Summary
Restenose nach Herz-Kreislauf-Verfahren (Bypass-Chirurgie, Angioplastie oder Stenting) ist ein wichtiges Problem der Verringerung der Haltbarkeit dieser Verfahren. Eine ideale Therapie würde die Proliferation der glatten Muskelzelle (VSMC) hemmen und gleichzeitig die Regeneration des Endothels fördern. Wir beschreiben ein Modell zur gleichzeitigen Beurteilung der VSMC-Proliferation und Endothelfunktion in vivo.
Abstract
Arterielle Rekonstruktion, ob Angioplastie oder Bypass-Operation, beinhaltet iatrogenes Trauma verursacht endotheliale Störung und vaskuläre glatte Muskelzelle (VSMC) Proliferation. Gemeinsame murine Modelle studieren kleine Gefäße wie die Carotis- und Oberschenkelarterien. Hier beschreiben wir ein in vivo- System, in dem sowohl die VSMC-Proliferation als auch die endotheliale Barrierefunktion gleichzeitig in einem großen Gefäß beurteilt werden können. Wir untersuchten die infrarenale Aortenreaktion auf Verletzungen in C57BL / 6 Mäusen. Die Aorta wurde von der linken Nierenvene zur Aortenbifurkation durch 30 transmurale Quetschungen von 5 Sekunden Dauer mit einem Baumwollspitzapplikator verletzt. Morphologische Veränderungen wurden mit konventioneller Histologie beurteilt. Die Aorta-Wanddicke wurde von der Lumenoberfläche bis zur Adventitia gemessen. EdU-Integration und Gegenfärbung mit DAPI und Alpha-Actin wurde zur Demonstration der VSMC-Proliferation verwendet. Die Aktivierung von ERK1 / 2, ein bekannter Moderator der intimalen Hyperplasiebildung, wurde abgebautAbgebaut durch Western-Blot-Analyse. Die Wirkung der Entzündung wurde durch Immunhistochemie für B-Zellen, T-Zellen und Makrophagen bestimmt . En- Gesichtsabschnitte von Endothel wurden mit Rasterelektronenmikroskopie (SEM) visualisiert. Die endotheliale Barrierefunktion wurde mit Evans Blue Färbung bestimmt. Transmurale Verletzungen führten zu Aortenwandverdickung. Diese Verletzung induzierte die VSMC-Proliferation, am deutlichsten bei 3 Tagen nach Verletzung und die frühzeitige Aktivierung von ERK1 / 2 und verringerte die p27- kip1- Expression. Verletzung führte nicht zu erhöhten B-Zellen, T-Zellen oder Makrophagen Infiltration in der Gefäßwand. Verletzung verursacht partielle Endothelzell-Entblößung und Verlust von Zell-Zell-Kontakt. Verletzung führte zu einem signifikanten Verlust der endothelialen Barriere-Funktion, die nach 7 Tagen zur Grundlinie zurückkehrte. Das murine transmurale stumpfe Aortenverletzungsmodell bietet ein effizientes System, um gleichzeitig sowohl die VSMC-Proliferation als auch die endotheliale Barrierefunktion in einem großen Gefäß zu studieren.
Introduction
Restenose Nach Herz-Kreislauf-Verfahren (Bypass-Chirurgie, Angioplastie oder Stenting) ist ein erhebliches Problem der Verringerung der Haltbarkeit dieser Verfahren. Alle Revaskularisierungsverfahren werden durch Restenose geplagt. Gegenwärtige Strategien zur Verhinderung von Restenose (Arzneimittel-eluierende Stents und drogenbeschichtete Ballons) hemmen sowohl die vaskuläre glatte Muskelzelle (VSMC) als auch die endotheliale Zellproliferation (EC). Folglich verhindern diese Interventionen eine VSMC-vermittelte Restenose, verhindern aber auch die Regeneration des Endothels. Ohne ein intaktes Endothel sind die Patienten verpflichtet, auf potenten Antithrombozytenagenten zu sein, um das Risiko einer in situ-Thrombose zu verringern, um die Komplikationen zu bluten. Eine ideale Therapie würde die VSMC-Proliferation hemmen und gleichzeitig die Regeneration des Endothels fördern. Somit besteht die Notwendigkeit, gleichzeitig die VSMC-Proliferation und die endotheliale Barrierefunktion i n vivo zu studieren.
