Abstract
Klinikte önceki kanser nanomedicines başarısı esinlenerek, araştırmacılar son on yıl içinde yeni formülasyonların çok sayıda yarattı. tıbbi gelişim altındadır nanomedicines çoğunluğu hayal kırıklığı yaratan sonuçlar vermiştir ise Ancak nanomedicines yalnızca az sayıda, klinik kullanım için onaylanmıştır. Yeni kanser nanomedicines başarılı klinik çeviri için bir büyük engel in vivo performansını doğru anlama olmaması. Bu makalede, pozitron emisyon tomografisi-bilgisayarlı tomografi (PET-BT), radyoaktivite ölçümü yöntemleri entegrasyonu yoluyla sistemik, doku, tek hücre ve hücre içi seviyede tümör taşıyan farelerdeki nanomedicines in vivo hareketinin karakterize edilmesi sıkı bir prosedürle , flow sitometri ve floresan mikroskobu. Bu yaklaşımı kullanarak, araştırmacılar doğru önemsizdir ilgili fare modellerinde yeni nano formülasyonlan değerlendirebilirr. Bu protokoller yüksek öteleme potansiyeli en umut verici kanser nanomedicines belirlemek ya da gelecekteki çeviri için kanser nanomedicines optimizasyonuna yardımcı becerisine sahip olabilir.
Introduction
Nanotıp kanser tedavisi geliştirme 1 paradigmasını değiştiriyor. Böyle lipozom ve albümin-temelli nanotherapies 2, 3 olarak önceki kanser nanomedicines, muazzam bir klinik etkisi esinlenerek, birçok yeni formülasyonlar geçtiğimiz on yıl içinde üretildi. Ancak, bu kanser nanomedicines klinik çeviri başarı son analizler bunlardan sadece bir kaç klinik kullanım 4, 5 için onaylanmış olduğunu göstermektedir. Yeni kanser nanomedicines klinik çeviri biri büyük engel ücretsiz terapötik bileşikler 6 doğrudan yönetimi ile karşılaştırıldığında terapötik indeksi sınırlı bir gelişmedir. Klinik öncesi hayvan modellerinde sistemik dokuda nanomedicines ve hücresel seviyelerinin in vivo performans gibi, doğru bir değerlendirme olarak kimliklendirmek esastıry gelecekteki klinik çeviri için optimal terapötik endeksleri olanlar.
Nanomalzemeler tüm klinik görüntüleme yöntemleri 7 arasında mükemmel hassasiyet ve tekrarlanabilirlik vardır pozitron emisyon tomografisi (PET) görüntüleme ile yaşayan hayvanlar kantitatif karakterizasyonu için radyoaktif işaretli olabilir. Örneğin, 89 nanomedicines kanser 8, 9, 10, hem de diğer hastalık modellerinde 11 fare modellerinde karakterize edilmiştir uzun sirkülasyon Zr etiketli. Buna ek olarak, nanomedicines kan yarı ömrü ve biyolojik dağılım yoğun Bireysel dokular 8 ex vivo radyoaktivite ölçümü ile değerlendirilebilir. Bu nedenle, radyo-etiketlenmesi, sistemik ve doku düzeylerinde nanomedicines nicel değerlendirilmesi yapılır.
Önemli olarak, Radyoizotopund nanomedicines nedeniyle genellikle radyoaktif sinyalin sınırlı uzaysal çözünürlük tek hücre ya da hücre içi düzeyde analiz edilemez. Bu nedenle, floresan etiketleme gibi flow sitometri ve floresan mikroskobu 12 optik görüntüleme teknikleri ile nanopartiküllerin değerlendirilmesi için tamamlayıcı bir yöntem olduğunu kanıtlamaktadır. Bu amaçla, radyoizotoplar floresan etiketler ile etiketlenmiş nanopartiküller kantitatif nükleer görüntüleme ile in vivo değerlendirilebilir ve ex vivo radyoaktivite sayımı ile ve aynı zamanda geniş bir optik görüntüleme hücresel düzeyde karakterize edilebilir.
