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Bioengineering

एक β-lactamase-आधारित Conductimetric के उपयोग के लिए गैर-आणविक बातचीत का पता लगाने के लिए परख

Published: February 1, 2018 doi: 10.3791/55414
Automatic Translation
*1, *1, 2, 1, 1, 1, 1, 3, 1, 4
1Life Science Department, University of Liège, 2Institute of Condensed Matter and Nanoscience, Catholic University of Louvain, 3Laboratory of Clinical Microbiology, Catholic University of Louvain, 4Biotechnology Department, CER Group
* These authors contributed equally

Summary

इस काम में, हम हाइब्रिड β-lactamase तकनीक के आधार पर एक conductimetric का उपयोग करके प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन का अध्ययन करने के लिए एक नई विधि की रिपोर्ट करते हैं. इस विधि β-lactams के hydrolysis पर प्रोटॉन की रिहाई पर निर्भर करता है ।

Abstract

ऐसे रोगजनकों का पता लगाने, आणविक निदान, पर्यावरणीय निगरानी और खाद्य सुरक्षा नियंत्रण के रूप में विभिन्न क्षेत्रों में तेजी से महत्वपूर्ण और कार्यान्वित किया जा रहा है । इस संदर्भ में, हम कई प्रोटीन प्रोटीन इंटरेक्शन अध्ययन में कुशल रिपोर्टर एंजाइम के रूप में β-लैक्टमेज़ इस्तेमाल किया । इसके अलावा, उनके पेप्टाइड्स या संरचित प्रोटीन की संमिलन को स्वीकार करने की क्षमता/डोमेन दृढ़ता से इन एंजाइमों के उपयोग के लिए प्रोत्साहित chimeric प्रोटीन पैदा करते हैं । हाल ही के एक अध्ययन में, हम एक एकल-डोमेन एंटीबॉडी अंश को बैसिलस licheniformis BlaP β-lactamase में संमिलित किया । इन छोटे डोमेन, nanobodies भी कहा जाता है, camelids से एकल श्रृंखला एंटीबॉडी के प्रतिजन बंधन डोमेन के रूप में परिभाषित कर रहे हैं । आम डबल चेन एंटीबॉडी की तरह, वे अपने लक्ष्य के लिए उच्च समानताएं और विशिष्टताओं को दिखाते हैं । परिणामस्वरूप chimeric प्रोटीन अपने लक्ष्य के खिलाफ एक उच्च समानता का प्रदर्शन करते हुए β-lactamase गतिविधि को बनाए रखने । यह सुझाव है कि nanobody और β-lactamase moieties कार्यात्मक रहते हैं । वर्तमान काम में, हम एक विस्तृत प्रोटोकॉल है कि हमारे संकर β-lactamase प्रणाली को जोड़ने के लिए की रिपोर्ट है । अपने लक्ष्य के लिए nanobody के विशिष्ट बंधन एंजाइम की उत्प्रेरक गतिविधि द्वारा जारी प्रोटॉन के एक conductimetric माप के लिए धन्यवाद का पता लगाया जा सकता है ।

Introduction

जैव संवेदी विश्लेषण उपकरण है कि भौतिक या रासायनिक संकेतन उपकरणों के साथ एक जैविक आणविक बातचीत गठबंधन कर रहे है ट्रांसड्यूसर1के रूप में भेजा. दर्ज संकेतों को फिर समझा जा सकता है और मैटीरियल और मुक्त भागीदारों के बीच बातचीत की निगरानी में परिवर्तित कर सकते हैं । इस तरह के हार्मोन या अलग रोगज़नक़ मार्करों2के रूप में analytes का पता लगाने के लिए एक एंटीबॉडी का उपयोग शामिल है । विभिंन सेंसर स्वरूपों का इस्तेमाल किया जा सकता है और शामिल जन आधारित, चुंबकीय, ऑप्टिकल या विद्युत बायोमास । बाद के सबसे अधिक इस्तेमाल किया सेंसर के बीच में हैं, और एक बिजली के संकेत में एक बाध्यकारी घटना परिवर्तित करके कार्य करते हैं । प्रदर्शन और सभी एंटीबॉडी आधारित संवेदनशीलता का दृढ़ता से अनिवार्य रूप से दो मापदंडों पर निर्भर कर रहे हैं: i) एंटीबॉडी और द्वितीय की गुणवत्ता) प्रणाली के गुण के लिए संकेत उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया2।