Jetzt gibt es severAl Mausmodelle der Restenose 1 . Diese Modelle beinhalten Karotisligatur und Femoralarterienverletzung 2 . Aortenmodelle umfassen Stent-Platzierung 3 , Ballonverletzung 4 und Aortenallotransplantat 5 . Alle aktuellen Modelle sind begrenzt. Carotis-Ligation erzeugt eine fließvermittelte neointimale Läsion und hat keine endotheliale Verletzung. Darüber hinaus haben sowohl Carotis- als auch Oberschenkelarterien vielfach weniger Zellschichten als menschliche Gefäße, was ihren Translationswert begrenzt. Die Mausaorta, die etwa 1,3 mm im Durchmesser ist, ist das einzige Gefäß, das eine klinisch relevante (koronare) menschliche Arterie (3) annähert.
Trotz des translationalen Potenzials von murinen Aortenmodellen der Erkrankung haben aktuelle Modelle Einschränkungen. Diese Modelle erfordern fortgeschrittene mikrochirurgische Fähigkeiten und spezialisierte Ausrüstung wie Angioplastie Ballons und Stents. Hier präsentieren wirEine neuartige, reproduzierbare Technik, um gleichzeitig die VSMC-Proliferation zu induzieren und die endotheliale Barrierefunktion zu stören.
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Protocol
Ethik-Statement: Die Protokolle für die Tierhaltung wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Maryland (Protokoll Nr. 0416009) genehmigt und nach AAALAC-International Standards durchgeführt.
1. Chirurgische Vorgehensweise
- Anästhesietechnik
- Sterilisieren Sie alle Instrumente, die in der Überlebenschirurgie verwendet wurden, mit Dampfsterilisation bei 121 ° C für 30 min.
- Anästhesie über einen Induktionsbehälter mit 100% O 2 und 2,5% Isofluran über Präzisionsverdampfer abgeben. Nachinduktion, das Isofluran abbrechen und die Kammer mit O 2 spülen. Anästhesie mit 1,5-2% Isofluran über Gesichtsmaske und 1 l / min O 2 durch Inhalation aufbewahren.
- Befestigen Sie sowohl die Induktionskammer als auch die Gesichtsmaske an einen Kohlefänger für die Abgasresorption, um das Personal zu schützen. Sorgen Sie für eine adäquate AnästhesieebeneDass es keine Antwort auf schädliche Reize gibt (Zehenknecht).
- Erstellen Sie ein operatives Feld, bestehend aus einem chirurgischen Tablett mit isothermen Pad, um thermische Unterstützung während der Operation zu bieten. Eine zusätzliche isotherme Auflage wird eine thermische Unterstützung für Tiere in ihrem Wiederherstellungskäfig bieten.
- Tiervorbereitung
- Führen Sie die folgenden Untersuchungen an 10-12 Wochen alten männlichen C57BL / 6 Mäusen durch.
- Entfernen Sie die Haare auf der ventralen Bauchoberfläche des Tieres vom Sternum zum Leistenbereich mit einem Enthaarungsmittel oder einem elektrischen Klipper mit einer Klinge von 40 Ketten.
- Im Falle eines Enthaarungsmittels diese Verbindung für 2-3 Minuten in den chirurgischen Bereich geben und dann mit Baumwolle entfernen. Wir verwenden eine handelsübliche Verbindung aus Calciumhydroxid und Natriumhydroxid.
- Den Bereich über die Schulter mit 70% Alkohol vorbereiten und Carprofen (5 mg / kg) mit einer 25-Gauge oder einer kleineren Bohrnadel subkutan einspritzen. DiesBehandlung wird postoperative Analgesie für das Tier.
