصصة. لن يتم إيواء الحيوان في شركة حيوان آخر حتى تعافى تماما.
- مراقبة الحيوان مرتين يوميا لمدة 72 ساعة الأولى بعد الجراحة و 3 مرات على الأقل في الأسبوع بعد ذلك. ويشمل الرصد وزن الحيوان ثلاث مرات في الأسبوع.
- إدارة كاربوفين (5 ملغ / كلغ) تحت الجلد مرتين يوميا لأول 72 ساعة بعد الجراحة.
2. شراء الأنسجة
- طريقة القتل الرحيم
- الموت ببطء الحيوانات في نقاط زمنية محددة سلفا.
- تخدير التخدير عن طريق خزان الحث مع 100٪ O 2 و 2.5٪ إيسوفلوران تسليمها عن طريق المرذاذ الدقة.
- لدراسة سلامة البطانة، إدارة إيفانز الأزرق صبغ للحيوان.
ملاحظة: ايفانز الأزرق هو صبغ أزو سالبة مشحونة مع تقارب ملزمة عالية لالزلال، ويمكن فقط وصمة عار الأوعية الدموية في غياب بطانة سليمةs = "كريف"> 6. - لدراسات سلامة البطانية، في وقت القتل الرحيم، يروي الحيوانات مع 5 مل من 0.3٪ ايفانز الأزرق صبغ تليها 5 مل بس في الضغط الفسيولوجي لمدة 5 دقائق. يتم الحفاظ على الحيوان في طائرة جراحية من التخدير أثناء إجراء نضح.
- لدراسة سلامة البطانة، إدارة إيفانز الأزرق صبغ للحيوان.
- بعد تحقيق مستوى مخدر عميق، فتح الصدر مع القص. جعل تهتك في الأذين الأيمن للسماح تصريف الدم من الحيوان والوصول إلى البطين الأيسر هو الوصول مع إبرة 21 G وحقن الفوسفات مخزنة المالحة (بس) حتى النفايات السائلة من الأذين الأيمن واضح.
- بعد نضح مع برنامج تلفزيوني، أدخل البطن من خلال شق خط الوسط.
- مرة أخرى، وتعبئة الأمعاء الدقيقة إلى الجانب الأيمن من البطن تعريض الشريان الأورطي إنفرارينال، تشريح حاد الشريان الأبهر من الأنسجة المجاورة والخصم من الوريد الكلوي الأيسر إلى التشعب الأبهر.
- تخزين الشريان الأورطي استئصال في بارافورمالد 4٪حل إهيد حتى يحدث معالجة الأنسجة.
- لدراسات سلامة البطانية، وفتح الشريان الأبهر طوليا وتعلق عليه إلى ورقة الشمع تعريض كامل سطح اللمعية 6 . إجراء تقييم نوعي للسلامة البطانية من قبل درجة تلطيخ مع ايفانز الأزرق صبغ 6 .
- لفحوصات نسيجية أخرى، قسم الشريان الأورطي عرضية وتضمينها في درجة حرارة القطع الأمثل (أكتوبر) المركبات كما تمليها الطريقة النسيجية لاستخدامها 7 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
عرضت الشريان الأورطي عرضية جزءا لا يتجزأ من أكتوبر مقطوع، وملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين ثم مكافحة ملطخة فيرهويف فان جيسون (ففغ) وصمة عار لتحديد الصفيحة المرنة الداخلية والخارجية 7 . إصابة سحق الناجم عن سماكة الأبهر سماكة بالمقارنة مع أورتاس من الحيوانات تعامل مع إجراء صورية (البطن وتعبئة الأمعاء الدقيقة وحدها). سمك الجدار، كما تم تقييمه من قبل المسافة من البرانية إلى التجويف، وكان أعظم ثلاثة أيام بعد الإصابة (42.2 ± 1.7 ميكرون مقابل 22.1 ± 1.1 ميكرون لبطن وحده) ( الشكل 2A-B ). أسفرت الإصابات في الخلايا وجود مظهر أكثر تنوعا وكفاف غير منتظم من سطح اللمعية ( الشكل 2C ).
