Summary
Restenosis לאחר הליכים Cardiovascular (ניתוח מעקף, אנגיופלסטיקה, או stenting) היא בעיה משמעותית להפחית את עמידות של נהלים אלה. טיפול אידיאלי יהיה לעכב תפוצת שריר חלקה (VSMC) תוך קידום התחדשות האנדותל. אנו מתארים מודל להערכה סימולטנית של התפשטות VSMC ותפקוד האנדותל in vivo.
Abstract
שחזור עורקי, בין אם ניתוח אנגיופלסטי או ניתוח מעקף, כולל טראומה יאטרוגנית הגורמת לשיבוש אנדותל ותפוצת תאי שריר חלקה (VSMC). מודלים מורין משותף ללמוד כלי קטן כגון עורקי הראש ואת עורקי הירך. להלן אנו מתארים מערכת vivo שבו שתי התפשטות VSMC ו פונקציה מחסום האנדותל ניתן להעריך בו זמנית בכלי גדול. למדנו את התגובה העורקים infrarenal לפציעה C57BL / 6 עכברים. אבי העורקים נפגעו מהוריד הכליתי השמאלי עד לשתי ההתהוות של אבי העורקים על ידי 30 ריסקות טרנסמומיות של משך 5 שניות עם מוליך כותנה. שינויים מורפולוגיים הוערכו עם היסטולוגיה קונבנציונלית. עובי דופן העורקים נמדד מן המשטח לומינליטיה. שילוב EDU וכתמים נגד עם DAPI ואלפא אקטין שימש להדגים התפשטות VSMC. הפעלת ERK1 / 2, מנחה ידוע של היווצרות היפרפלזיה אינטימית, הרתיעהממוקש על ידי ניתוח כתם המערבי. ההשפעה של דלקת נקבע על ידי אימונוהיסטוכימיה עבור תאים B, T- תאים, ומקרופאגים . En פנים קטעים של האנדותל היו דמיינו עם מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה (SEM). פונקציה אנדותל המכשול נקבע עם מכתים Evans כחול. פגיעה בחצי הדם גרמה לעיבוי קיר העורקים. פגיעה זו גרמה להתפשטות VSMC, הבולט ביותר ב 3 ימים לאחר הפציעה, ואת ההפעלה המוקדמת של ERK1 / 2 ו ירד p27 ביטוי kip1. פגיעה לא הביאה לגידול בתאי B, תאי T, או חדירת מקרופאגים בקיר הספינה. פציעה גרמה למחלות תא אנדותליות חלקיות ולאובדן מגע של תאים תאיים. פגיעה גרמה לאובדן משמעותי של תפקוד מחסום האנדותל, אשר חזר לקו הבסיס לאחר שבעה ימים. Murine transmural בוטה אב העורקים מודל הפציעה מספקת מערכת יעילה כדי ללמוד בו זמנית הן התפשטות VSMC ו מחסום אנדותל פונקציה בכלי גדול.
Introduction
רסטנוזה ניתוח מעקפים (ניתוח מעקפים, אנגיופלסטיקה או סטנט) הוא בעיה משמעותית בהפחתת עמידותם של תהליכים אלה. כל ההליכים רה-וסקולריזציה הם מנוגע על ידי restenosis. האסטרטגיות הנוכחיות למניעת רסטנוזיס (סטנטים משחררים תרופה ובלונים מצופים בסמים) מעכבים את תאי השריר החלקים של כלי הדם (VSMC) ואת התפשטות תאי האנדותל (EC). כתוצאה מכך, התערבויות אלה למנוע restenosis מתווך VSMC, אלא גם למנוע את התחדשות האנדותל. ללא אנדותל שלם, החולים נדרשים להיות על סוכנים נוגדי טסיות חזק כדי להקטין את הסיכון של פקקת באתרו בסיכון של דימום סיבוכים. טיפול אידיאלי יהיה לעכב התפשטות VSMC תוך קידום התחדשות האנדותל. לכן, יש צורך בו זמנית מחקר התפשטות VSMC ו מחסום אנדותל פונקציה אני vivo .
נכון להיום, יש לנתקמודלים העכבר של restenosis 1 . מודלים אלה כוללים קשירת עורקים ופציעה עורק הירך חוט 2 . מודלים אבי העורקים כוללים מיקום סטנט 3 , פגיעה בלון 4 , ו alortraft אבי העורקים 5 . כל המודלים הנוכחיים מוגבלים. Carutid קשירת מייצר זורם בתיווך neointimal הנגע ואין פגיעה אנדותל. בנוסף, הן עורקי הראש ואת הירך יש הרבה פחות שכבות תאים פחות מאשר כלי אדם, הגבלת הערך translational שלהם. אבי העורקים של העכבר הוא כ 1.3 מ"מ קוטר, הוא כלי שיט רק הקרובה לעורק אנושי קליני (רלוונטי) קלינית (3).