- Übertragen Sie das Tier auf das chirurgische Feld und Position in dorsal Recumbency.
- Bereiten Sie den chirurgischen Aufstellungsort vor, indem Sie 8-12% providone-Jod mit einem sauberen Baumwollapplikator oder Baumwollgaze schrubben. Dann die Haut zweimal mit 70% Alkohol abspülen.
- Legen Sie Augenschmiermittel in beide Augen, um die Häufigkeit der Hornhautentzündung zu reduzieren. Decken Sie die chirurgische Stelle mit einer sterilen Abdeckung.
- Operative Technik
- Machen Sie einen medianen Bauch-Laparotomie-Inzision ca. 2-2,5 cm in der Länge mit einem Skalpell beginnend sofort kaudal der Xiphoid-Prozess und erstreckt sich auf das Becken.
- Mobilisieren Sie den Dünndarm und den Duodenum und reflektieren Sie sich seitlich nach rechts. Rollen Sie einen Streifen von sterilen Baumwolle gemeißelt und mit steriler Kochsalzlösung für die Injektion getränkt, um die Verpackung der Eingeweide zu ermöglichen, um die Exposition zu verbessern.
- Mit dem Dünndarm mobilisiert auf der rechten Seite derAbdomen, das Retroperitoneum freilegen und die Bauchaorta von der linken Nierenvene zur Aortenbifurkation aussetzen (Abbildung 1 ).
- Mit einem sterilen Baumwolltipp-Applikator, liefern 30 aufeinanderfolgende Crushs, jeweils fünf Sekunden in der Dauer.
- Entfernen Sie die Verpackung und lassen Sie die Eingeweide in ihre Heimatposition zurückkehren.
- Schließen Sie die Blende mit einem 4-0 resorbierbaren Monofilament Naht (Polydioxanon). Die Haut wird mit einem 6-0 nicht resorbierbaren Monofilament Naht (Nylon) geschlossen.
- Recovery und Post-Procedure Care
- Nach dem Eingriff bringen Sie das Tier in einen Regenerationskorb mit sauberen Bettwäsche auf einem isothermen Pad, um die thermische Unterstützung fortzusetzen, bis das Tier normal in der Lage ist, Verlassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt, bis es die Fähigkeit zeigt, die Sternal Recumbency zu erhalten.
- Überwachen Sie das Tier jede Stunde für die ersten 4 Stunden nach der Operation. Sobald das Tier ist Ambulation normalerweise Rückkehr i T zum zugewiesenen Haushaltraum. Das Tier wird nicht in der Gesellschaft eines anderen Tieres untergebracht werden, bis es sich vollständig erholt hat.
- Überwachen Sie das Tier zweimal täglich für die ersten 72 Stunden nach der Operation und mindestens 3 Mal pro Woche danach. Die Überwachung umfasst das Drehen des Tieres dreimal pro Woche.
- Carpofen (5 mg / kg) subkutan zweimal täglich für die ersten 72 h nach der Operation verabreichen.
2. Beschaffung von Gewebe
- Methode der Euthanasie
- Euthanisieren der Tiere zu vorgegebenen Zeitpunkten.
- Anästhesie über einen Induktionsbehälter mit 100% O 2 und 2,5% Isofluran über Präzisionsverdampfer abgeben.
- Um die Integrität des Endothels zu studieren, verabreichet Evans Blue Farbstoff dem Tier.
HINWEIS: Evans Blue ist ein negativ geladener Azofarbstoff mit einer hohen Bindungsaffinität für Albumin und kann nur Blutgefäße in Abwesenheit eines intakten Endothels färbenS = "xref"> 6 - Für endotheliale Integritätsstudien, zum Zeitpunkt der Euthanasie, perfundieren die Tiere mit 5 ml 0,3% Evans Blue Farbstoff gefolgt von 5 ml PBS bei physiologischem Druck für 5 min. Das Tier wird während des Perfusionsverfahrens in einer chirurgischen Ebene der Anästhesie gehalten.
- Um die Integrität des Endothels zu studieren, verabreichet Evans Blue Farbstoff dem Tier.
