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Cancer Research

एक व्यापक प्रक्रिया का मूल्यांकन करने के लिए Published: March 4, 2017 doi: 10.3791/55271
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 1, 2, 1
1Department of Radiology, Memorial Sloan Kettering Cancer Center, 2Translational and Molecular Imaging Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

Abstract

क्लिनिक में पिछले कैंसर nanomedicines की सफलता से प्रेरित होकर, शोधकर्ताओं ने पिछले एक दशक में उपन्यास योगों की एक बड़ी संख्या उत्पन्न किया है। हालांकि, केवल nanomedicines की एक छोटी संख्या, नैदानिक ​​इस्तेमाल के लिए अनुमोदित किया गया है, जबकि नैदानिक ​​विकास के तहत nanomedicines के बहुमत के निराशाजनक परिणाम का उत्पादन किया है। नए कैंसर nanomedicines के सफल नैदानिक अनुवाद करने के लिए एक प्रमुख बाधा उनके vivo के प्रदर्शन की सही समझ की कमी है। यह लेख पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी-गणना टोमोग्राफी (पीईटी-सीटी), रेडियोधर्मिता की मात्रा का ठहराव के तरीकों के एकीकरण के माध्यम से प्रणालीगत, ऊतक, एकल कोशिका, और subcellular स्तर पर ट्यूमर असर चूहों में nanomedicines के vivo व्यवहार को चिह्नित करने के लिए एक कठोर प्रक्रिया की सुविधा , प्रवाह cytometry, और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी। इस दृष्टिकोण का प्रयोग, शोधकर्ताओं सही Cance के प्रासंगिक माउस मॉडल में उपन्यास nanoscale योगों का मूल्यांकन कर सकते हैंआर। इन प्रोटोकॉल उच्च translational क्षमता के साथ सबसे होनहार कैंसर nanomedicines की पहचान करने के लिए या भविष्य अनुवाद के लिए कैंसर nanomedicines के अनुकूलन में सहायता करने की क्षमता हो सकती है।

Introduction

Nanomedicine कैंसर के इलाज के विकास के प्रतिमान 1 जा रहा है। ऐसे liposome- और एल्बुमिन आधारित nanotherapies 2, 3 के रूप में पिछले कैंसर nanomedicines, की जबरदस्त नैदानिक प्रभाव से प्रेरित होकर, कई उपन्यास योगों पिछले एक दशक में उत्पादन किया गया है। हालांकि, इन कैंसर nanomedicines के नैदानिक अनुवाद सफलता के हाल के विश्लेषण से संकेत मिलता है कि केवल एक उनमें से कुछ नैदानिक इस्तेमाल के 4, 5 के लिए अनुमोदित किया गया है। नए कैंसर nanomedicines के नैदानिक अनुवाद करने के लिए एक प्रमुख बाधा मुक्त चिकित्सीय यौगिकों 6 का सीधा प्रशासन के साथ तुलना में चिकित्सीय सूचकांक के अपने सीमित सुधार है। Preclinical पशु मॉडल में प्रणालीगत, ऊतक पर nanomedicines, और सेलुलर स्तर के vivo प्रदर्शन के इस तरह के, सटीक मूल्यांकन के रूप में identif के लिए आवश्यक हैY भविष्य नैदानिक ​​अनुवाद के लिए इष्टतम चिकित्सीय सूचकांकों के साथ थे।

Nanomaterials के साथ पोजीट्रान एमिशन टोमोग्राफी (पीईटी) इमेजिंग, जो सभी नैदानिक इमेजिंग तौर तरीकों के बीच 7 शानदार संवेदनशीलता और reproducibility है जानवरों के रहने में मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए radiolabeled हो सकता है। उदाहरण के लिए, 89 ZR-लेबल लंबे समय से घूम nanomedicines कैंसर 8, 9, 10, के रूप में अच्छी तरह से अन्य रोग मॉडल 11 में के लिए माउस मॉडल में विशेषता किया गया है। इसके अलावा, रक्त आधा जीवन और nanomedicines के biodistribution बड़े पैमाने पर अलग-अलग ऊतकों 8 में पूर्व vivo रेडियोधर्मिता माप का उपयोग द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इसलिए, radiolabeling प्रणालीगत और ऊतक स्तरों पर nanomedicines की मात्रात्मक मूल्यांकन के लिए अनुमति देता है।