زيادة سماكة الجدار من الشريان الأبهر المصاب على الأقل في جزء بوساطة زيادة انتشار الأوعية الدموية السلس موسي الأوعية الدمويةخلايا كلي. لإثبات أن سماكة الجدار ويرجع ذلك إلى زيادة الانتشار بدلا من تضخم الخلايا، استخدمنا فحص انتشار إيدو. في هذا الاختبار، تدار ثيميدين التناظرية 5-إثينيل-2'-ديوكسيوريدين (إيدو) عن طريق الوريد إلى الماوس 24 ساعة قبل القتل الرحيم. يتم دمج إيدو في الحمض النووي أثناء التوليف. تم الكشف عن إيدو عن طريق رد فعل رد فعل (النحاس محفزة أزيد-ألكاين سيكلواديتيون باستخدام صبغة الفلورسنت الأخضر) 8 . الفئران الشام تتعرض فقط إلى البطن لم يلاحظ أي مضان في أي طبقة من الشريان الأبهر. كونفيرسلي، الفئران عرضة للإصابة الأبهر أظهرت مضان في كل من وسائل الإعلام و البطانية من الشريان الأبهر ( الشكل 3 ).
سماكة الأبهر سماكة بعد إصابة سحق ينشط مسارات الإشارات الخلية تورط في تضيق في البشر. كيناز البروتين المنشط الميثان (ماب كيناس) ERK1 / 2 هي واحدة من وسطاء المبدأ من تضخم باطنة تشكيلردا على التحفيز من ميتوجين، ERK1 / 2 هو فوسفهوريلاتد وتنشيط 9 ، 10 . وقد أظهرت البيانات من مختبرنا أيضا أن مثبط كيناز تعتمد على سيكلين p27 kip1 انخفض ردا على المحفزات ميتوجينيك في جدار الوعاء 12 . تم الموت الرحيم الفئران في 1، 3، 7 أيام، و 1 شهر بعد إصابة سحق الأبهر. تم عزل الشريان الأورطي إنفرارينال وتعبير البروتين من ERK1 / 2، فوسفهو-ERK1 / 2 (الشكل المنشط من ERK1 / 2)، و سيكلين تعتمد كيناز المانع p27 kip1 تم تحديدها من قبل تحليل لطخة غربية ( الشكل 4A ). لم يلاحظ أي تغيير في إجمالي التعبير البروتين ERK1 / 2 مع مرور الوقت. ومع ذلك، بعد ثلاثة أيام من الإصابة، وكان فوسفهو-ERK1 / 2 (بي-ERK1 / 2) التعبير أكثر من 200٪ أكبر من خط الأساس بي-ERK1 / 2 التعبير. p27 kip1 التعبير انخفض في وقت مبكر نقطة وصلت إلى نظير حوالي 20٪ من خط الأساس سبعة أيام أفتر إصابة. كلا بي-ERK1 / 2 و p27 kip1 التعبير تقريب مستويات خط الأساس بعد شهر واحد من الإصابة ( الشكل 4B ). وبالتالي فإن سماكة لوحظ من الجدار الأبهر هو على الأقل جزئيا بسبب زيادة انتشار الإنسي.
نموذج إصابة الأبهر يسمح بتقييم في وقت واحد من كل من الإنسي انتشار العضلات الملساء وظيفة الحاجز البطانية. وقد استخدم المسح المجهري الإلكتروني (سيم) لتوصيف تأثير إصابة سحق على مورفولوجيا البطانة. يصطف سطح اللمعية من الشريان الأورطي بواسطة متموجة، البطانة التي تمنع التصاق الخلايا المولدة للدم والجزيئات ( الشكل 5A ، شريط مقياس = 100 ميكرون). في المقابل، نتائج إصابة سحق في اضطراب الخلايا البطانية والنداء الجزئي من البطانة ( الشكل 5B ، شريط مقياس = 100 ميكرون). كما رأينا في التكبير العالي، وتعطيل نتائج البطانة في الالتصاقعلى جسيمات متسقة في الحجم والشكل مع الصفائح الدموية. التصاق هذه الجسيمات يحدث في جميع أنحاء المنطقة بأكملها من الإصابات، ولا يقتصر على مناطق من التعكر الإجمالي لوحظ في أقل التكبير ( الشكل 5C ، شريط مقياس = 50 ميكرون). ويلاحظ أفضل من مورفولوجيا الجسيمات الملتصقة في التكبير العالي. هذه الجسيمات تتفق مع الصفائح الدموية والفيبرين ( الشكل 5D ، شريط مقياس = 10 ميكرون).