Daha önce, yüksek yoğunluklu lipoprotein (HDL), 11, lipozomlar 9, 10, polimerik nano partiküllerin, antikor fragmanları ve nanoemu dahil olmak üzere çeşitli nanopartiküller, radyoaktif ya da floresan etiketleri dahil modüler prosedürler geliştirdiklsions 10, 13. Bu etiketli nanopartiküller kendi özel uygulamalar için bu nanomateryallerin optimizasyonu güdümlü farklı düzeylerde ilgili hayvan modellerinde, kantitatif karakterizasyonu için izin vermiş. Bu çalışmada amaç, en köklü nanotıp platformu 14 çift etiketli nanoparçacık oluşturmak için kapsamlı prosedürleri göstermek için bir örnek gibi- ve iyice klasik singeneik melanom B16-F10 fare modelinde 15 bunu karakterize lipozomal-nanopartiküller kullanmaktır . sonuçlardan, bu nanopartikül karakterizasyonu yaklaşım ilgili fare modellerinde diğer kanser nanomedicines değerlendirmek için adapte edilebilir inanıyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Prosedür nanopartiküllerin ikili radyoaktif ve floresan etiketleme, in vivo PET-BT görüntüleme, ex vivo biyolojik dağılım ölçümleri ve ex vivo immün oluşur ve analiz akım sitometri. Tüm hayvan deneyleri Memorial Sloan Kettering Kanser Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından kabul edildi.
Çift etiketli lipozomların hazırlanması 1.
Not: singenik B16 melanoma tümörleri% 2 -isoflurane içeren oksijen teneffüs anestezi altında C57BL / 6 farelerinin arka yanları halinde 300.000 B16-F10 hücreleri enjekte edilerek uyarılabilir. Ameliyat sırasında steril bir çalışma alanında steril reaktifler ve araçları kullanın. Ameliyattan sonra, dikkatlice anesteziden kendi kurtarma kadar hayvanları gözlemlemek. onlar tam bilinç ve hareketlilik yeniden sadece geri hayvanları kafeslerinde koyun. ksenogreflenmiş tümörü olan hayvanlar için steril odalarda onlara ev. boyutta tümörler300 mm 3 bağlı nanopartikül birikimini artırmak bunların belirgin gelişmiş geçirgenlik ve tutma etkileri (EPR) 'e nanopartikül karakterizasyonu için idealdir. Ayrıntılı protokoller aşağıda verilmiştir.
- Yuvarlak tabanlı bir şişe içinde içeren kloroform, 1,2-dipalmitoyl- sn -glisero-3-phophocholine (DPPC), kolesterol, 1,2-disearoyl- sn -glycero- 2 mL lipidlerin 20 mg karışımı çözülür 3-fosfoetanolamin-poli (etilen glikol) 2000 (DSPE-PEG2000) DSPE-deferoksamin (DSPE-DFO) 8 ve 1,1-diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine-5,5-disülfonik asit ( diIC12 [5], sırasıyla% 61.3,% 33.4, 5,% 0.2 ve% 0.1, molar oranlarda) -ds.
NOT: Bu lipit kompozisyonu, şu anda klinik 2'de kullanılan doksorubisin lipozom formülasyonuna benzemektedir. Bizim prosedüründen elde edilen lipozomlar, yakın klinik nanomedic in vivo performansını taklit edecekine. - organik çözücünün çıkması ve oda sıcaklığında ince bir lipid film oluşturmak için bir döner buharlaştırıcı kullanarak. PBS ile 20 ml ilave edilir ve 30 dakika boyunca ses dalgalarına maruz buz üzerinde yeterli bir soğutma ile, bir 3.8 mm sonikasyon ucu ve 30 W arasında bir genliğe kullanarak lipozomal nano-tanecikleri oluşturmak için.
- Santrifüj agrega kaldırmak ve yıkama PBS santrifüj filtrasyon (molekül ağırlıklı bir kesim (MWCO kullanarak nano-tanecikleri, 10 dakika boyunca 4000 x g'de lipozom solüsyonu: ki olacak, lipozomlar bilgilerini lipidler ve çökelen maddelerin giderilmesi için 100 kDa) konsantre edin. üst bölmede kalır ve yeni bir tüpe aktarın. lipozomlar için sonraki basamaklardan önce 1 hafta kadar PBS içinde buzdolabında saklanır.