למרות פוטנציאל translational של מודלים אבי העורקים של Murine, מודלים הנוכחי יש מגבלות. מודלים אלה דורשים מיומנויות מתקדמות microsurgical וציוד מיוחדים כגון בלונים אנגיופלסטי ו stents. כאן אנו מציגיםרומן, טכניקה לשחזור בו זמנית לעורר התפשטות VSMC ולשבש את תפקוד מחסום האנדותל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הצהרת האתיקה: הפרוטוקולים לטיפול בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ושימוש (IACUC) של אוניברסיטת מרילנד (פרוטוקול מס '0416009) ונערכו על פי תקני AAALAC-International.
1. הליך כירורגי
- טכניקת הרדמה
- לעקר את כל המכשירים המשמשים ניתוח הישרדות עם קיטור עיקור ב 121 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
- להשרות הרדמה באמצעות מיכל אינדוקציה עם 100% O 2 ו 2.5% isoflurane נמסר באמצעות מאדה דיוק. לאחר אינדוקציה, להפסיק את isoflurane ולשטוף את החדר עם O 2 . לשמור על הרדמה עם isoflurane 1.5-2% באמצעות מסכת פנים 1 L / min O 2 על ידי שאיפה.
- צרף הן את החדר אינדוקציה ומסכה בפני נזלת פחם עבור ספיגת גז פסולת כדי להגן על כוח אדם. ודא מטוס הרדמה נאותה על ידי הדגמהכי אין תגובה לגירויים מזיקים (קמצוץ הבוהן).
- יצירת שדה אופרטיבי המורכב מגש כירורגי עם כרית איזותרמית לספק תמיכה תרמית במהלך הניתוח. כרית איזותרמית נוספת תספק תמיכה תרמית לבעלי חיים כלוב ההתאוששות שלהם.
- הכנת בעלי חיים
- בצע את החקירה הבאה על 10-12 שבועות זכר C57BL זכר / 6 עכברים.
- הסר את השיער על פני הבטן הגחון של החיה מן עצם החזה לאזור המפשעה עם סוכן דפילציה או קליפר חשמל עם להב מספר 40.
- במקרה של סוכן דפילציה, להחיל מתחם זה לאזור כירורגי במשך 2-3 דקות ולאחר מכן להסיר אותו עם כותנה. אנו משתמשים במתחם זמין מסחרית של סידן הידרוקסיד ו hydroxide נתרן.
- הכן את האזור על הכתף עם אלכוהול 70% ו subcutaneous להזריק carprofen (5 מ"ג / ק"ג) עם 25 מד או מחט קטן יותר נשא. זֶההטיפול יספק כאבים לאחר הניתוח עבור החיה.
- מעבירים את החיה לשדה הניתוח וממקמים שכיבה הגב.
- הכן את האתר כירורגית על ידי מקרצף 8-12% providone- יוד עם applicator כותנה נקי או גזה כותנה. לאחר מכן לשטוף את העור פעמיים עם אלכוהול 70%.
- מניחים חומר סיכה עיניים בשתי העיניים כדי להפחית את השכיחות של יובש הקרנית. לכסות את האתר כירורגי עם וילון סטרילי.
- טכניקה אופרטיבית
- הפוך חציון בטן laparotomy בטן כ 2-2.5 ס"מ אורך עם אזמל מתחיל מיד הזנב את תהליך xiphoid ומתרחב לכיוון האגן.
- מוסיפים את המעי הדק ואת התריסריון ומשקפים לרוחב ימינה. מגלגלים רצועה של כותנה סטרילית גזה ספוג עם תמיסת מלח סטרילית להזרקת כדי לאפשר אריזה של viscera כדי לשפר את החשיפה.
- עם המעי הדק מגויס בצד ימין שלהבטן, לחשוף את retroperitoneum לחשוף את אבי העורקים הבטן מן הווריד הכליתי השמאלי כדי bifurcation אבי העורקים ( איור 1 ).
- עם המוליך סטרילי צמר גפן, לספק 30 רצופים רצופים, כל חמש שניות משך.
- הסר את האריזה ולאפשר viscera לחזור למקום הילידים שלהם.