- Nach dem Erreichen einer tiefen Anästhesie-Ebene, öffnen Sie die Brust mit einer Sternotomie. Machen Sie eine Verletzung im rechten Vorhof, um eine Drainage von Blut aus dem Tier zu ermöglichen und auf den linken Ventrikel zuzugreifen, wird mit einer 21 G-Nadel zugegriffen und phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) injiziert, bis der Abfluss aus dem rechten Vorhof klar ist.
- Nach der Perfusion mit PBS, betreten Sie den Bauch durch einen Mittellinienschnitt.
- Wieder einmal mobilisieren Sie den Dünndarm auf die rechte Seite des Bauches, der die infrarenale Aorta aussetzt, scharf die Aorta aus benachbarten Geweben zerlegen und sie von der linken Nierenvene bis zur Aortenbifurkation ausgleichen.
- Die ausgeschnittene Aorta in einem 4% Paraformald aufbewahrenEhyde-Lösung, bis die Gewebeverarbeitung auftritt.
- Für endotheliale Integritätsstudien öffnen Sie die Aorta in Längsrichtung und stecken Sie sie auf ein Wachsblatt, das die Gesamtheit der Lumenoberfläche aussetzt 6 . Führen Sie eine qualitative Beurteilung der endothelialen Integrität durch den Grad der Färbung mit Evans Blue Dye 6 durch .
- Für andere histologische Assays, die Aorta quer abschneiden und in optimale Schnitttemperatur (OCT) -Verbindungen einbetten, wie sie durch die zu verwendende histologische Methode bestimmt werden 7 .
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Representative Results
Transversale Abschnitte Aorta eingebettet in OCT wurden geschnitten, und mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt dann Zähler gefärbt mit Verhoeff-Van Gieson (VVG) Fleck, um die interne und externe elastische Lamina identifizieren 7 . Crush-Verletzung induzierte Aortenwand Verdickung im Vergleich zu den Aorta von Tieren mit einem Sham-Verfahren behandelt (Laparotomie und Dünndarm Mobilisierung allein). Die Wanddicke, die durch den Abstand von Adventitia zum Lumen beurteilt wurde, war am besten drei Tage nach Verletzung (42,2 ± 1,7 μm gegenüber 22,1 ± 1,1 μm für Laparotomie allein) (Abbildung 2A-B ). Verletzungen führten zu den Zellen mit einem abgerundeten Aussehen und einer unregelmäßigen Kontur der luminalen Oberfläche (Abbildung 2C ).
Eine erhöhte Wandverdickung der verletzten Aorta wird zumindest teilweise durch eine vermehrte Proliferation von medialen vaskulären glatten Musten vermitteltZellen. Um zu beweisen, dass die Wandverdickung auf eine erhöhte Proliferation im Gegensatz zur Zellhypertrophie zurückzuführen ist, verwendeten wir einen EdU-Proliferationsassay. In diesem Assay wird das Thymidin-Analogon-5-ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) intravenös zur Maus 24 h vor der Euthanasie verabreicht. EdU wird während der Synthese in DNA eingearbeitet. EdU wird durch eine Klickreaktion (Kupferkatalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition mit grün-fluoreszierendem Farbstoff) 8 nachgewiesen. Sham-Mäuse, die nur der Laparotomie ausgesetzt waren, hatten keine beobachtete Fluoreszenz in jeder Schicht der Aorta. Conversley zeigten Mäuse, die einer Aortenverletzung ausgesetzt waren, sowohl im Medium als auch in der Intima der Aorta Fluoreszenz (Abbildung 3 ).