महत्वपूर्ण बात है, radiolabeleडी nanomedicines आम तौर पर रेडियोधर्मी सिग्नल की सीमित स्थानिक संकल्प के कारण एकल कोशिका या subcellular स्तर पर विश्लेषण नहीं किया जा सकता है। इसलिए, फ्लोरोसेंट लेबलिंग इस तरह के फ्लो और प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी 12 के रूप में ऑप्टिकल इमेजिंग तकनीक के साथ नैनोकणों के मूल्यांकन के लिए एक पूरक साधन साबित होता है। यह अंत करने के लिए, radioisotopes और फ्लोरोसेंट टैग के साथ लेबल नैनोकणों मात्रात्मक विवो में परमाणु इमेजिंग द्वारा पूर्व vivo रेडियोधर्मिता गिनती द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है और, और वे भी बड़े पैमाने पर ऑप्टिकल इमेजिंग द्वारा सेलुलर स्तर पर होती जा सकता है।

इससे पहले, हम मॉड्यूलर प्रक्रियाओं को विकसित किया है उच्च घनत्व वाले लिपोप्रोटीन (एचडीएल) 11, liposomes 9, 10, बहुलक नैनोकणों, एंटीबॉडी के टुकड़े, और nanoemu सहित विभिन्न नैनोकणों में रेडियोधर्मी और फ्लोरोसेंट लेबल शामिल करने के लिएlsions 10, 13। ये लेबल नैनोकणों विभिन्न स्तरों पर प्रासंगिक पशु मॉडल है, जो अपने विशिष्ट अनुप्रयोगों के लिए इन nanomaterials के अनुकूलन निर्देशित में मात्रात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति दी है। वर्तमान अध्ययन में, उद्देश्य लिपोसोमल नैनोकणों के लिए उपयोग करने के लिए सबसे स्थापित nanomedicine मंच 14 व्यापक प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करने के लिए एक उदाहरण -as एक दोहरे लेबल nanoparticle उत्पन्न करने के लिए और अच्छी तरह से एक क्लासिक syngeneic मेलेनोमा B16-F10 माउस मॉडल 15 में यह चिह्नित करने के लिए है । परिणामों से, हमें विश्वास है इस nanoparticle लक्षण वर्णन दृष्टिकोण प्रासंगिक माउस मॉडल में अन्य कैंसर nanomedicines का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।

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Protocol

प्रक्रिया नैनोकणों की दोहरी रेडियोधर्मी और फ्लोरोसेंट लेबलिंग, विवो पीईटी-सीटी इमेजिंग, पूर्व vivo biodistribution माप, और पूर्व vivo immunostaining के होते हैं और प्रवाह cytometry विश्लेषण करती है। सभी पशु प्रयोगों मेमोरियल स्लोन केटरिंग कैंसर सेंटर के संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. दोहरी लेबल liposomes की तैयारी

नोट: syngeneic B16 मेलेनोमा ट्यूमर 2% -isoflurane युक्त ऑक्सीजन inhaling से संज्ञाहरण के तहत C57BL / 6 चूहों की पीठ flanks में 300,000 B16-F10 कोशिकाओं को इंजेक्शन द्वारा प्रेरित किया जा सकता है। सर्जरी के दौरान एक बाँझ कार्यक्षेत्र में बाँझ अभिकर्मकों और उपकरणों का उपयोग करें। सर्जरी के बाद, ध्यान से संज्ञाहरण से उनके वसूली तक जानवरों निरीक्षण करते हैं। जानवरों को उनके पिंजरों में वापस रखो केवल जब वे पूर्ण चेतना और गतिशीलता हासिल। उन्हें xenografted ट्यूमर के साथ जानवरों के लिए बाँझ कमरे में घर। एक आकार के साथ ट्यूमर300 मिमी 3 उनकी सुनाया बढ़ाया पारगम्यता और प्रतिधारण प्रभाव (EPR) है, जो nanoparticle संचय में वृद्धि कर सकते हैं के कारण nanoparticle लक्षण वर्णन के लिए आदर्श होते हैं। विस्तृत प्रोटोकॉल नीचे दिया गया है।