- סגור fascia עם ריצה תפר חד פעמיות 4-0 absorbable (polydioxanone). העור הוא סגור עם ריצה 6-0 non-absorbable תפר monofilament (ניילון).
- שחזור וטיפול לאחר הטיפול
- לאחר ההליך, במקום החיה בכלוב התאוששות עם מצעים נקיים על כרית isothermal להמשיך תמיכה תרמית עד בעל החיים הוא מסוגל אמבולט בדרך כלל. אל תעזוב את החיה ללא השגחה עד שהדבר יוכיח את היכולת לשמור על שכיבה.
- לפקח על החיה בכל שעה במשך 4 שעות לאחר הניתוח הראשון. לאחר החיה אמבולטינג בדרך כלל לחזור אני לא לחדר ההקצאה שהוקצה. החיה לא תשכן בחברה של חיה אחרת עד שתחלים לגמרי.
- לפקח על החיה פעמיים ביום עבור הראשון 72 שעות לאחר הניתוח לפחות 3 פעמים בשבוע לאחר מכן. הניטור כולל שקילת החיה שלוש פעמים בשבוע.
- ניהול carpofen (5 מ"ג / ק"ג) תת עורית פעמיים ביום עבור הראשון 72 שעות לאחר הניתוח.
2. רכש של רקמות
- שיטת המתת חסד
- להרדים את החיות בנקודות זמן קבועות מראש.
- להשרות הרדמה באמצעות מיכל אינדוקציה עם 100% O 2 ו 2.5% isoflurane נמסר באמצעות מאדה דיוק.
- כדי ללמוד את השלמות של האנדותל, Admin Evans כחול לצבוע את החיה.
הערה: אוואנס כחול הוא צבע Azo טעונה שלילית עם זיקה מחייב גבוהה עבור אלבומין והוא יכול רק כלי דם כתם בהיעדר אנדותל שלםS = "xref"> 6. - עבור מחקרים שלמות האנדותל, בזמן המתת חסד, perfuse החיות עם 5 מ"ל של 0.3% אוונס צבע כחול ואחריו 5 מ"ל PBS בלחץ פיזיולוגי במשך 5 דקות. החיה נשמרת במישור כירורגי של הרדמה במהלך הליך זלוף.
- כדי ללמוד את השלמות של האנדותל, Admin Evans כחול לצבוע את החיה.
- לאחר השגת מטוס הרדמה עמוק, לפתוח את החזה עם סטרנוטומי. לעשות חתך באטריום הנכון כדי לאפשר ניקוז של דם מן החיה וגישה החדר השמאלי הוא ניגש עם מחט 21 G להזריק פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) עד השפכים מן אטריום ימין ברור.
- לאחר זלוף עם PBS, הזן את הבטן דרך חתך קו האמצע.
- שוב, לגייס את המעי הדק בצד הימני של הבטן לחשוף את אבי העורקים infrenal, בחדות לנתח את אבי העורקים הסמוכים לרקמות ובלו אותו מן הווריד הכליתי השמאלי כדי bifurcation אבי העורקים.
- חנות אבי העורקים הוסר ב paraformald 4%פתרון ehyde עד עיבוד רקמות מתרחשת.
- עבור מחקרים שלמות האנדותל, לפתוח את אבי העורקים longitudinally ולהצמיד אותו גיליון שעווה לחשוף את כולו של משטח luminal 6 . ביצוע הערכה איכותית של שלמות האנדותל על ידי מידת מכתים עם צבע כחול אוואנס 6 .
- עבור מבחני היסטולוגיה אחרים, סעיף אבי העורקים באופן רוחבי להטביע אותו אופטימלית טמפרטורת חיתוך (OCT) תרכובות כפי שהוכתב על ידי השיטה היסטולוגית לשמש 7 .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
סעיפים אביזר רוחבי מוטבע OCT היו מחולקים, ומוכתמים hematoxylin ו eosin לאחר מכן מוכתמות עם כתם Verhoeff- ואן Gieson (VVG) לזהות את lamina אלסטית פנימיים וחיצוניים 7 . פציעה מוחצת גרמה לעיבוי קיר אבי העורקים בהשוואה לאורטאס של בעלי חיים שטופלו בהליך דמה (laparotomy וגירוי מעיים קטן בלבד). עובי דופן, כפי שהוערך על ידי המרחק מ adventitia לומן, היה הגדול ביותר שלושה ימים לאחר הפציעה (42.2 ± 1.7 מיקרומטר לעומת 22.1 ± 1.1 מיקרומטר עבור laparotomy לבד) ( איור 2A-B ). פגיעה גרמה לתאים בעלי מראה מעוגל יותר וקווי מתאר לא סדיר של משטח לומינל ( איור 2 ג ).