بالإضافة إلى مورفولوجيا البطانية، وظيفة الحاجز من البطانة يمكن تقييمها مع هذا النموذج من إصابة الأوعية الدموية. صبغ أزو إيفانز الأزرق لا يمكن أن تتخلل الطبيعي، بطانة سليمة من الشريان الأورطي الفئران. الأضرار التي لحقت وظيفة الحاجز من البطانة يسمح تلطيخ الغشاء القاعدي مع ايفانز الأزرق. الفئران المعالجة إلى البطن وحده (الشام) حافظت على وظيفة حاجز من البطانة وهذه أورتاس كانت بيضاء. أسفرت إصابة سحق فيفقدان منتشر وظيفة الحاجز البطانية وهذه أورتاس الملون الأزرق الداكن. شدة تلطيخ مع ايفانز الأزرق انخفض بعد ثلاثة أيام من إصابة سحق، واستعاد وظيفة الحاجز الكامل في الأسبوع بعد الإصابة ( الشكل 6A ). وظيفة حاجز بطانية يمكن مزيد كوانتيتاتد عن طريق وزن العينات وتجانس في حجم 10 أضعاف من 50٪ محلول حمض ثلاثي كلورواسيتيك. تمييع طاف في 4 أضعاف الإيثانول يسمح لتحديد كثافة مضان (الإثارة 620 نانومتر وانبعاث 680 نانومتر) كما هو موضح من قبل أوكي وآخرون . 11 - كان كمية إيفانز الأزرق المغطاة من الشريان الأورطي إنفرارينال أكثر من ثلاثة أضعاف أعلى في أورتاس مباشرة بعد الإصابة مقارنة أورتاس يتعرض فقط إلى البطن (إصابة - يوم 0). استمر الشريان الأورطي في وصمة عار مع ايفانز الأزرق في واحد وثلاثة أيام بعد الإصابة، ولكن أقل كثافة مما كانت عليه في وقت الإصابة، مما يشير إلى الانتعاش التدريجي من وظيفة الحاجز البطانية. أسبوع واحد في الخلفإيه إصابة الشريان الأورطي المصاب تلطيخ يعادل كما الشريان الأورطي تعامل مع البطن وحده ( الشكل 6B ).
الشكل 1: يتم إنشاء إصابة عن طريق سحق بصراحة الشريان الأبهر من الوريد الكلوي الأيسر إلى التشعب الأبهر. الشكل تكييفها مع إذن من يو وآخرون ، بلوس واحد 2015 12 . الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: إصابة سحق يحفز الأبهر سماكة الجدار. ( A ) سحق إصابة التغيرات المورفولوجية الناجمة في الشريان الأبهر. تم ملطخة ممثل 5 ميكرون المقاطع العرضية مع ففغ في 0،1، 3 و 7 أيام بعد الإصابة. مقياس الحانات = 100 ميكرون. ( ب ) كان سمك الجدار أعظم 3 أيام بعد الإصابة، 42.2 ± 1.7 ميكرون، وكان أكبر بكثير من الشريان الأورطي من الحيوانات المصورة المعرضة لفرط البطن وحده، 22.1 ± 1.1 ميكرون. وقد تم تحديد الدلالة الإحصائية مع اختبار t ثنائي الطالب. * يشير إلى P <0.05، ن = 3. ( C ) إصابة سحق يسببها ظهور مدورة من فسمكس الإنسي (ملون باللون الأخضر ل أكتين العضلات α السلس) وتغيير اتجاه الخلية. كانت كونترستيند نوى مع دابي (الأزرق). مقياس الحانات = 10 ميكرون. وتعرض البيانات باعتبارها وسيلة وانحرافات معيارية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: إصابة سحق يحفز بروليف الخليةحصص في الجدار الأبهر. وتعرضت الفئران إما لاباروتومي وحدها (الشام) أو البطن مع إصابة سحق الأبهر. ثيميدين التناظرية 5-إثينيل-2'-ديوكسيوريدين (إيدو) كانت تدار 24 ساعة قبل القتل الرحيم. يتم دمج إيدو في الحمض النووي أثناء التوليف. تم الكشف عن إيدو عن طريق رد فعل النقر (النحاس محفزة أزيد-ألكاين سيكلواديتيون باستخدام صبغة الفلورسنت الأخضر). لم يكن هناك إيدو كشف (الأخضر) في الجدار الأبهر من الحيوانات الشام. في الحيوانات التي تعرضت لإصابة سحق، إيدو ملطخة بشكل بارز في وسائل الإعلام من الشريان الأورطي وإلى درجة أقل إلى حد ما في البطانية. تم تحديد خلايا العضلات الملساء الوعائية عن طريق تلطيخ مع الأجسام المضادة أكتين العضلات α السلس (الأحمر). وتشير هذه النتيجة إلى أن سماكة الجدار لوحظ في الشكل 2 ويرجع ذلك إلى زيادة في تكاثر الخلايا. مقياس الحانات = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكله.