  1. एक दौर नीचे कुप्पी में, युक्त क्लोरोफॉर्म 1,2-dipalmitoyl- एस.एन. -glycero-3-phophocholine (DPPC), कोलेस्ट्रॉल, 1,2-disearoyl- एस.एन. -glycero- के 2 एमएल में लिपिड के 20 मिलीग्राम की एक मिश्रण भंग 3-phosphoethanolamine-पाली (एथिलीन ग्लाइकोल) 2000 (डीएसपीई-PEG2000), डीएसपीई-deferoxamine (डीएसपीई-डीएफओ) 8, और 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disulfonic एसिड ( DiIC12 [5] 61.3%, 33.4%, 5, 0.2%, और 0.1%, क्रमशः की दाढ़ अनुपात में -DS)।
    नोट: यह लिपिड रचना बहुत डॉक्सोरूबिसिन की लिपोसोमल निर्माण वर्तमान में क्लिनिक 2 में उपयोग करने के लिए इसी तरह की है। हमारे प्रक्रिया से उत्पन्न liposomes बारीकी से नैदानिक nanomedic के vivo प्रदर्शन नकल करेंगेine।
  2. कार्बनिक विलायक हटाने और कमरे के तापमान पर एक पतली लिपिड फिल्म बनाने के लिए एक रोटरी बाष्पीकरण का प्रयोग करें। पीबीएस के 20 एमएल जोड़ें और 30 मिनट के लिए sonicate एक 3.8 एमएम sonication टिप और 30 डब्ल्यू के एक आयाम, बर्फ पर पर्याप्त ठंडा करने के साथ उपयोग करके लिपोसोमल नैनोकणों उत्पन्न करते हैं।
  3. अपकेंद्रित्र समुच्चय पीबीएस केन्द्रापसारक निस्पंदन (आणविक वजन कट ऑफ (MWCO उपयोग कर के साथ नैनोकणों को हटाने और धोने के लिए 10 मिनट के लिए 4000 XG पर liposome समाधान:, 100 केडीए) मुक्त लिपिड और अवशिष्ट कार्बनिक विलायक दूर करने के लिए liposomes ध्यान लगाओ जो होगा। शीर्ष चैम्बर में बने हुए हैं, और उन्हें एक नया ट्यूब को हस्तांतरण। liposomes बाद के चरणों से पहले अप करने के लिए 1 सप्ताह के लिए पीबीएस में एक फ्रिज में संग्रहित किया जा सकता है।
  4. गुणवत्ता नियंत्रण के लिए, गतिशील प्रकाश बिखरने (DLS) द्वारा liposomes विशेषताएँ। विशेष रूप से, liposomes की 50 μL मिश्रण पीबीएस के 950 μL के साथ, और फिर नौकरशाही का आकार घटाने क्युवेट में मिश्रण हस्तांतरण। विश्लेषक में क्युवेट प्लेस और यह कण को ​​मापनेआकार और उनके आकार के वितरण। 120 एनएम और 0.1 - - 0.2, क्रमशः कण आकार और उनके आकार के वितरण (polydispersity सूचकांक (PDI)) 90 होने की उम्मीद कर रहे हैं।
  5. Radiolabeling के लिए, शुद्ध liposomes, लिपिड के 2 मिलीग्राम के बराबर, पीबीएस में 1 mCi 89 ZR-oxalate के साथ 6.9 और 7.1 के बीच एक पीएच में 37 डिग्री सेल्सियस पर 2 घंटे के लिए एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में मिश्रण, (कुल मात्रा: ~ 100 μL)। केन्द्रापसारक निस्पंदन (MWCO = 100 केडीए), चरण 1.3 समान से मुक्त, unreacted 89 Zr निकालें। बाँझ पीबीएस के साथ retentate धो और वांछित मात्रा करने के लिए इसे पतला। 95% - radiochemical उपज 80 होना चाहिए।
    सावधान! रेडियोधर्मी सामग्री के साथ कार्य करना अत्यधिक विनियमित है। संस्थानों प्रमाणित और आवश्यक सुविधाएं, कर्मियों को प्रशिक्षण, और रेडियोधर्मिता उपयोग की सख्त निगरानी प्रदान किया जाना चाहिए। शोधकर्ताओं का पर्याप्त प्रशिक्षण प्राप्त करते हैं और व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण और dosimetry छल्ले / बैज पहनने के लिए जब रेडियोधर्मिता से निपटने के लिए की जरूरत है।
    6. 10 से अधिक होना चाहिए द्वारा radiolabeled liposomes की radiochemical पवित्रता का निर्धारण करते हैं। Radiochemical purities 95% से कम 1.5 कदम पर अपर्याप्त कपड़े धोने के संकेत हैं।
  6. radiolabeling के बाद, गतिशील प्रकाश बिखरने द्वारा नैनोकणों के आकार का निर्धारण। आकार और PDI 1.4 चरण 10 में माप के रूप में ही सीमा के भीतर होने की उम्मीद कर रहे हैं।
    नोट: रेडियोधर्मी नमूनों प्रवाह या प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में अनुमति नहीं है, तो गैर रेडियोधर्मी नेट ZR-oxalate 1.5 चरण में liposomes लेबल करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ये गैर रेडियोधर्मी liposomes उनकी रेडियोधर्मी analogs के समान लक्षण हैं। इस प्रक्रिया का एक चित्रण चित्रा 2 में प्रदान की जाती है।