עיבוי מוגבר הקיר של אבי העורקים הפגוע הוא לפחות בחלקו בתיווך על ידי התפשטות מוגברת של המדיאלי וסקולרי המדיאלי חלקהתאים קלים. כדי להוכיח כי עיבוי הקיר נובע התפשטות מוגברת בניגוד היפרטרופיה התא, השתמשנו assay התפשטות EDU. במאמר זה, thymidine אנלוגי 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EDU) מנוהל תוך ורידי לעכבר 24 שעות לפני המתת חסד. EDU משולב לתוך DNA במהלך סינתזה. EDU מזוהה על ידי תגובה לחץ (נחושת- calyloaddition cedloaddition נחושת נחושת, באמצעות צבע ירוק פלואורסצנטי) 8 . עכברי שמים שנחשפו רק לפרוטומיה לא נצפו כל פלואורסצנציה בשכבה כלשהי של אבי העורקים. קונברסלי, עכברים חשופים לפגיעה באאור העורכים הפגינו הקרינה הן בתקשורת והן באינטימה של אבי העורקים ( איור 3 ).
עיבוי הקיר אבי העורקים לאחר פציעה למחוץ מפעילה תא איתות איתותים מעורבים restenosis אצל בני אדם. מיטוגן המופעל קינאז חלבון (MAP Kinase) ERK1 / 2 הוא אחד המתווכים העיקרון של היווצרות היפרפלזיה intimalבתגובה לגירוי ממיטוגן, ERK1 / 2 הוא phosphorylated ומופעל 9 , 10 . נתונים מהמעבדה שלנו הוכיחו גם כי מעכב קינאז תלוי cyclin p27 kip1 הוא ירד בתגובה לגירויים mitogenic בקיר כלי 12 . עכברים היו מורדמים ב 1, 3, 7 ימים, 1 חודש לאחר פגיעה מוחקים אבי העורקים. אב העורקים היו מבודדים וחלבון ביטוי של ERK1 / 2, phospho-ERK1 / 2 (הופעל צורה של ERK1 / 2), ואת מעכב קינאז cycase תלוי p27 kip1 נקבעו על ידי ניתוח כתם המערבי ( איור 4 א ). לא נצפה שינוי בכל ביטוי חלבון ERK1 / 2 לאורך זמן. עם זאת, שלושה ימים לאחר הפציעה, הביטוי phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) היה מעל 200% יותר מאשר הביטוי Pi-ERK1 / 2. הביטוי p27 kip1 ירד בנקודות זמן מוקדמות והגיע לשפל של כ -20% משבעה ימים בשבועפגיעה. הן Pi-ERK1 / 2 ו p27 kip1 ביטוי בקירוב רמות הבסיס חודש לאחר הפציעה ( איור 4 ב ). לכן העיבוי הנצפה של קיר אבי העורקים הוא לפחות בחלקו בשל התפשטות המדיאלי גדל.
המודל הפציעה אבי העורקים מאפשר הערכה סימולטנית של שתי התפשטות שריר חלקה מדיאלי ו פונקציה מחסום האנדותל. סריקת מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM) שימש כדי לאפיין את ההשפעה של פגיעה למחוץ על המורפולוגיה של האנדותל. משטח הלומינל של אבי העורקים הוא מרופד על ידי אנדותל המזהם, המונע הידבקות של תאים מולידים בדם ( איור 5A , קנה מידה בר = 100 מיקרומטר). לעומת זאת, פציעה תוצאות הפגיעה שיבוש של תאים אנדותל ו denudation חלקית של האנדותל ( איור 5 ב , קנה מידה בר = 100 מיקרומטר). כפי שניתן לראות בהגדלה גבוהה יותר, הפרעה של האנדותל תוצאות adhesiעל חלקיקים עקביים בגודל ובצורה עם טסיות. הידבקות של חלקיקים אלה מתרחשת לאורך כל אזור הפציעה, והוא אינו מוגבל לתחומים של denudation ברוטו שנצפתה בהגדלה נמוכה יותר ( איור 5C , קנה מידה בר = 50 מיקרומטר). מורפולוגיה של החלקיקים חסיד הוא ציין הטובה ביותר בהגדלה גבוהה. חלקיקים אלה עולים בקנה אחד עם טסיות ופיברין ( איור 5D , קנה מידה בר = 10 מיקרומטר).