الشكل 4: تنشيط كينتوز البروتين المنشط كيناس (ماب كيناس) المسار في الاستجابة لإصابة سحق. ( A ) ماب كيناس ERK1 / 2 هو فسفوريلاتد عند تفعيله ويرتبط مع تضخم باطنة وتضيق. تم الموت الرحيم الفئران في 1، 3، 7 أيام، و 1 شهر بعد إصابة سحق الأبهر. تم استخدام تحليل لطخة غربية لتقييم تعبير البروتين من إجمالي ERK1 / 2، فوسفهو-ERK1 / 2، و سيكلين تعتمد كيناز المانع p27 kip1 . تم تطبيع التعبير البروتين إلى حيوان شام تعامل مع البطن وحده. ( B ) لوحظ أي تغيير في إجمالي التعبير البروتين ERK1 / 2 مع مرور الوقت. ومع ذلك، بعد ثلاثة أيام من الإصابة، وكان فوسفهو-ERK1 / 2 (بي-ERK1 / 2) التعبير أكثر من 200٪ أكبر من خط الأساس بي-ERK1 / 2 التعبير. انخفض p27 kip1 التعبير في وقت مبكر نقطة أ(د) وصلت إلى ما يقرب من 20٪ من خط الأساس بعد سبعة أيام من الإصابة. كل من بي-ERK1 / 2 و p27 kip1 التعبير تقريب مستويات خط الأساس بعد شهر واحد من الإصابة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. إصابة سحق تعطل الخلايا البطانية الأبهري. ( A ) تم استخدام المجهر الإلكتروني المجهر (سيم) لتوصيف تأثير إصابة سحق على مورفولوجيا البطانة. ويصطف سطح اللمعية من الشريان الأورطي العادي من قبل متموجة، البطانة التي تمنع التصاق الخلايا المولدة في الدم والجزيئات. ( ب ) النتائج إصابة سحق في اضطراب الخلايا البطانية والنداء الجزئي من البطانة. ( C ) كما رأينا في أعلى ماغنيفيكافإن تعطل نتائج البطانة يؤدي إلى تصاق الجسيمات المتسقة في الحجم والشكل مع الصفائح الدموية. يحدث الالتصاق من هذه الجسيمات في جميع أنحاء المنطقة بأكملها من الإصابة، ولا يقتصر على مناطق من التعكر الإجمالي لوحظ في التكبير أقل. ( D ) في التكبير العالي، وهذه الجسيمات تتفق مع الصفائح الدموية والفيبرين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: إصابة الأبهري بلانت يسمح الكمي من وظيفة الحاجز البطانية. ( A ) الأضرار التي لحقت وظيفة حاجز من البطانة يسمح تلطيخ الغشاء القاعدي مع صبغة إيفانز الأزرق. الفئران المعالجة إلى البطن وحده (الشام) حافظت على وظيفة حاجز من البطانة والثالثةكانت أورتاس إيس الأبيض. تسبب إصابة سحق في فقدان منتشر وظيفة الحاجز البطانية وهذه أورتاس الملون الأزرق الداكن. وقد انخفضت كثافة تلطيخ مع ايفانز الأزرق بعد ثلاثة أيام من إصابة سحق، وتم استعادة وظيفة الحاجز الكامل في الأسبوع بعد الإصابة. ( B ) كان إضفاء ملزم ايفانز الأزرق إلى الشريان الأورطي إنفرارينال كوانتيتاتد عن طريق التصفية ايفانز الأزرق من العينة والتقدير الكمي من قبل كثافة مضان. وتعرض البيانات باعتبارها وسيلة وانحرافات معيارية. وكان معظم إيفانز الأزرق إلوتد من الشريان الأورطي مباشرة بعد سحق الاصابة. في وقت الإصابة، الشريان الأبهر ملزمة أكثر من ثلاثة أضعاف مرات أكثر إيفانز الأزرق من الشريان الأورطي يتعرض لاباروتومي وحدها. كما سمح الشريان الأورطي لاسترداد، كان هناك أقل ملزمة في واحد وثلاثة أيام بعد الإصابة. بعد أسبوع واحد من الإصابة، الشريان الأورطي ملزمة بنفس المقدار من ايفانز الأزرق كما أورتاس تعرض لبطن وحده. وقد تم تحديد الدلالة الإحصائية مع اختبار t ثنائي الطالب. * ديالملاحظات p <0.05، n = 3، نس تشير إلى أنه ليس كبيرا. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لقد تميزت آثار نموذج إصابة الأبهر الفئران الذي يؤدي إلى تضخم الإنسي وخلل الحاجز البطانية. كرت مفرزة إيك الجزئية على طول الشريان الأورطي البطانية فقدان الاتصال خلية خلية وتعزيز نتوءات الخلية. في المقابل، ضعف وظيفة الحاجز البطانية بشكل ملحوظ، مما حفز مسارات الإشارات الحساسة للميتوجين، مما يؤدي إلى انتشار فسمكس وسماكة جدار الوعاء الدموي. نقاط القوة لهذا النموذج هو أنه من الناحية الفنية أسهل للتعلم وتنفيذ من النماذج الأبهر الأخرى من المرض ويسمح للتقييم في وقت واحد من كل من الاستجابة التكاثري للإصابة والوظيفة البطانية. الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هو إصابة سحق الفعلي. التقلب في مدى إصابة سحق يمكن أن يؤدي إلى درجات متفاوتة من الإصابة وبالتالي متغير كميات العضلات الملساء تكاثر الخلايا. واحدة من الخطوات التي تقلل من هذا التغير في المختبر لدينا هو أن يكون واحد قسينيتيست، أعمى للعلاج أو حالة تجريبية، أداء جميع الإصابات سحق.