2. विवो पीईटी-सीटी इमेजिंग और दोहरी लेबल liposomes की biodistribution में

  1. दोहरे लेबल liposomes w के बारे में 100 μL इंजेक्षनith रोका मेलेनोमा चूहों में रेडियोधर्मिता के बारे में 300 μCi (C57BL / 6, महिला, 10 - 16 सप्ताह पुराने) उनके पूंछ नसों के माध्यम से, के बारे में 10 mCi 89 Zr / किग्रा शरीर के वजन पर।
  2. आधा जीवन का निर्धारण करने के लिए, 2% ऑक्सीजन 28-जी इंसुलिन सीरिंज का उपयोग कर isoflurane युक्त तहत anesthetized जानवरों से पूंछ नस से खून आकर्षित। 2 मिनट, 15 मिनट, 1 घंटे, 4 घंटे, 8 घंटे, 24 घंटे, और इंजेक्शन के बाद 48 घंटे में - (20 μL 10) पूर्व तौला नलियों में रक्त ले लीजिए। , अंतर से रक्त का वजन एक गामा काउंटर का उपयोग रेडियोधर्मिता सामग्री का निर्धारण, और ग्राम प्रति इंजेक्शन की खुराक (% आईडी / छ) के प्रतिशत के रूप में रेडियोधर्मिता एकाग्रता की गणना।
    ध्यान दें: एक कमरे में एक संज्ञाहरण प्रणाली, वसूली पिंजरों, हीटिंग, और एक biohazard हुड के साथ सुसज्जित में प्रक्रिया करते हैं। सुनिश्चित करें कि जानवरों को पूरी तरह से ठीक हो और उन्हें वसूली पिंजरों से पिंजरों धारण करने के लिए स्थानांतरित करने से पहले की प्रक्रिया के बाद सामान्य गतिशीलता हासिल करें। सभा के साथ प्रशासित जानवरों के लिए नामित कमरे में ट्यूमर असर जानवरोंरेडियोधर्मी सामग्री।
  3. 24 या 48 घंटे के इंजेक्शन के बाद liposomes, छवि एक छोटे जानवर MicroPET सीटी स्कैनर 10 में चूहों। उसके पेट पर क्षैतिज anesthetized जानवर प्लेस और यह anesthetized रखने के लिए। एक नाक शंकु के माध्यम से प्रशासन 2% isoflurane ऑक्सीजन। स्कैन उन्हें सूखने से रोकने के लिए पहले अपनी आंखों को नेत्र मरहम लागू करें।
  4. 15 मिनट की एक अनुमानित अवधि के साथ, एक पूरे शरीर पीईटी स्कैन स्थिर रिकॉर्डिंग में कम से कम 50 लाख संपाती घटनाओं प्रदर्शन करना। क्रमश: 350-700 कीव और 6 एनएस पर ऊर्जा और संयोग समय विंडो सेट करें। बाद में, एक 5 मिनट गणना टोमोग्राफी (सीटी) स्कैन करते हैं। 80 केवी और 500 μA के एक वर्तमान के एक वोल्टेज के लिए एक्स-रे ट्यूब सेट; सीटी स्कैन 220 डिग्री के लिए कुल 120 घूर्णी कदम का उपयोग करता है, 10 फ्रेम प्रति लगभग 145 एमएस के साथ।
  5. पीईटी-सीटी स्कैन के बाद, तुरंत कार्बन डाइऑक्साइड asphyxiation द्वारा चूहों बलिदान और Pinchi से होने वाली मौतों की पुष्टिजानवरों के पंजे एनजी। एक बार पुष्टि की है, ग्रीवा dislocations प्रदर्शन करते हैं।
  6. पहली खुली सही आलिंद काटने और फिर बाएं वेंट्रिकल में 20 एमएल पीबीएस इंजेक्शन द्वारा माउस ऊतकों में रक्त निकालें, और बाद में इस तरह के ट्यूमर, जिगर, तिल्ली, फेफड़े, गुर्दे, मांसपेशियों, और दूसरों के रूप में 16 प्रासंगिक ऊतकों इकट्ठा।
  7. ऊतकों वजन, गामा 8, 9 की गणना के द्वारा उनकी रेडियोधर्मिता मापने सामग्री, और प्रति ग्राम के इंजेक्शन की खुराक (% आईडी / छ) के एक प्रतिशत के रूप में ऊतक रेडियोधर्मिता संचय की गणना।

3. पूर्व विवो फ्लो और Immunostaining

नोट: प्रति किलो शरीर के वजन के डाई की 0.5 मिलीग्राम की एक खुराक पर उनकी पूंछ नस के माध्यम से मेलेनोमा चूहों में फ्लोरोसेंट liposomes की इंजेक्षन के बारे में 100 μL। रेडियोधर्मी नमूनों प्रवाह कोशिकामापी और प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी में अनुमति नहीं है, तो गैर रेडियोधर्मी liposomes इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