בנוסף מורפולוגיה האנדותל, פונקציית המכשול של האנדותל ניתן להעריך עם מודל זה של פגיעה בכלי הדם. צבע האזו אוואנס כחול לא יכול לחלחל האנדותל תקין, שלם של אב העורקים Murine. נזק לתפקוד המכשול של האנדותל מאפשר מכתים של קרום המרתף עם אוונס כחול. עכברים שטופלו laparotomy לבד (Sham) שמרה על תפקוד המכשול של האנדותל ו aortas אלה היו לבנים. פגיעה בפציעה גרמהמפוזר אובדן של פונקציה מחסום האנדותל אלה aortas כתום כהה. עוצמת מכתים עם אוואנס כחול ירד שלושה ימים לאחר פציעה פגיעה, תפקוד המכשול המלא שוחזר בשבוע לאחר הפציעה ( איור 6 א ). פונקציה מחסום אנדותל יכול להיות quantitated נוספת על ידי שקילה דגימות homogenizing בנפח 10 פי 50 של חומצה trichloroacetic פתרון. דילול supernatant באתנול 4 לקפל מאפשר לקבוע את עוצמת הקרינה (עירור 620 ננומטר פליטה 680 ננומטר) כמתואר על ידי Aoki et al . 11 . כמות אוואנס כחול eluted מן האברטה infranenal היה מעל שלוש פי גבוה יותר aortas מיד לאחר הפציעה לעומת aortas נתון רק laparotomy (נפגע - יום 0). אבי העורקים המשיכו להכתים עם אוואנס כחול באחד ושלושה ימים לאחר הפציעה, אך פחות בעוצמה מאשר בזמן הפציעה, דבר המצביע על התאוששות הדרגתית של תפקוד מחסום האנדותל. שבוע בשבועפגיעה באבי העורקים הפצועים היו כתמים מקבילים כמו אבי העורקים שטופלו laparotomy לבד ( איור 6 ב ).
איור 1: פגיעה נוצר על ידי Bluntly מוחץ את אבי העורקים מן הווריד הכליתי השמאלי כדי פיצוח אבי העורקים. איור מותאם עם אישור של et et al ., PLoS One 2015 12 . אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור מס '2: מחצית פגיעה גורם לעורקי קירור אבי העורקים. ( א ) פציעה נזק גרמה שינויים מורפולוגיים אבי העורקים. נציג 5 מיקרומטר חתכים חתכים היו מוכתמים VVG ב 0,1, 3 ו -7 ימים לאחר הפציעה. סולם ברים = 100 מיקרומטר. ( B ) עובי הקיר היה הגדול ביותר 3 ימים לאחר הפציעה, 42.2 ± 1.7 מיקרומטר, והיה גדול משמעותית אבי העורקים של דמה חשופים laparotomy לבד, 22.1 ± 1.1 מיקרומטר. משמעות סטטיסטית נקבעה עם מבחן הזנב של שני הזנב. * מסמן p <0.05, n = 3. ( C ) נזק למחצה גרמה מראה מעוגלות של VSMCs המדיאלי (מוכתם בירוק עבור אקטין שריר חלק α) שינוי אוריינטציה התא. גרעינים היו counterstained עם DAPI (כחול). סולם ברים = 10 מיקרומטר. הנתונים מוצגים כאמצעים וסטיות תקן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: למחוץ פגיעה גורם Prolife Cellקבורה בחומת אבי העורקים. עכברים נחשפו או laparotomy לבד (sham) או laparotomy עם נזק למחוץ אבי העורקים. Thymidine אנלוגי 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) ניתנה 24 שעות לפני המתת חסד. EDU משולב לתוך DNA במהלך סינתזה. EDU מזוהה על ידי תגובה לחץ (נחושת- calyloadedded cedloaddition נחושת בצבע באמצעות צבע ירוק פלואורסצנטי). לא היה שום אדו (ירוק) לזיהוי בקיר אבי העורקים של חיות הדמה. אצל בעלי החיים שנחשפו לפציעה, אדווה מוכתמת בצורה בולטת בתקשורת של אבי העורקים ובמידה פחותה יותר באינטימה. תאים שריריים וסקולריים חלקיים זוהו על ידי מכתים עם נוגדן אקטין שריר α חלקה (אדום). ממצא זה מרמז כי עיבוי הקיר שנצפתה שנצפתה באיור 2 נובע מגידול התפשטות תאים. סולם ברים = 10 מיקרומטר. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של פיגור זהה.