- Kalite kontrolü için, dinamik ışık saçılımı (DLS) lipozomlar karakterize etmektedir. Özellikle, PBS 950 uL ile lipozomlar 50 mcL karıştırın ve ardından boyutlandırma küvet içine karışımı aktarın. analizör küvet koyun ve parçacık ölçmekboyutları ve boyut dağılımı. sırasıyla, 0.2, - 120 nm ve 0.1 - parçacık boyutları ve boyut dağılımı (polidispersite indeksi (PDI)) 90 olması beklenmektedir.
- Radyoaktif, (1.5 ml bir tüp içinde, 2 saat boyunca 37 ° C 'de 1 mCi 89, Zr-oksalat ile 6.9 ve 7.1 arasında bir pH değerinde toplam hacim PBS lipidlerin 2 mg eşdeğer saflaştırılmış lipozomlar, karışımı: ~ 100 uL). 1.3 adıma benzer santrifüj filtrasyon (MWCO = 100 kDa), serbest, reaksiyona girmemiş 89 Zr çıkarın. steril PBS ile bakiyenin yıkayın ve istenilen hacme seyreltin. % 95 - radyokimyasal verim 80 olmalıdır.
DİKKAT! Radyoaktif maddeler ile çalışılırken yüksek düzenlenir. Kurumlar belgeli ve gerekli tesisleri, personel eğitimi ve radyoaktivite kullanımı sıkı izleme sağlıyor olması gerekir. Araştırmacılar yeterli eğitimi almış ve radyoaktivite işlerken kişisel koruyucu donanım ve dozimetre halkaları / rozetleri giymek gerekir. - radyo-etiketlenmesi sonra, dinamik ışık saçılımı ile nanopartiküller boyutunu belirler. Büyüklüğü ve PDI 1.4 adım 10'da ölçümleri ile aynı aralıkta olması beklenir.
Not: Radyoaktif örnekleri akış sitometresi veya floresan mikroskobu izin verilmez ise, radyoaktif olmayan Alan kulüp Zr-oksalat adım 1.5 lipozomlar etiketlemek için kullanılabilir. Bu radyoaktif olmayan lipozomlar, radyoaktif analoglanna özdeş özelliklere sahiptir. Bu prosedürün bir tasviri, Şekil 2'de sağlanmıştır.
Çift etiketli lipozomlar Vivo PET-BT Görüntüleme ve biodistribution 2.
- W bir ikili-etiketli lipozomların, yaklaşık 100 ul enjektei ölçülü melanom farelere radyoaktivitenin yaklaşık 300 uCi - yaklaşık 10 mCi 89 Zr / kg vücut ağırlığı kendi kuyruk damarlar yoluyla (C57BL / 6 kadın, 10 16 haftalık).
- yarılanma ömrü belirlemek için, 28-G insülin şırınga kullanarak% 2 izofluran içeren oksijen altında anestezi hayvanlardan kuyruk damarından kan çizin. 2 dakika, 15 dakika, 1 saat, 4 saat, 8 saat, 24 saat, ve enjeksiyondan sonra 48 saat daha önceden tartılmış tüplerde - (20 uL 10) kan toplamak. , Farkla kan tartılır, bir gama sayacı kullanılarak radyoaktivite içeriğini belirlemek ve başına enjekte edilen dozun (% ID / g) yüzdesi olarak radyoaktivite konsantrasyonunu hesaplamak.
NOT: Bir anestezi sistemi, kurtarma kafesleri, ısıtma ve biyolojik tehlike kaput ile donatılmış bir odada yordamı gerçekleştirin. hayvanlar tamamen iyileşir ve kafesleri tutan kurtarma kafeslerden aktarmadan önce işlem sonrası normal bir hareketlilik kazandırmak emin olun. Ev uygulandığı hayvanlar için belirlenmiş oda tümör taşıyan hayvanlarradyoaktif maddeler. - 24 veya 48 saat sonra, enjeksiyon Küçük hayvan MicroPET-BT tarayıcısında 10 lipozomlar, görüntü fareler. karnı yatay anestezi hayvan koyun ve anestezi tutmak. Bir burun konisi ile% 2 izofluran-oksijen verin. kurumasını önlemek için taramadan önce gözlerinin oftalmik merhem sürün.