एंटीबॉडी उच्च आणविक जन dimeric प्रोटीन (150-160 केडीए) है कि दो भारी चेन और दो प्रकाश श्रृंखला से बना रहे हैं । प्रकाश और भारी श्रृंखला के बीच बातचीत ज्यादातर hydrophobic बातचीत के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक संरक्षित डाइसल्फ़ाइड बांड द्वारा स्थिर है । प्रत्येक श्रृंखला एक चर डोमेन है कि प्रतिजन के साथ इंटरैक्ट करता है अनिवार्य रूप से तीन hypervariable पूरक निर्धारित क्षेत्रों (CDR1-2-3) नामित क्षेत्रों के माध्यम से शामिल है । क्षेत्र में कई अग्रिमों के बावजूद, कम लागत वाली अभिव्यक्ति प्रणालियों (जैसे, ई. कोलाई) के साथ पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी के बड़े पैमाने पर अभिव्यक्ति अक्सर अस्थिर और एकत्रित प्रोटीन के उत्पादन की ओर जाता है । यही कारण है कि विभिंन एंटीबॉडी टुकड़े इंजीनियर किया गया है जैसे एकल श्रृंखला चर टुकड़े3 (ScFvs ≈ 25 केडीए) । वे क्रमशः एक भारी और एक प्रकाश श्रृंखला है कि एक सिंथेटिक एमिनो एसिड अनुक्रम से जुड़े covalently है के चर डोमेन से मिलकर बनता है । हालांकि, इन टुकड़ों अक्सर एक गरीब स्थिरता प्रदर्शित करने और कुल करने की प्रवृत्ति है, क्योंकि वे अपने hydrophobic क्षेत्रों का एक बड़ा हिस्सा विलायक4को बेनकाब । इस संदर्भ में, एकल श्रृंखला camelid एंटीबॉडी टुकड़े, nanobodies या VHHs के रूप में संदर्भित, ScFvs के लिए उत्कृष्ट विकल्प प्रतीत होते हैं । इन डोमेन camelid एकल श्रृंखला एंटीबॉडी के चर डोमेन के अनुरूप हैं । पारंपरिक एंटीबॉडी के विपरीत, camelid एंटीबॉडी प्रकाश श्रृंखला से रहित हैं और केवल दो भारी चेन5होते हैं. इसलिए, nanobodies छोटे monomeric एंटीबॉडी टुकड़े (12 केडीए) एक प्रतिजन के लिए एक पारंपरिक एंटीबॉडी6के समान समानता के साथ बाइंड करने में सक्षम हैं । इसके अलावा, वे अंय पूर्ण लंबाई एंटीबॉडी या एंटीबॉडी टुकड़े की तुलना में सुधार स्थिरता और घुलनशीलता उपस्थित । अंत में, उनके छोटे आकार और उनके विस्तारित CDR3 छोरों उन्हें गुप्त epitopes पहचान करने के लिए और एंजाइम सक्रिय साइटों7करने के लिए बाइंड करने के लिए अनुमति देते हैं,8. आजकल, इन डोमेन काफी ध्यान प्राप्त कर रहे है और कर रहे है संयुक्त करने के लिए किया गया है । उदाहरण के लिए, हुआंग एट अल। ने मानव प्रोस्टेट-विशिष्ट प्रतिजन (पीएसए)9का पता लगाने और ठहराव के लिए एक nanobody आधारित सी-सेंसर विकसित किया है ।