איור 4: מיטוגן המופעל חלבון קינאז (MAP Kinase) נתיב הופעל בתגובה לקריסה פגיעה. ( A ) MAP Kinase ERK1 / 2 הוא phosphorylated כאשר מופעלת קשורה hyperplasia אינטימלי ו restenosis. עכברים היו מורדמים ב 1, 3, 7 ימים, 1 חודש לאחר פגיעה מוחקים אבי העורקים. ניתוח כתם המערבי שימש להעריך את ביטוי החלבון של ERK סך הכל / 2, phospho-ERK1 / 2, ואת מעכב קינאז cyclin תלוי p27 kip1 . ביטוי חלבון מנורמל לחיה מזויפת שטופלה עם laparotomy לבד. ( ב ) לא נצפה שינוי בכל ביטוי חלבון ERK1 / 2 לאורך זמן. עם זאת, שלושה ימים לאחר הפציעה, הביטוי phospho-ERK1 / 2 (Pi-ERK1 / 2) היה מעל 200% יותר מאשר הביטוי Pi-ERK1 / 2. P27 ביטוי kip1 ירד בנקודות זמן מוקדמותהגיע לשיא של כ -20% מקו הבסיס שבעה ימים לאחר הפציעה. שניהם Pi-ERK1 / 2 ו p27 kip1 ביטוי בקירוב רמות הבסיס חודש לאחר הפציעה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5. לרסק פגיעה משבש תאים אנדותל אבי העורקים. ( A ) סריקת מיקרוסקופית אלקטרונים (SEM) שימש לאפיין את ההשפעה של פגיעה למחוץ על המורפולוגיה של האנדותל. משטח הלומינה של אבי העורקים הרגיל הוא מרופד על ידי אנדותל ומחוברות, המונע הידבקות של תאים מולידים בדם. ( ב ) למחוץ פציעה התוצאות הפרעה של תאים אנדותל ו denudation חלקית של האנדותל. ( ג ) כפי שנראה במגניפה גבוההTion, הפרעה של תוצאות האנדותל הידבקות של חלקיקים בקנה אחד בגודל ובצורה עם טסיות. הידבקות של חלקיקים אלה מתרחשת לאורך כל אזור הפציעה, ואינו מוגבל לאזורים של הגילוי הגולמי שנצפה בהגדלה נמוכה יותר. ( D ) בהגדלה גבוהה יותר, חלקיקים אלה עולים בקנה אחד עם טסיות ופיברין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 6: פגיעה אבי העורקים קהה מאפשר כימות של תפקוד המכשול האנדותל. ( א ) נזק לתפקוד המכשול של האנדותל מאפשר מכתים של הממברנה במרתף עם צבע כחול אוואנס. עכברים שטופלו laparotomy לבד (sham) שמרה על תפקוד המכשול של האנדותל ו thאאורטות היו לבנות. פציעה למחצה גרמה לאיבוד מפוזר של תפקוד מחסום האנדותל אלה aortas כתמים כהים. עוצמת מכתים עם אוואנס כחול ירד שלושה ימים לאחר פציעה פגיעה, תפקוד המכשול המלא שוחזר בשבוע לאחר הפציעה. ( ב ) מחייב של אוונס כחול כדי אבי העורקים infarenal היה quantitated על ידי eluting בלונס כחול מן הדגימה ואת כימות על ידי עוצמת הקרינה. הנתונים מוצגים כאמצעים וסטיות תקן. רוב אוואנס כחול היה eluted מן אבי העורקים מיד לאחר פציעה. בזמן הפציעה, אבי העורקים קשורה מעל פי שלושה פעמים יותר אוונס כחול מאשר אבי העורקים נתון laparotomy לבד. כאשר אבי העורקים הורשו להתאושש, היה פחות מחייב באחד ושלושה ימים לאחר הפציעה. שבוע לאחר הפציעה, אבי העורקים קשרו את אותה כמות של אוואנס כחול כמו aortas נתון laparotomy לבד. משמעות סטטיסטית נקבעה עם מבחן הזנב של שני הזנב. * דההערות p <0.05, n = 3, NS מציין שאין משמעות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
יש לנו מאופיין את ההשפעות של מודל פגיעה אבץ Murine שמביא hyperplasia המדיאלי תפקוד לקוי של האנדותל. ניתוק EC חלקי לאורך האינטימה של אבי העורקים מלווה באובדן מגע של תאים סלולריים ושיפור של בליטות התא. במקביל, תפקוד מחסום האנדותל היה לקוי באופן משמעותי, אשר גירוי נתיבי איתות המיטוגניים רגישים, מה שמוביל לשגשוג של VSMCs ועיבוי של קיר כלי השיט. נקודות החוזק של מודל זה הן כי קל יותר מבחינה טכנית ללמוד ולבצע מאשר מודלים אחרים של אבי העורקים של המחלה ומאפשר הערכה סימולטנית הן של התגובה לשגשוג לפגיעה בתפקוד האנדותל. השלב הקריטי בפרוטוקול זה הוא פגיעה בפועל למחוץ. ההשתנות במידת הפגיעה במוח עלולה לגרום לדרגות שונות של פציעה ולפיכך סכומים משתנים מתרבים בתאי השרירים. צעד אחד שמפחית את השונות הזו במעבדה שלנו הוא שיש אחדCientist, עיוור לטיפול או מצב ניסיוני, לבצע את כל פציעות למחוץ.