Aortenwand Verdickung nach Zerstampfung Verletzung aktiviert Zell-Signalwege impliziert in Restenose beim Menschen. Die mitogenaktivierte Proteinkinase (MAP Kinase) ERK1 / 2 ist einer der Hauptmediatoren der intimalen HyperplasiebildungAls Reaktion auf die Stimulation aus einem Mitogen wird ERK1 / 2 phosphoryliert und aktiviert 9 , 10 . Daten aus unserem Labor haben auch gezeigt, dass der Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitor p27 kip1 in Reaktion auf mitogene Stimuli in der Gefäßwand 12 verringert wird. Die Mäuse wurden bei 1, 3, 7 Tagen und 1 Monat nach Aortenbruchverletzung euthanasiert. Die infrarenale Aorta wurde isoliert und die Proteinexpression von ERK1 / 2, Phospho-ERK1 / 2 (die aktivierte Form von ERK1 / 2) und der Cyclin-abhängige Kinase-Inhibitor p27 kip1 wurden durch Western-Blot-Analyse bestimmt (Abbildung 4A ). Es wurde keine Veränderung in der Gesamt-ERK1 / 2-Protein-Expression über die Zeit beobachtet. Jedoch war die Expression von Phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) drei Tage nach der Verletzung über 200% größer als die Baseline-Pi-ERK1 / 2-Expression. P27 kip1 Ausdruck verringerte zu frühen Zeitpunkten und erreichte einen Nadir von ungefähr 20% der Grundlinie sieben Tage afVerletzung. Sowohl Pi-ERK1 / 2 als auch p27 kip1-Expression approximierten den Grundlinienniveau einen Monat nach Verletzung (Abbildung 4B ). So ist die beobachtete Verdickung der Aortenwand zumindest teilweise auf eine erhöhte mediale Proliferation zurückzuführen.
Das Aortenverletzungsmodell ermöglicht die gleichzeitige Beurteilung sowohl der medialen glatten Muskelproliferation als auch der endothelialen Barrierefunktion. Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wurde verwendet, um die Wirkung der Quetschverletzung auf die Morphologie des Endothels zu charakterisieren. Die luminale Oberfläche der Aorta wird durch ein konfluentes Endothel ausgekleidet, das die Adhäsion von Blut geborenen Zellen und Molekülen verhindert (Abbildung 5A , Maßstab = 100 μm). Im Gegensatz dazu führt die Quetschverletzung zu einer Störung der Endothelzellen und einer teilweisen Entblößung des Endothels (Abbildung 5B , Maßstab = 100 μm). Wie bei höherer Vergrößerung gesehen, führt eine Störung des Endothels zu AdhäsionenVon Partikeln in Größe und Form mit Thrombozyten. Die Adhäsion dieser Teilchen erfolgt über die gesamte Verletzungszone und ist nicht auf Bereiche der Brutto-Denudation beschränkt, die bei geringerer Vergrßerung beobachtet wurden ( Fig. 5C , Maßstab = 50 um). Die Morphologie des adhärenten Teilchens wird bei höherer Vergrößerung am besten beobachtet. Diese Partikel sind mit Plättchen und Fibrin konsistent (Abbildung 5D , Scale bar = 10 μm).
Neben der endothelialen Morphologie kann die Barrierefunktion des Endothels mit diesem Modell der Gefäßverletzung beurteilt werden. Der Azofarbstoff Evans Blue kann das normale, intakte Endothel der murinen Aorta nicht durchdringen. Eine Beschädigung der Barrierefunktion des Endothels ermöglicht die Anfärbung der Basalmembran mit Evans Blue. Mäuse, die mit einer Laparotomie allein (Schein) behandelt wurden, behielten die Barrierefunktion des Endothels auf, und diese Aorten waren weiß. Crush - Verletzungen führten zu einemDiffuser Verlust der endothelialen Barriere-Funktion und diese Aorta gefärbt dunkelblau. Die Intensität der Färbung mit Evans Blue wurde drei Tage nach der Zerstörungsverletzung verringert, und die volle Barrierefunktion wurde auf Woche nach Verletzung wiederhergestellt (Abbildung 6A ). Die endotheliale Barrierefunktion kann durch Abwiegen der Proben weiter bestimmt und in einem 10fachen Volumen von 50% iger Trichloressigsäurelösung homogenisiert werden. Das Verdünnen des Überstandes in 4-fachem Ethanol ermöglicht die Bestimmung der Fluoreszenzintensität (Anregung 620 nm und Emission 680 nm), wie von Aoki et al . 11 Die Menge an Evans Blue, die von der infrarenalen Aorta eluiert wurde, war in Aorta unmittelbar nach Verletzung im Vergleich zu Aorta, die nur der Laparotomie unterworfen waren (verletzt - Tag 0), um das Dreifache höher. Die Aorta fuhr fort, mit Evans Blue an einem und drei Tagen nach Verletzung zu färben, aber weniger intensiv als zum Zeitpunkt der Verletzung, was auf eine allmähliche Wiederherstellung der endothelialen Barriere-Funktion hindeutet. Eine Woche achternEr Verletzung der verletzten Aorta hatte gleichwertige Färbung als Aorta mit Laparotomie allein behandelt (Abbildung 6B ).