- 15 dakika yaklaşık bir süresi olan bir tüm vücut PET statik tarama kayıt en az 50 milyon tesadüf olaylar gerçekleştirin. sırasıyla 350-700 keV ve 6 ns enerji ve tesadüf zamanlama aralığı ayarlayın. Daha sonra, 5 dk bilgisayarlı tomografi (BT) taraması gerçekleştirin. 80 kV ve 500 uA bir akımının bir voltaj X-ışını tüpü ayarlayın; CT taraması çerçeve 10 için yaklaşık 145 ms, 220 derecelik bir toplam 120 dönme adımları kullanır.
- PET-BT taramadan sonra, hemen Karbondioksit boğulma fareler kurban ve Pinchi tarafından ölümleri onaylamakHayvanların pençeleri ng. teyit sonra, servikal çıkıkları gerçekleştirin.
- Önce, sol ventrikül içine 20 ml PBS enjekte sağ atriyum, açık kesme ve fare dokuları içinde kan çıkarın ve daha sonra, tümör, karaciğer, dalak, akciğer, böbrek, kas ve diğer 16 alakalı dokuların toplar.
- , Doku tartılır 8, 9 sayma gama bunların radyoaktivite içerikleri, ölçebilir ve gramı başına enjekte edilen doz (% ID / g) bir yüzdesi olarak, doku radyoaktivite birikimini hesaplayabilir.
3. Ex Vivo Sitometrisi ve immün
Not: vücut ağırlığının her bir kg'ı başına boya, 0.5 mg bir dozda kuyruk damarı yoluyla farelere melanom flüoresan lipozomların, yaklaşık 100 ul enjekte edilir. Radyoaktif örnekleri akış sitometresi ve flöresanlı mikroskop izin verilmez ise, radyoaktif olmayan lipozomlar, kullanılmalıdır.
- Aşama 2.5 gibi, fareler 24 saat sonra enjeksiyon Kurban ve soğuk PBS depolanmalıdır tümörleri, toplar.
- Flow sitometri için aşağıdaki adımları 17 izleyin:
- % 0.5 BSA ve 1 (PBS tampon akış sitometrisi saflaştırıldı kolajenaz I ve II (4 U / ml), hiyaluronidaz (60 U / ml) ve DNase I (60 U / mL) içindeki bir karışımından oluşan bir enzim kokteyli elde mM EDTA).
- 1.5 ml bir tüp içinde, enzim kokteyli tamponu 200 uL tümör dokusu, 100 mg karıştırılır ve ince makasla küçük parçalar için doku zar. tüp içine enzim kokteyli bir 1.3 ml ilave edilir ve 6 oyuklu plaka içeriğini aktarın.
- 60 rpm'de, 60 dakika boyunca 37 ° C fırın içine yerleştirilmiştir yatay çalkalayıcı üzerinde 6 oyuklu plaka çalkalayın.
- tek bir hücre süspansiyonu elde etmek için akış sitometrisi tampon ile 3 kez doku Homojenat yıkayın.
- Belirli CD45, CD11b, LY6C, CD11c dahil biyomarkerların antikorların bir kokteyl ile hücreleri leke,CD64, CD3, MHC II ve CD31 (1: Tüm antikorlar için 200 seyreltme, klon bilgi materyalleri elektronik tablodaki sağlanır). İlgili hücre tiplerini belirlemek ve (5) analiz yazılımı sitometri uygun bir akış ile her bir hücre popülasyonunda -ds diIC12 bunların ortalama floresan yoğunluğu (MFI) belirler.
- immün için, şu adımları izleyin:
- Optimal kesme ortamı (OCT) ile dolu bir kaset içine bir tümör yerleştirin ve kuru buz üzerinde dondurma.
- Tümör dokusu 6 mikron dondurulmuş bölümleri yapmak ve histoloji cam slaytlar üzerine koyun; Bölümler doku üzerinde en iyi temsil eden bilgi tümörün en kesitlere kapsamalıdır.