מגבלה של מודל זה היא generalisability שלה לתהליכים רפואיים רלוונטיים קלינית האדם. למרות התגובה המתרבתית החזקה של VSMCs במודל זה, היא אינה מדגמנת את האירועים המאוחרים של ההתחדשות, כלומר לא פיתחה neointima. ירידה מתווכים דלקתיים כגון ציטוקינים עשוי להסדיר את התהליך הזה. ממצא זה יכול להיות בגלל ההתאוששות המהירה של האנדותל מפגיעה חלקית. בדומה לדו"ח שדווח בעבר על פגיעה במחלת כלי הדם בארנבות 13 , חדירת תאי החיסון היתה מינורית. במסגרת החקירה הנוכחית הערכנו פרופיל של ציטוקינים דלקתיים חיות דמה וחיות פציעה אבי העורקים עם מערך Profiler. עם זאת, לא היה הבדל משמעותי בפרופיל ציטוקינים שיסביר את ההבדל בתגובת השגשוג בין חיות דמה לבין חיות פצועות (נתוניםלא מוצג). הפגיעה המתוארת בדוח זה מוגבלת זמנית. בעוד מודלים אחרים של פגיעה אבי העורקים hyperplasia אינטימלית כגון מודל האנגיופלסטיקה אבי העורקים שולל לחלוטין את האנדותל, המודל הנוכחי רק שולל חלקית את אבי העורקים. השלמה מלאה של האנדותל דורש זמן רב יותר כדי להתאושש בעלי חיים אלה לחוות את ההשפעות של פגיעה במשך תקופה ארוכה יותר של זמן.
מודל זה מייצר תגובה מהירה של VSMCs ו ECS לפגיעה המאפשר כימות של שינויים מורפולוגיים וביוכימיים בשבוע אחד. זה יעיל יותר מאשר מודלים אחרים שלוקחים 14-28 ימים לפני ההשפעה של התערבות ניכרת. מודל זה משתמש אבי העורקים Murine המהווה את כלי מורין רק כי קרוב כלי קליני רלוונטי אנושי. היתרון המשמעותי של טכניקה זו בהשוואה למודלים אחרים של אבי העורקים הוא כי מודל זה קל יחסית ללמוד, ואינו דורש יקר או קשה להשיג eqUipment 2 , 3 , 4 , 5 . לסיכום, Murine פגם אבי העורקים פגיעה המודל מספק פשוטה טכנית, זול, יעיל פלטפורמת vivo כדי להעריך בו זמנית את התגובה של VSMCs ו ECS כדי פגיעה בכלי הדם.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עבודה זו מומנה על ידי המחלקה לענייני וותיקים לענייני פיתוח קריירה פרס (1IK2BX001553-01) (TSM) ואת התרופות וסקולרי EJ Wylie מלגות (TSM).