  1. चूहों 24 घंटे के बाद इंजेक्शन बलिदान, 2.5 कदम के रूप में, और ट्यूमर है, जो ठंड पीबीएस में संग्रहीत किया जाना चाहिए इकट्ठा।
  2. से फ्लो के लिए, इन चरणों का 17 का पालन करें:
    1. एक एंजाइम शुद्ध collagenase मैं और द्वितीय (4 यू / एमएल), hyaluronidase (60 यू / एमएल), और DNase मैं (60 यू / एमएल) का एक मिश्रण के 0.5% BSA और 1 के साथ (पीबीएस बफर प्रवाह cytometry में मिलकर कॉकटेल तैयार मिमी EDTA)।
    2. एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में एंजाइम कॉकटेल बफर के 200 μL के साथ ट्यूमर के ऊतक के 100 मिलीग्राम मिक्स और ठीक कैंची के साथ छोटे टुकड़े करने के लिए ऊतक पासा। एंजाइम कॉकटेल का एक और 1.3 एमएल ट्यूब में जोड़ें और एक 6 अच्छी तरह से थाली करने के लिए अपनी सामग्री को हस्तांतरण।
    3. 60 rpm पर 60 मिनट के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस ओवन के अंदर रखा एक क्षैतिज प्रकार के बरतन पर 6 अच्छी तरह से थाली हिला।
    4. एक एकल कक्ष निलंबन प्राप्त करने के लिए बफर प्रवाह cytometry के साथ ऊतक homogenate 3 बार धोएं।
    5. CD45, CD11b, Ly6C, CD11c सहित बायोमार्कर के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के एक कॉकटेल के साथ कोशिकाओं दाग,CD64, CD3, MHCII, और CD31 (1: सभी एंटीबॉडी के लिए 200 कमजोर पड़ने; क्लोन सूचना सामग्री स्प्रेडशीट में प्रदान की जाती है)। प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं को पहचानें और DiIC12 के अपने मतलब प्रतिदीप्ति तीव्रता (एमएफआई) का निर्धारण (5) विश्लेषण सॉफ्टवेयर cytometry एक उचित प्रवाह के साथ प्रत्येक कोशिका आबादी में -DS।
  3. immunostaining के लिए, इन चरणों का पालन करें:
    1. एक ट्यूमर एक कैसेट इष्टतम काटने मध्यम (अक्टूबर) के साथ भर में रखें और सूखी बर्फ पर यह फ्रीज।
    2. ट्यूमर के ऊतक से 6 माइक्रोन जमे हुए वर्गों बनाने और ऊतक विज्ञान गिलास स्लाइड पर उन्हें जगह; वर्गों ट्यूमर का सबसे बड़ा पार वर्गों, जो ऊतकों पर सबसे अधिक प्रतिनिधि जानकारी उपलब्ध कराने को कवर करना चाहिए।
    3. बायोमार्कर दाग (जैसे, endothelial कोशिकाओं के लिए CD31) इसी एंटीबॉडी (जैसे, विरोधी CD31, क्लोन MEC13.3) के साथ ब्याज की। paraformaldehyde के साथ वर्गों को ठीक करें; उन्हें सीरम माध्यमिक एंटीबॉडी की प्रजातियों मूल मिलान के साथ ब्लॉक; incub4 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ खाया और उसके बाद 2 घंटे के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ; और अंत में, पीबीएस के साथ धोने और कवर फिसल जाता है के साथ कवर। छवि एक ईमानदार confocal लीका SP5 माइक्रोस्कोप 13, 16 के साथ दाग स्लाइड।

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Representative Results

चित्रा 1 प्रक्रिया के एक सिंहावलोकन पता चलता है। चित्रा 2 चरण 1 से 10 में वर्णित दोहरे लेबल liposomes की योजनाबद्ध संश्लेषण प्रक्रिया प्रस्तुत करता है। चित्रा 3 दिखाता एक प्रतिनिधि पीईटी-सीटी छवि (चित्रा 3 ए), पीईटी इमेजिंग (चित्रा 3 बी), रक्त आधा जीवन (चित्रा 3 सी), और रेडियोधर्मी नैनोकणों के biodistribution (चित्रा 3 डी) से रेडियोधर्मिता की मात्रा का ठहराव, चरण 2 में वर्णित के रूप में चित्रा 3 ए, liposomes अत्यधिक ट्यूमर है, जो चित्रा 3 बी में इमेजिंग परिणाम की मात्रा का ठहराव द्वारा पुष्टि की है में जमा है। इसके अलावा, liposomes चित्रा -3 सी में लगभग 10 घंटा की रक्त आधा जीवन दिखा। पूर्व vivo biodistribution liposomes की उच्च ट्यूमर संचय की पुष्टि करता है। अंत में, चित्रा 4 एक ठेठ gating जनसंपर्क प्रदान करता हैocedure nanoparticle संचय की एकल कोशिका स्तर के विश्लेषण के लिए एक ट्यूमर में प्रासंगिक कोशिकाओं की पहचान करने के लिए (चित्रा 4 ए और बी) है, जो ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज (टीएएम) में nanoparticle के तरजीही संचय प्रदर्शित करता है। एक प्रतिनिधि confocal माइक्रोस्कोपी छवि भी नैनोकणों और endothelial कोशिकाओं (चित्रा 4C) के बीच ओवरलैप पता चलता है।