- Biyobelirteçlerini Leke (örneğin, endotel hücreleri için CD31) karşılık gelen antikorların (örneğin anti-CD31, klon MEC13.3) ile ilgi. paraformaldehid ile bölümleri düzeltmek; Serum sekonder antikor türlerinin kökeni eşleşen onları engellemek; inkubasyon4 ° C'de 12 saat süre ile primer antikorlar ile yedi ve daha sonra 2 saat boyunca sekonder antikor ile; ve nihayet, PBS ile yıkayın ve kapak slipleri ile kaplayın. Görüntü Leica dik konfokal SP5 mikroskop 13, 16 ile boyanmış slaytlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 prosedürün bir özetini göstermektedir. Şekil 2, 1. adımda 10'da tarif edilen bir ikili-etiketli lipozomların şematik sentez prosedürü göstermektedir. Şekil aşama 2'de tarif edildiği gibi 3 görüntüleyen Örnek PET BT görüntüsünde (Şekil 3a), PET görüntülemesi (Şekil 3b), kan yarı-ömür (Şekil 3C) ve radyoaktif nanopartiküllerin biyolojik dağılım (Şekil 3D) gelen radyoaktivite miktarının, Şekil 3a, lipozomlar yüksek Şekil 3b'de görüntüleme sonuçlarının ölçümü ile teyit edilir tümör birikir. Ayrıca, lipozomlar, Şekil 3c'de yaklaşık 10 saatlik bir kan yarı ömrü gösterir. Ex vivo biyolojik dağılımı lipozomlar yüksek tümör birikimi teyit etmektedir. Son olarak, Şekil 4, tipik bir yolluk PR sağlarocedure nanoparçacık birikiminin tek hücre düzeyinde analiz için bir tümörde ilgili hücreleri belirlemek için (Şekil 4a ve b) tümör ile ilişkili makrofaj (TAM) nanoparçacık birikmesidir görüntüleyen. Bir temsilci konfokal mikroskopi görüntü de nanopartiküller ve endotel hücreleri (Şekil 4c) arasındaki örtüşme gösterir.
İn Vivo Nanotıp Karakterizasyonu Usul 1. şematik genel rakam. Bu prosedür, radyoaktif ve floresan etiketleri hem de nanopartiküllerin etiketleme içerir; PET-BT görüntüleme, kan yarı ömrü ölçümü ve biyolojik dağılım değerlendirmeler ile radyoaktif işaretli nanoparçacıkların karakterizasyonu; ve tek hücreli ve akış sitometrisi ve i floresan nanopartiküllerin alt-hücresel analizisırasıyla mmunostaining. Teknikleri, soldan sağa, in vivo birikimi nanopartikülünün uzaysal çözünürlüğü artan sağlamaktadır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Çift etiketli Lipozomlar Şekil 2. Sentezi Prosedürü. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Radyoaktif Nanopartiküller İn Vivo Karakterizasyonu 3. Temsilcisi Sonuçlar Şekil. Bir tumo (a) PET-BT görüntüleriçoklu dokularda Nanopartikül enjeksiyonundan ve (b) PET-türevi alım değerleri sonra fare R-taşıyan (n = 3). bir radyo-etiketli nanopartikül (c) kan radyoaktivitesi yarı ömrü ve aynı zamanda 24 saat sonra enjeksiyonda (d) biyolojik dağılım (n = 3). Hata çubukları, standart sapma değerleridir. izni ile referans 8 modifiye. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Floresan Nanopartiküller İn Vivo Karakterizasyonu 4. Temsilcisi Sonuçlar Şekil. (a) tümörle ilişkilendirilen bağışıklık hücreleri, tümör hücreleri ve endotel hücreleri (EC), hem de nanoparti (b) miktarının tespit etmek Tipik akış sitometri geçit prosedürüBu hücrelerin 8 döngü birikmesi. 3 biyolojik tekrarlar bir temsilcisi görüntü. (c) tümör 13 endotel hücrelerine bir RGD-konjuge nanoemülziyon spesifik hedefleme gösteren Örnek immünofloresan görüntüsü. izni ile, referanslar 8 ve 13 modifiye. Tümör ile ilişkili makrofaj (TAM). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokol çerçevesinde kritik Adımlar:
Çift etiketli lipozomların, yüksek kaliteli, uzun bir süre boyunca tutarlı sonuçlar üretmek için bir anahtardır. Free floresan boyalar ya da 89 Zr iyonları tamamen farklı hedefleme desen oluşturabilir tamamen saflaştırma adımı sırasında uzaklaştırılmalıdır. bağışıklık sistemi önemli ölçüde deney kanseri Nanomedicine performansını etkiler, buna ek olarak, bağışıklık sistemi fare modelleri kullanılması, bu protokol boyunca kullanılan C57BL / 6 farelerinde B16-F10 melanoma modeli olarak, tercih edilebilir. tümör mikro ya da genetik mutasyonların belirli bir kombinasyonu önemli bir faktör ise, hasta kaynaklı tümör ksenograft modelleri ideal seçimlerdir olacaktır.