Abbildung 1: Verletzung wird durch stumpfes Zerkleinern der Aorta von der linken Nierenvene zur Aortenbifurkation verursacht. Abbildung angepasst mit Genehmigung von Yu et al ., PLoS One 2015 12 . Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Crush Injury induziert Aortenwand Verdickung. ( A ) Crush-Verletzung induzierte morphologische Veränderungen in der Aorta. Repräsentative 5 μm Querschnitte wurden mit VVG bei 0 gefärbt,1, 3 und 7 Tage nach Verletzung Maßstäbe = 100 μm. ( B ) Die Wanddicke war am größten 3 Tage nach Verletzung, 42,2 ± 1,7 μm und war signifikant größer als die Aorta von Scham-Tieren, die allein der Laparotomie ausgesetzt waren, 22,1 ± 1,1 μm. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Zwei-Tail-T-Test des Studenten ermittelt. * Bezeichnet p <0,05, n = 3. ( C ) Die Zerstörungsverletzung führte zu einem abgerundeten Erscheinungsbild von medialen VSMCs (grün gefärbt für α-glatte Muskelaktin) und eine Veränderung der Zellorientierung. Nuklei wurden mit DAPI (blau) gegengefärbt. Maßstäbe = 10 μm. Daten werden als Mittel und Standardabweichungen dargestellt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Crush Injury induziert Cell ProlifeRation in der Aortenmauer. Die Mäuse wurden entweder der Laparotomie allein (Schein) oder der Laparotomie mit Aortenbruchverletzungen ausgesetzt. Thymidin-Analog-5-ethinyl-2'-desoxyuridin (EdU) wurde 24 Stunden vor der Euthanasie verabreicht. EdU wird während der Synthese in DNA eingearbeitet. EdU wird durch eine Klickreaktion (Kupfer-katalysierte Azid-Alkin-Cycloaddition mit grün-fluoreszierendem Farbstoff) nachgewiesen. Es gab keine nachweisbare EdU (grün) in der Aortenwand der Schein Tiere. Bei den Tieren, die einer Zerstörungsverletzung ausgesetzt waren, färbte EdU in den Medien der Aorta und in einem etwas geringeren Grade in der Intima. Gefäß-glatte Muskelzellen wurden durch Färbung mit α-glattem Muskel-Aktin-Antikörper (rot) identifiziert. Dieser Befund deutet darauf hin, dass die beobachtete Wandverdickung, die in 2 beobachtet wurde, auf einer Zunahme der Zellproliferation zurückzuführen ist. Maßstäbe = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehenE.