आकृति 1
चित्र 1 में विवो Nanomedicine विशेषता प्रक्रिया के योजनाबद्ध अवलोकन। यह प्रक्रिया दोनों रेडियोधर्मी और फ्लोरोसेंट टैग के साथ नैनोकणों की लेबलिंग भी शामिल है; पीईटी-सीटी इमेजिंग, रक्त आधा जीवन माप, और biodistribution मूल्यांकन के साथ radiolabeled नैनोकणों के लक्षण वर्णन; और एकल कोशिका और फ्लो और मैं द्वारा फ्लोरोसेंट नैनोकणों के उप सेलुलर विश्लेषणmmunostaining, क्रमशः। तकनीक, बाएं से दाएं, विवो संचय में nanoparticle के स्थानिक संकल्प बढ़ती जा रही हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. संश्लेषण दोहरे लेबल liposomes की प्रक्रिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. radiolabeled नैनोकणों के vivo लक्षण वर्णन के प्रतिनिधि परिणाम है। (क) एक Tumo की पीईटी-सीटी छवियोंnanoparticle इंजेक्शन और कई ऊतकों में (ख) पीईटी व्युत्पन्न तेज मूल्यों के बाद आर असर माउस (एन = 3)। (ग) रक्त रेडियोधर्मिता एक radiolabeled nanoparticle के आधे जीवन के साथ-साथ (घ) अपने 24 घंटे के बाद इंजेक्शन पर biodistribution (एन = 3)। त्रुटि सलाखों के मानक विचलन कर रहे हैं। संदर्भ 8 से संशोधित, अनुमति के साथ। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4. फ्लोरोसेंट नैनोकणों के vivo लक्षण वर्णन के प्रतिनिधि परिणाम है। (क) ट्यूमर जुड़े प्रतिरक्षा कोशिकाओं, ट्यूमर कोशिकाओं, और endothelial कोशिकाओं (ईसी) के साथ-साथ (ख) nanoparti की मात्रा का ठहराव की पहचान करने के लिए एक ठेठ से फ्लो gating प्रक्रियाइन कोशिकाओं में 8 CLE संचय। 3 जैविक दोहराता के एक प्रतिनिधि छवि। (ग) प्रतिनिधि इम्यूनोफ्लोरेसेंस एक RGD संयुग्मित nanoemulsion के विशिष्ट लक्ष्यीकरण दिखा ट्यूमर 13 में endothelial कोशिकाओं के लिए छवि। संदर्भ 8 और 13 से संशोधित, अनुमति के साथ। ट्यूमर जुड़े मैक्रोफेज (टीएएम)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम:

दोहरे लेबल liposomes की उच्च गुणवत्ता के साथ समय की एक लंबी अवधि में लगातार परिणामों के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण है। फ्री फ्लोरोसेंट रंगों या 89 Zr आयनों पूरी तरह से अलग लक्ष्य-निर्धारण पैटर्न उत्पन्न कर सकते हैं और पूरी तरह से शुद्धि चरण के दौरान हटा दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, यदि प्रतिरक्षा प्रणाली काफी प्रयोगात्मक कैंसर nanomedicine प्रदर्शन को प्रभावित करता है, असुरक्षित माउस मॉडल के उपयोग के लिए बेहतर है, ऐसे C57BL / 6 चूहों में B16-F10 मेलेनोमा मॉडल है, जो इस प्रोटोकॉल भर में इस्तेमाल किया गया था के रूप में होना चाहिए। ट्यूमर microenvironment या आनुवंशिक परिवर्तन की एक विशेष संयोजन एक प्रमुख कारक है, तो रोगी व्युत्पन्न ट्यूमर xenograft मॉडल आदर्श विकल्प होगा।

संशोधन और समस्या निवारण:

हमारी प्रक्रिया में nanomedicines के vivo प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए एक सरल और विश्वसनीय तरीका प्रदान करता है एक ट्यूमर असरimals। यह प्रक्रिया एक रीढ़ की हड्डी के विभिन्न अनुप्रयोगों के लिए कैंसर nanomedicines को चिह्नित करने के लिए विशिष्ट प्रयोगों के निर्माण के रूप में कार्य करता है। उदाहरण के लिए, शोधकर्ताओं nanomaterial जब पीईटी-सीटी स्कैन एक ही जानवरों 17 पर कई समय बिंदुओं पर प्रदर्शन कर रहे हैं की मात्रात्मक इन विवो फार्माकोकाइनेटिक्स निर्धारित कर सकते हैं; वे के रूप में अन्य प्रकाशनों में दिखाया गया है, इस तरह की बड़ी आंत, छोटी आंतों, अग्न्याशय, मस्तिष्क, त्वचा, थाइमस, पेट, या लार ग्रंथियों के रूप में अन्य ऊतकों, विश्लेषण करके nanomaterials के biodistribution जानकारी एकत्र कर सकते हैं 18, 19, 20, 21; या वे cytometry इस प्रवाह को लागू करने और प्रोटोकॉल immunostaining द्वारा एकल कोशिका और ट्यूमर के अलावा अन्य प्रासंगिक ऊतकों में nanomedicines की subcellular विशिष्टता का मूल्यांकन कर सकते हैं।