Modifikasyon ve Sorun Giderme:
İşlemde nanomedicines in vivo performansını değerlendirmek için basit ve güvenilir bir şekilde sağlayan bir tümör taşıyanimals. Bu prosedür farklı uygulamalar için kanser nanomedicines karakterize etmek için belirli deneyler oluşturmak için bir omurga olarak hizmet vermektedir. Örneğin, araştırmacılar, PET-BT taramaları aynı hayvanların 17 çok sayıda zaman noktasında gerçekleştirilir nanomaterial kantitatif in vivo farmakokinetik belirleyebilir; Diğer yayınlarda gösterildiği üzere, örneğin kalın bağırsak, ince bağırsak, pankreas, beyin, deri, timus, mide, tükürük bezleri ve diğer dokuları, analiz ederek nano biyodağılımı bilgi toplayabilir 18, 19, 20, 21; ya da sitometri bu akışı uygulanmak ve protokol immün tek hücreli ve tümör dışındaki ilgili dokularda nanomedicines hücre içi özgüllüğünü değerlendirebilir.
Tekniğin Sınırlamalar:
Bu protokol requires bazı özel araştırma altyapısı dahil olmak üzere Radyoaktif, küçük hayvan görüntüleme ve immünoloji radyokimya ve görüntüleme olanakları-ve teknik uzmanlık. Bu nedenle, ideal ilgili alanlarda uzmanlığa sahip araştırmacıların multidisipliner bir ekip tarafından yürütülen olacaktır. Kendi deneyim bu prosedürün en uygun yürütme dikkatli planlama ve verimli işbirliğini gerektirdiğini göstermektedir.
Bu yazının belirli protokoller ve önerilen ajanlar iyi lipid bazlı nanopartiküller radyo etiketlenmesi için uygundur dikkati çekiyor. Bununla birlikte, bir ikili-etiketli nanopartiküller kavramı, örneğin, altın nanokristaller, polimer, ya da viral parçacıkların göre diğer nanopartikül formülasyonları karakterize etmek için kullanılabilir. Bu gibi durumlarda, farklı bir etiket stratejileri gereklidir. 89 Zr, 18 dahil olmak üzere, biyomedikal görüntülemede kullanılan radyoaktif izotopların ve çeşitli vurgulamak önemlidir 64 Cu, 68 Ga ve ismin 7 sadece birkaç 123 I. radyoizotopun seçimi daha sonraki zaman noktalarında, tam karakterizasyon için izin vermek için, araştırma altındaki nanomaterial spesifik özelliklerine göre başta kendi kan dolaşım yarı-ömrünü yapılmalıdır. Ancak, bu tür etiketleme kimya veya izotop durumu gibi diğer faktörler, nihai seçim etkileyebilir. Bu çalışma için, 89 Zr uzun fiziksel yarı ömrü (t 1/2 = 78.4 lH), lipozomlar, kan yarılanma ömrü olan benzerliği nedeniyle seçilmiştir. Dikkat çekici bir şekilde, bu protokol, aynı zamanda ticari olarak temin edilebilir ve tek foton emisyonlu bilgisayarlı tomografi (SPECT) ile görüntüleme için uygun olduğu, 99mTc, 111, veya 125 I gibi diğer izotoplar ile gerçekleştirilebilir. Benzer şekilde, DilC yüksek hidrofobisite ve lipozomlar bu nedenle yüksek yükleme verimlilik nedeniyle seçilmiştir. istenmeyen fiziksel özelliklerine çok olan diğer floresan boyalarES doğrudan fosfolipidler 17 konjuge edilebilir.