Abbildung 4: Die Mitogen-aktivierte Protein-Kinase (MAP-Kinase) -Pfad wird in Reaktion auf die Verletzung der Verletzung aktiviert. ( A ) Die MAP Kinase ERK1 / 2 ist bei Aktivierung phosphoryliert und mit intimaler Hyperplasie und Restenose assoziiert. Die Mäuse wurden bei 1, 3, 7 Tagen und 1 Monat nach Aortenbruchverletzung euthanasiert. Western-Blot-Analyse wurde verwendet, um die Proteinexpression von Gesamt-ERK1 / 2, Phospho-ERK1 / 2 und dem Cyclin-abhängigen Kinase-Inhibitor p27 kip1 zu beurteilen . Die Protein-Expression wurde auf ein Sham-Tier normalisiert, das mit Laparotomie allein behandelt wurde. ( B ) Es wurde keine Änderung der Gesamt-ERK1 / 2-Protein-Expression über die Zeit beobachtet. Jedoch war die Expression von Phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) drei Tage nach der Verletzung über 200% größer als die Baseline-Pi-ERK1 / 2-Expression. P27 kip1 Ausdruck verringerte zu frühen Zeitpunkten anD erreichte einen Nadir von etwa 20% der Grundlinie sieben Tage nach Verletzung. Beide Pi-ERK1 / 2 und p27 kip1 Expression approximierten Baseline Levels einen Monat nach Verletzung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5. Crush-Verletzung stört Aorten-Endothelzellen. ( A ) Rasterelektronenmikroskopie (SEM) wurde verwendet, um die Wirkung der Quetschverletzung auf die Morphologie des Endothels zu charakterisieren. Die luminalen Oberfläche der normalen Aorta ist von einem konfluenten, Endothel ausgekleidet, das die Adhäsion von Blut geborenen Zellen und Molekülen verhindert. ( B ) Crush-Verletzung führt zu einer Störung der Endothelzellen und einer partiellen Entblößung des Endothels. ( C ) Wie bei höherem Magnifica gesehenDie Unterbrechung des Endothels führt zu einer Adhäsion von Partikeln in Größe und Form mit Thrombozyten. Die Adhäsion dieser Partikel erfolgt über die gesamte Verletzungszone und ist nicht auf Bereiche der Brutto-Denudation beschränkt, die bei geringerer Vergrößerung beobachtet wurden. ( D ) Bei höherer Vergrößerung sind diese Teilchen mit Plättchen und Fibrin konsistent. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 6: Die stumpfe Aortenverletzung ermöglicht die Quantifizierung der endothelialen Barrierefunktion. ( A ) Eine Beschädigung der Barrierefunktion des Endothels ermöglicht die Färbung der Basalmembran mit Evans Blue Dye. Mäuse, die mit einer Laparotomie allein (Schein) behandelt wurden, behielten die Barrierefunktion des Endothels und thEse aortas waren weiß. Crush-Verletzung führte zu einem diffusen Verlust der endothelialen Barriere-Funktion und diese Aorta gefärbt dunkelblau. Die Intensität der Färbung mit Evans Blue wurde drei Tage nach der Zerstörungsverletzung verringert, und die volle Barrierefunktion wurde auf Woche nach Verletzung wiederhergestellt. ( B ) Die Bindung von Evans Blue an die infrarenale Aorta wurde durch Eluieren von Evans Blue aus der Probe und Quantifizierung durch Fluoreszenzintensität quantifiziert. Daten werden als Mittel und Standardabweichungen dargestellt. Die meisten Evans Blue wurden sofort nach der Verletzung von der Aorta eluiert. Zum Zeitpunkt der Verletzung hat die Aorta über dreifach mal mehr Evans Blue gebunden als die Aorta, die der Laparotomie allein unterworfen ist. Als sich die Aorta erholen konnte, gab es an einem und drei Tagen nach Verletzung weniger Bindung. Eine Woche nach Verletzung hat die Aorta die gleiche Menge an Evans Blue gebunden, da die Aorta allein der Laparotomie ausgesetzt war. Die statistische Signifikanz wurde mit dem Zwei-Tail-T-Test des Studenten ermittelt. * DeAnmerkungen p <0,05, n = 3, NS bedeutet nicht signifikant. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Wir haben die Auswirkungen eines murinen Aortenverletzungsmodells charakterisiert, das zu medialer Hyperplasie und endothelialer Barriere-Dysfunktion führt. Die partielle EC-Ablösung entlang der Aorta intima begleitete den Verlust des Zell-Zell-Kontakts und die Verbesserung der Zellvorsprünge. Entsprechend wurde die endotheliale Barrierefunktion signifikant beeinträchtigt, was die mitogenempfindlichen Signalwege stimulierte, was zur Proliferation von VSMCs und Verdickung der Gefäßwand führte. Die Stärken dieses Modells sind, dass es technisch einfacher ist, zu lernen und auszuführen als andere Aortenmodelle der Erkrankung und ermöglicht die gleichzeitige Beurteilung sowohl der proliferativen Reaktion auf Verletzung und Endothelfunktion. Der kritische Schritt in diesem Protokoll ist die tatsächliche Krustenverletzung. Die Variabilität des Ausmaßes der Quetschverletzung kann zu unterschiedlichem Verletzungsgrad führen und somit eine variable Veränderung der glatten Muskelzellproliferation bedeuten. Ein Schritt, der diese Variabilität in unserem Labor reduziert, ist, eins zu habenCientist, geblendet auf die Behandlung oder experimentelle Zustand, führen alle Zerstampfung Verletzungen.