Acknowledgments
אנו מודים Hsia Ru-ching דוקטורט, מן אלקטרונית מיקרוסקופית הליבה מתקן של אוניברסיטת מרילנד בית הספר לרפואה, על התמיכה הטכנית שלה בעיבוד סריקה דגימות מיקרוסקופיה אלקטרונית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Pharmaceutical agents |
| Isoflurane | VetOne | 502017 | Pharmaceutical agents |
| Carprofen | Zoetis | 26357 | Pharmaceutical agents |
| Precision vaporizer | Summit Medical | 10675 | Surgical supplies |
| Charcoal scavenger | Bickford Inc. | 80120 | Surgical supplies |
| Isothermal pad | Harvard Apparatus | 50-7053-R | Surgical supplies |
| Sterile cotton-tipped applicator | Fisher Scientific | 23-400-124 | Surgical supplies |
| 4-0 absorbable monofilament suture | Ethicon, Inc | J310 | Surgical supplies |
| 5-0 non-absorbable monofilament suture | Ethicon,Inc | 1666 | Surgical supplies |
| 21-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305165 | Surgical supplies |
| 25-gauge x 1 inch needle | BD Biosciences | 305125 | Surgical supplies |
| Dry sterilizer | Cellpoint | 7770 | Surgical supplies |
| Fine scissors | Fine Science Tools | 14058-09 | Surgical instruments |
| Adson forceps | Fine Science Tools | 11006-12 | Surgical instruments |
| Dumont #5 fine forceps | Fine Science Tools | 11254-20 | Surgical instruments |
| Vannas Spring Scissors 3 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15000-00 | Surgical instruments |
| Needle driver | Fine Science Tools | 91201-13 | Surgical instruments |
| Scalpel handle #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | Surgical instruments |
| Scalpel blades #10 | Fine Science Tools | 10010-00 | Surgical instruments |
| PBS | Lonza | 17-516F | Reagents for tissue processing |
| Evans Blue | Sigma-Aldrich | E2129 | Reagents for tissue processing |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Reagents for tissue processing |
| Modeling wax | Bego | 40001 | Reagents for tissue processing |
| OCT compound | Tissue-Tek Sakura | 4583 | Reagents for tissue processing |
| Mayer's hematoxylin solution | Sigma-Aldrich | MHS16 | Reagents for immunohistological analysis |
| Eosin Y solution alcoholic | Sigma-Aldrich | HT110316 | Reagents for immunohistological analysis |
| Elastin stain kit | Sigma-Aldrich | HT25A | Reagents for immunohistological analysis |
| Click-it Edu Alexa-488 Imaging Kit | Invitrogen | C10337 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4695 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-phospho-Erk1/2 antibody | Cell Signaling Technology | 4370 | Reagents for immunohistological analysis |
| Anti-p27kip1 antibody | Cell Signaling Technology | 3698 | Reagents for immunohistological analysis |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T9159 | Reagents for immunohistological analysis |
References
- Carmeliet, P.
- Carmeliet, P., Moons, L., Collen, D. Mouse models of angiogenesis, arterial stenosis, atherosclerosis and hemostasis. Cardiovasc Res. 39 (1), 8-33 (1998).
- Baker, A. B., et al. Heparanase Alters Arterial Structure, Mechanics, and Repair Following Endovascular Stenting in Mice. Circ Res. 104 (3), 380-387 (2009).
- Petrov, L., Laurila, H., Hayry, P., Vamvakopoulos, J. E. A mouse model of aortic angioplasty for genomic studies of neointimal hyperplasia. J Vasc Res. 42 (4), 292-300 (2005).
- Li, J., et al. Vascular smooth muscle cells of recipient origin mediate intimal expansion after aortic allotransplantation in mice. Am J Path. 158 (6), 1943-1947 (2001).
- Radu, M., Chernoff, J. An in vivo assay to test blood vessel permeability. J Vis Exp. (73), e50062 (2013).
- Turbett, G. R., Sellner, L. N. The use of optimal cutting temperature compound can inhibit amplification by polymerase chain reaction. Diagn Mol Pathol. 6 (5), 298-303 (1997).
- Puchtler, H., Waldrop, F. S. On the mechanism of Verhoeff's elastica stain: a convenient stain for myelin sheaths. Histochem. 62 (3), 233-247 (1979).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (7), 2415-2420 (2008).
- Nelson, P. R., Yamamura, S., Mureebe, L., Itoh, H., Kent, K. C. Smooth muscle cell migration and proliferation are mediated by distinct phases of activation of the intracellular messenger mitogen-activated protein kinase. J Vasc Surg. 27 (1), 117-125 (1998).
- Rzucidlo, E. M. Signaling pathways regulating vascular smooth muscle cell differentiation. Vascular. 17, Suppl 1. S15-S20 (2009).
- Aoki, T., Sumii, T., Mori, T., Wang, X., Lo, E. H. Blood-brain barrier disruption and matrix metalloproteinase-9 expression during reperfusion injury: mechanical versus embolic focal ischemia in spontaneously hypertensive rats. Stroke. 33 (11), 2711-2717 (2002).
- Yu, D., et al. MARCKS Signaling Differentially Regulates Vascular Smooth Muscle and Endothelial Cell Proliferation through a KIS-, p27kip1- Dependent Mechanism. PLoS One. 10 (11), e0141397 (2015).
- Banai, S., et al. Rabbit ear model of injury-induced arterial smooth-muscle cell-proliferation - kinetics, reproducibility, and implications. Circ Res. 69 (3), 748-756 (1991).