الحد من هذا النموذج هو تعميمه لعمليات مرضية ذات الصلة الإنسان سريريا. على الرغم من الاستجابة التكاثري قوية في وقت مبكر من فسمكس في هذا النموذج، فإنه لا نموذج الأحداث في وقت متأخر من تضيق، أي أي نيوينتيما المتقدمة. قد ينخفض وسطاء التهابات مثل السيتوكينات هذه العملية. هذه النتيجة يمكن أن يكون راجعا إلى الانتعاش السريع للبطانة من إصابة جزئية. على غرار نموذج إصابة سحق الأوعية الدموية المبلغ عنها سابقا في الأرانب 13 ، كان تسلل الخلايا المناعية طفيفة. في التحقيق الحالي قمنا بتقييم الشخصية من السيتوكينات الالتهابية الحيوانات صورية والحيوانات الأبهر إصابة مع مجموعة التعريف. ومع ذلك، لم يكن هناك فرق كبير في الشخصية السيتوكين التي من شأنها أن تفسر الفرق في الاستجابة التكاثري بين صورية والحيوانات المصابة (البياناتغير ظاهر). والإصابة الموصوفة في هذا التقرير محدودة زمنيا. في حين أن نماذج أخرى من الاصابة الأبهر وتضخم باطنة مثل نموذج قسطرة الأبهري ينكر تماما البطانة، والنموذج الحالي ينكر جزئيا فقط الشريان الأبهر. يتطلب التعريض الكامل للبطانة أطول بكثير للتعافي وهذه الحيوانات تجربة آثار الإصابة لفترة أطول من الزمن.
هذا النموذج ينتج استجابة سريعة من فسمكس و إكس للإصابة السماح الكمي من التغيرات المورفولوجية والبيوكيميائية في أسبوع واحد. وهو أكثر كفاءة من النماذج الأخرى التي تستغرق 14-28 يوما قبل تأثير التدخل واضح. هذا النموذج يستخدم الشريان الأورطي الفئران الذي هو السفينة الفئران الوحيدة التي تقارب سفينة الإنسان ذات الصلة سريريا. ميزة كبيرة من هذه التقنية بالمقارنة مع نماذج الأبهر الأخرى هي أن هذا النموذج هو سهل نسبيا للتعلم، ولا تتطلب مكلفة أو من الصعب الحصول على مكافئإيبنت 2 ، 3 ، 4 ، 5 . في الختام، يوفر نموذج إصابة سحق الأبهر الفئران بسيطة من الناحية الفنية وغير مكلفة وفعالة في الجسم الحي منصة لتقييم في وقت واحد استجابة فسمكس و إكس للإصابة الأوعية الدموية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وقد تم تمويل هذا العمل من قبل وزارة شؤون المحاربين القدامى التطوير الوظيفي جائزة (1IK2BX001553-01) (تسم) والعلاج الوعائي إج ويلي للمنح الدراسية (تسم).
Acknowledgments
نشكر هسيا رو تشينغ دكتوراه، من المجهر الإلكتروني مرفق الأساسية من كلية الطب بجامعة ميريلاند، لدعمها التقني في تجهيز العينات المسح المجهري الإلكتروني.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P.
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, Suppl 1. S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