Teknikleri Önemi:
Bu prosedür klinik çalışmalarda nanomedicines değerlendirmek için uyarlanmış yüksek öteleme potansiyeli sunuyor. 4 kilit teknikleri-yani, PET-BT görüntüleme, radyoaktivite ölçümü, akım sitometri ve immunohistokimyasal-olan rutin hastalarda onkolojik tanı için kullandı. Bu nedenle, bu klinik öncesi işlem kolaylıkla klinik faz nanomedicines in vivo performansını değerlendirmek için tercüme edilebilir. Ayrıca, farelere kıyasla insan organlarının büyük boyutlu nanotıp birikiminin invaziv biyopsi tabanlı radyoaktivite ölçümü yerine PET-BT görüntüleme 22, daha doğru analiz sağlar. Bu ortamda, invazif olmayan, görüntüleme destekli protokoller hastaları derecelendirmek için ve hasta sonuçlarını 10 homojenize yardımcı olmak için geliştirilmiştir edilebilir. DeveRadyoaktif nanomalzemeleri loping hala önemli bir altyapı yatırımı gerektirir. Alternatif olarak, manyetik rezonans görüntüleme (MRG) dayalı olmayan radyoaktif görüntüleme teknikleri hızla son on yılda gelişen edilmiştir. Örneğin, manyetik parçacık görüntüleme (MPI), küçük demir oksit nano-tanecikleri kullanır (10 nm ile 20 nm) ve mevcut MR teknikleri 23 daha etkin in vivo demir oksit nanopartiküllerinin ile etiketlenmiş nanomedicines çok daha nicel bir değerlendirme sağlayabilir. MPI klinik çeviri fazla araştırmacılar kanser nanomedicines in vivo performansını değerlendirmek için in vivo görüntüleme teknikleri sağlam kullanmak için izin verecek.
Gelecek Uygulamalar:
Araştırmacılar bu protokolleri ana sonra, benzeri peptitler, proteinler, antikorlar, antikor parçaları ve de dahil olmak üzere floresan ve radyoaktif bir ikili-etiketli, yeni malzemeler, karakterize etmek için işlemleri uygulanabilir. Bu prosedürlerBilim adamları iyice roman biyomedikal malzemelerin in vivo performansını değerlendirmek için yardımcı olabilir ve büyük öteleme potansiyele sahip olanlar tespit etmek bakabilirsiniz.
Sonuç olarak, sistemik doku, tek hücreli ve hücre içi seviye nanotıp birikimi bilgi verebilir kapsamlı bir nanotıp karakterizasyon işlemi tanıtmak amaçlanmaktadır. Şu anda, kanser nanomedicines çoğunluğu hala nedeniyle optimal farmakokinetik, Biyodağılım ve toksisite profillerine Faz I klinik çalışmalara başarısız. Öte yandan, nanotıpta terapi cevabının büyük bir heterojenlik özellikle bu deneysel nanomedicines yarar görecek hastaları seçmek için bir arkadaşı görüntüleme stratejisi zorunlu kılmaktadır. Biz de klinik yardımcı olabilir, bu yöntemin kabulü uygun değişiklik ile, klinik öncesi hayvan modellerinde yüksek translasyonel potansiyeline sahip vaat nanomedicines belirlemek ve topluma yardımcı olabilir inanıyoruzAraştırmacılar nanotherapy yatkın hastaları belirlemek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DPPC | Avantilipids | 850355 | |
| Cholesterol | Sigma-Aldrich | C8667 | |
| DSPE-PEG2000 | Avantilipids | 880120P | |
| DSPE-DFO | Home made | 110634 | Perez-Medina et al., JNM, 2014 |
| DiIC12[5]-DS | AAT Bioquest | 22051 | |
| Centrifugal filter | Vivaproducts | VS2061 | |
| Rotary evaporator | Buchi | R-100 | |
| Radio-HPLC | Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps | N/A | |
| 89Zr-oxalate | MSKCC | Synthesized in house | TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc.) |
| Micro PET-CT | Siemens | Inveon Micro-PET/CT | |
| Gamma counter | PerkinElmer | 2470-0150 | |
| Flow cytometry | BD Biosciences | Fortessa | Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratories | ||
| B16-YFP melanoma cells | Home made | N/A | Salmon et al., Immunity, 2016 |
| Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7 | 128025 | Biolegend | |
| MHCII (M5/114/152)--APC | 107613 | Biolegend | |
| CD45 (30-F11)--BV510 | 103137 | Biolegend | |
| CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7 | 139313 | Biolegend | |
| CD11b (M1/70)--BV605 | 101237 | Biolegend | |
| CD3 (17A2)--BV711 | 100241 | Biolegend | |
| CD31 (13.3)--PE | 561073 | Biolegend | |
| CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5 | 117327 | BD Biosciences | |
| CD31 (13.3) no fluorophore | 550274 | BD Biosciences |
References
- Peer, D., et al. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).