तकनीक की सीमाएं:

इस प्रोटोकॉल requires कुछ विशेष अनुसंधान बुनियादी ढांचे सहित Radiochemistry और इमेजिंग सुविधाओं और में radiolabeling, छोटे पशु इमेजिंग, और इम्यूनोलॉजी तकनीकी विशेषज्ञता। इसलिए, यह आदर्श संबंधित क्षेत्रों में विशेषज्ञता के साथ शोधकर्ताओं की एक टीम इन दोनों क्षेत्रों द्वारा निष्पादित किया जाएगा। हमारे अपने अनुभव से पता चलता है कि इस प्रक्रिया का इष्टतम निष्पादन सावधान योजना और कुशल सहयोग की आवश्यकता है।

यह ध्यान देने योग्य है कि इस पांडुलिपि में विशिष्ट प्रोटोकॉल और प्रस्तावित एजेंटों सबसे अच्छा लिपिड आधारित नैनोकणों radiolabeling के लिए उपयुक्त हैं लायक है। हालांकि, दोहरे लेबल नैनोकणों की अवधारणा अन्य nanoparticle योगों कि, उदाहरण के लिए, सोने nanocrystals, पॉलिमर, या यहां तक ​​कि वायरल कणों के आधार पर कर रहे हैं चिह्नित करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। इन मामलों में, अलग-अलग रणनीतियों लेबलिंग की आवश्यकता होगी। यह रेडियोधर्मी आइसोटोप बायोमेडिकल इमेजिंग में इस्तेमाल की व्यापक विविधता पर जोर देना जरूरी है, 89 Zr, 18 सहित 64 घन, 68 गा, और 123 रहा, बस कुछ ही नाम के लिए 7। रेडियो आइसोटोप का चुनाव बाद समय बिंदुओं पर पूर्ण लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देने के लिए, जांच के तहत nanomaterial के विशिष्ट गुणों के आधार पर किया जाना चाहिए मुख्यतः अपने रक्त परिसंचरण आधा जीवन। हालांकि, इस तरह लेबलिंग रसायन शास्त्र या आइसोटोप उपलब्धता के रूप में अन्य कारकों, अंतिम चयन को प्रभावित कर सकता है। इस अध्ययन के लिए, 89 Zr चुना गया था क्योंकि अपने लंबे शारीरिक आधा जीवन (1/2 टी = 78.4 ज) liposomes की रक्त आधा जीवन के बराबर है। ध्यान से, इस प्रोटोकॉल भी अन्य आइसोटोप के साथ, 99m टीसी, 111, या 125 मैं जैसा प्रदर्शन किया जा सकता है कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध और एकल फोटान उत्सर्जन गणना टोमोग्राफी (SPECT) के साथ इमेजिंग के लिए उपयुक्त हैं। इसी तरह, DilC इसकी उच्च hydrophobicity और liposomes में इसलिए उच्च लोड क्षमता के कारण चुना गया था। प्रतिकूल भौतिक properti के साथ अन्य फ्लोरोसेंट रंजकतों सीधे फॉस्फोलिपिड 17 संयुग्मित जा सकता है।

तकनीक का महत्व:

यह प्रक्रिया उच्च translational संभावित जब नैदानिक ​​अध्ययन में nanomedicines का मूल्यांकन करने के लिए अनुकूलित प्रस्तुत करता है। 4 कुंजी तकनीक अर्थात्, पीईटी-सीटी इमेजिंग, रेडियोधर्मिता माप, प्रवाह cytometry, और immunohistochemistry-कर रहे हैं नियमित रूप से रोगियों में आंकलोजिकल निदान के लिए इस्तेमाल किया। इसलिए, इस प्रक्रिया को आसानी से preclinical नैदानिक चरण में nanomedicines के vivo प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए अनुवाद किया जा सकता है। इसके अलावा, चूहों की तुलना में मानव अंगों के बड़े आकार पीईटी-सीटी इमेजिंग 22 है, जो nanomedicine संचय की आक्रामक बायोप्सी आधारित रेडियोधर्मिता माप की जगह ले सकता से अधिक सटीक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इस माहौल में, गैर इनवेसिव, इमेजिंग निर्देशित प्रोटोकॉल रोगियों विभक्त हो जाना करने के लिए और मदद करने के लिए रोगी परिणाम 10 homogenize विकसित किया जा सकता है। एच.डी.रेडियोधर्मी nanomaterials loping अभी भी पर्याप्त बुनियादी ढांचे के निवेश की आवश्यकता है। वैकल्पिक रूप से, गैर रेडियोधर्मी इमेजिंग तकनीक चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के आधार पर तेजी से पिछले एक दशक में विकसित किया गया है। उदाहरण के लिए, चुंबकीय कण इमेजिंग (एमपीआई) छोटे लोहे के आक्साइड नैनोकणों उपयोग करता है (10 से 20 समुद्री मील दूर करने के लिए) और वर्तमान एमआरआई तकनीक 23 से विवो में लोहे के आक्साइड नैनोकणों के साथ लेबल nanomedicines की बहुत अधिक मात्रात्मक मूल्यांकन प्रदान कर सकता है। एमपीआई के नैदानिक अनुवाद अधिक शोधकर्ताओं vivo इमेजिंग तकनीक में मजबूत उपयोग करने के कैंसर nanomedicines के vivo प्रदर्शन का मूल्यांकन करने की अनुमति होगी।

भविष्य के अनुप्रयोगों:

एक बार जब शोधकर्ताओं ने इन प्रोटोकॉल में महारत हासिल है, वे सबसे फ्लोरोसेंट और पेप्टाइड्स, प्रोटीन, एंटीबॉडी, एंटीबॉडी के टुकड़े, और आगे सहित रेडियोधर्मी दोहरे लेबल, उपन्यास सामग्री, चिह्नित करने के लिए प्रक्रियाओं को लागू कर सकते हैं। इन प्रक्रियाओंमदद कर सकते हैं वैज्ञानिकों को अच्छी तरह से उपन्यास जैव चिकित्सा सामग्री के vivo प्रदर्शन का मूल्यांकन करने के लिए और महान translational क्षमता के साथ उन लोगों की पहचान करने के लिए।

अंत में, हम एक व्यापक nanomedicine लक्षण वर्णन प्रक्रिया है कि प्रणालीगत, ऊतक, एकल कोशिका, और subcellular स्तर nanomedicine संचय जानकारी प्रदान कर सकते हैं लागू करने के लिए लक्ष्य। वर्तमान में, कैंसर nanomedicines का बहुमत अभी भी चरण में मैं क्लिनिकल परीक्षण उनकी सबऑप्टिमल फार्माकोकाइनेटिक्स, biodistributions, और विषाक्तता प्रोफाइल के कारण असफल हो। दूसरी ओर, nanomedicine के लिए चिकित्सा प्रतिक्रिया के महान विविधता रोगियों को जो विशेष रूप से इन प्रयोगात्मक nanomedicines से लाभ हो सकता है का चयन करने के लिए एक साथी इमेजिंग रणनीति प्रावधान है। हम मानते हैं कि इस प्रक्रिया के गोद लेने के लिए उचित संशोधन के साथ preclinical पशु मॉडल में उच्च क्षमता के साथ translational nanomedicines होनहार और पहचान के लिए, समुदाय की मदद कर सकता है, यह भी नैदानिक ​​मदद कर सकता हैशोधकर्ताओं nanotherapy करने के लिए उत्तरदायी रोगियों की पहचान करने के लिए।

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Materials

Name Company Catalog Number Comments
DPPC Avantilipids 850355
Cholesterol Sigma-Aldrich C8667
DSPE-PEG2000 Avantilipids 880120P
DSPE-DFO Home made 110634 Perez-Medina et al., JNM, 2014
DiIC12[5]-DS AAT Bioquest 22051
Centrifugal filter Vivaproducts VS2061
Rotary evaporator Buchi R-100
Radio-HPLC Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps N/A
89Zr-oxalate MSKCC Synthesized in house TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc.)
Micro PET-CT Siemens Inveon Micro-PET/CT
Gamma counter PerkinElmer 2470-0150
Flow cytometry BD Biosciences Fortessa Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice
C57BL/6 mice Jackson Laboratories
B16-YFP melanoma cells Home made N/A Salmon et al., Immunity, 2016
Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7 128025 Biolegend
MHCII (M5/114/152)--APC 107613 Biolegend
CD45 (30-F11)--BV510 103137 Biolegend
CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7 139313 Biolegend
CD11b (M1/70)--BV605 101237 Biolegend
CD3 (17A2)--BV711 100241 Biolegend
CD31 (13.3)--PE 561073 Biolegend
CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5 117327 BD Biosciences
CD31 (13.3) no fluorophore 550274 BD Biosciences

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References

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Tang, J., Pérez-Medina, C., Zhao, Y., Sadique, A., Mulder, W. J. M., Reiner, T. A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines. J. Vis. Exp. (121), e55271, doi:10.3791/55271 (2017).

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