Eine Einschränkung dieses Modells ist seine Verallgemeinerbarkeit für klinisch relevante Prozesse der menschlichen Krankheit. Trotz der frühen, robusten proliferativen Reaktion von VSMCs in diesem Modell, modelliert es nicht die späten Ereignisse der Restenose, dh keine Neointima entwickelt. Verminderte entzündliche Mediatoren wie Cytokine könnten diesen Prozess regulieren. Dieser Befund könnte auf die rasche Wiederherstellung des Endothels durch eine partielle Verletzung zurückzuführen sein. Ähnlich wie bei einem zuvor berichteten vaskulären Crush-Verletzungsmodell bei Kaninchen 13 war die Infiltration von Immunzellen gering. In der vorliegenden Untersuchung untersuchten wir das Profil der entzündlichen Zytokine die Scheintiere und Aortenverletzungstiere mit dem Profilerarray. Allerdings gab es keinen signifikanten Unterschied im Zytokin-Profil, das den Unterschied in der proliferativen Reaktion zwischen Schein und verletzten Tieren erklären würde (Datennicht gezeigt). Die im vorliegenden Bericht beschriebene Verletzung ist zeitlich begrenzt. Während andere Modelle der Aortenverletzung und der intimen Hyperplasie wie der Aortenangioplastie-Modell das Endothel vollständig abdichten, zeigt das vorliegende Modell nur teilweise die Aorta. Eine vollständige Entblößung des Endothels erfordert wesentlich länger, um sich zu erholen, und diese Tiere erleben die Wirkungen einer Verletzung über einen längeren Zeitraum.
Dieses Modell erzeugt eine schnelle Reaktion von VSMCs und ECs auf Verletzungen, die die Quantifizierung von morphologischen und biochemischen Veränderungen in einer Woche ermöglichen. Es ist effizienter als andere Modelle, die 14-28 Tage dauern, bevor die Wirkung der Intervention offensichtlich ist. Dieses Modell verwendet die murine Aorta, die das einzige murine Gefäß ist, das einem klinisch relevanten menschlichen Gefäß entspricht. Der wesentliche Vorteil dieser Technik im Vergleich zu anderen Aortenmodellen ist, dass dieses Modell relativ einfach zu erlernen ist und nicht teuer oder schwer zu erreichen istUipment 2 , 3 , 4 , 5 Abschließend bietet das murine Aorten-Crush-Verletzungsmodell eine technisch einfache, kostengünstige und effiziente In-vivo -Plattform, um gleichzeitig die Reaktion von VSMCs und ECs auf vaskuläre Verletzungen zu bewerten.
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Disclosures
Diese Arbeit wurde gefördert durch das Department of Veterans Affairs Karriere Development Award (1IK2BX001553-01) (TSM) und die Vascular Cures EJ Wylie Stipendium (TSM).
Acknowledgments
Wir danken Hsia Ru-ching PhD, von der Electron Microscopy Core Facility der University of Maryland School of Medicine, für ihre technische Unterstützung bei der Verarbeitung der Scanning-elektronischen Mikroskop-Proben.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
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