- Barenholz, Y. Doxil(R)--the first FDA-approved nano-drug: lessons learned. J Control Release. 160, 117-134 (2012).
- Green, M. R., et al. Abraxane, a novel Cremophor-free, albumin-bound particle form of paclitaxel for the treatment of advanced non-small-cell lung cancer. Ann Oncol. 17, 1263-1268 (2006).
- Juliano, R.
- Ledford, H. Bankruptcy filing worries developers of nanoparticle cancer drugs. Nature. 533, 304-305 (2016).
- Venditto, V. J., Szoka, F. C. Jr Cancer nanomedicines: so many papers and so few drugs! Adv Drug Deliv Rev. 65, 80-88 (2013).
- Dunphy, M. P., Lewis, J. S. Radiopharmaceuticals in preclinical and clinical development for monitoring of therapy with PET. J Nucl Med. (50 Suppl 1), (2009).
- Perez-Medina, C., et al. PET Imaging of Tumor-Associated Macrophages with 89Zr-Labeled High-Density Lipoprotein Nanoparticles. J Nucl Med. 56, 1272-1277 (2015).
- Perez-Medina, C., et al. A modular labeling strategy for in vivo PET and near-infrared fluorescence imaging of nanoparticle tumor targeting. J Nucl Med. 55, 1706-1711 (2014).
- Perez-Medina, C., et al. Nanoreporter PET predicts the efficacy of anti-cancer therapy. Nature communications. , (2016).
- Tang, J., et al. Inhibiting macrophage proliferation suppresses atherosclerotic plaque inflammation. Science advances. , (2015).
- Priem, B., Tian, C., Tang, J., Zhao, Y., Mulder, W. J. Fluorescent nanoparticles for the accurate detection of drug delivery. Expert Opin Drug Deliv. 12, 1881-1894 (2015).
- Gianella, A., et al. Multifunctional nanoemulsion platform for imaging guided therapy evaluated in experimental cancer. ACS Nano. 5, 4422-4433 (2011).
- Torchilin, V. P. Recent advances with liposomes as pharmaceutical carriers. Nat Rev Drug Discov. 4, 145-160 (2005).
- Salmon, H., et al. Expansion and Activation of CD103(+) Dendritic Cell Progenitors at the Tumor Site Enhances Tumor Responses to Therapeutic PD-L1 and BRAF Inhibition. Immunity. 44, 924-938 (2016).
- Perez-Medina, C., et al. In Vivo PET Imaging of HDL in Multiple Atherosclerosis Models. JACC Cardiovasc Imaging. 9, 950-961 (2016).
- Duivenvoorden, R., et al. A statin-loaded reconstituted high-density lipoprotein nanoparticle inhibits atherosclerotic plaque inflammation. Nature communications. 5, 3065 (2014).
- Carney, B., et al. Non-invasive PET Imaging of PARP1 Expression in Glioblastoma Models. Mol Imaging Biol. , (2015).
- Salinas, B., et al. Radioiodinated PARP1 tracers for glioblastoma imaging. EJNMMI Res. 5, 123 (2015).
- Carlucci, G., et al. Dual-Modality Optical/PET Imaging of PARP1 in Glioblastoma. Mol Imaging Biol. 17, 848-855 (2015).
- Tang, J., et al. Immune cell screening of a nanoparticle library improves atherosclerosis therapy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , (2016).
- Scott, A. M., Wolchok, J. D., Old, L. J.
- Goodwill, P., et al. X-space MPI: magnetic nanoparticles for safe medical imaging. Adv Mater. 24, 3870-3877 (2012).