के रूप में उपर्युक्त, एक महत्वपूर्ण पैरामीटर में सेंसर परख है बिजली के संकेत उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया प्रणाली की क्षमता है । इस कारण से, एंजाइम आधारित विद्युत के लिए कभी आकर्षित किया है-बढ़ती ध्यान और विभिंन अनुप्रयोगों के लिए व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया है जैसे स्वास्थ्य देखभाल, खाद्य सुरक्षा, और पर्यावरण की निगरानी । ये एक एंजाइम द्वारा एक सब्सट्रेट के उत्प्रेरक hydrolysis पर निर्भर बिजली के संकेत उत्पंन करने के लिए । इस संदर्भ में, β-लैक्टमेज़ अधिक विशिष्ट, अधिक संवेदनशील और क्षारीय फॉस्फेट या सहिजन peroxidase10जैसे कई अन्य एंजाइमों की तुलना में प्रयोग को लागू करने के लिए आसान होने के लिए दिखाया गया था । β-लैक्टमेज़ वे hydrolyzing द्वारा β-लस्टम एंटीबायोटिक दवाओं के जीवाणु प्रतिरोध के लिए जिंमेदार हैं कि एंजाइमों रहे हैं । वे monomeric, बहुत स्थिर, कुशल, और छोटे आकार के होते हैं । इसके अलावा, डोमेन/β-लैक्टमेज़ उत्पन्न द्वि-कार्यात्मक chimeric प्रोटीन है कि प्रोटीन-ligand बातचीत का अध्ययन करने के लिए कुशल उपकरण होने के लिए दिखाया गया है । वास्तव में, हाल के अध्ययनों से पता चला है कि प्रविष्टि एंटीबॉडी चर टुकड़ों में TEM1 β-lactamase परिणाम में एक chimeric प्रोटीन है कि अपने लक्ष्य प्रतिजन के लिए उच्च समानता के साथ बाइंड करने में सक्षम रहता है । दिलचस्प है, प्रतिजन बाध्यकारी TEM1 उत्प्रेरक गतिविधि11,12के allosteric विनियमन प्रेरित करने के लिए दिखाया गया था । इसके अलावा, हम कई अध्ययनों में पता चला है कि प्रोटीन डोमेन प्रविष्टि के एक स्वतंत्र पाश में बैसिलस licheniformis BlaP β-lactamase कार्यात्मक chimeric प्रोटीन है कि अच्छी तरह से प्रोटीन की निगरानी के लिए अनुकूल है-ligand बातचीत उत्पन्न करता है13 ,14. हम हाल ही में एक nanobody डाला, टैक्सी-Lys3 नाम, BlaP15के इस स्वतंत्र प्रविष्टि साइट में. इस nanobody को मुर्गी-अंडा-सफेद lysozyme (HEWL) से बाँध कर दिखाया गया और इसकी एंजाइमी गतिविधि को बाधित करने के लिए१६. हमने दिखाया है कि उत्पन्न संकर प्रोटीन, नाम BlaP-कैब-Lys3, HEWL के खिलाफ एक उच्च विशिष्टता/जब β-lactamase गतिविधि अपरिवर्तित बनी रहती है । तब हम सफलतापूर्वक एक विद्युत के लिए हाइब्रिड β-lactamase प्रौद्योगिकी संयुक्त सेंसर और पता चला कि उत्पन्न बिजली के संकेत की मात्रा BlaP-कैब के बीच बातचीत के निर्भर था-Lys3 और HEWL एक इलेक्ट्रोड पर मैटीरियल. दरअसल, BlaP द्वारा β-लस्टम एंटीबायोटिक दवाओं के hydrolysis एक प्रोटॉन रिलीज है कि एक मात्रात्मक बिजली के संकेत में परिवर्तित किया जा सकता है लाती है । एक विद्युत के साथ संकर β-lactamase प्रौद्योगिकी का यह संयोजन तेज, संवेदनशील, मात्रात्मक है, और उत्पन्न संकेत की वास्तविक समय माप की अनुमति देता है. यह कार्यप्रणाली यहां बताई गई है ।

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Protocol

1. प्रोटीन सैंपल की तैयारी

  1. उत्पादन और संकर प्रोटीन BlaP-cAb-Lys3 के रूप में हमारे पिछले अध्ययन में बताया15शुद्ध । निंनलिखित संरचना के साथ ५० mM फॉस्फेट बफर पीएच ७.४ में प्रोटीन की दुकान: NaCl के 8 ग्राम, KCl के ०.२ ग्राम, एनए के १.४४ जी के2HPO4 और KH के ०.२४ ग्राम2पीओ4 आसुत जल के ८०० मिलीलीटर में भंग ठीक से पहले ७.४ के लिए समाधान का पीएच समाधान के अंतिम खंड को समायोजित करने के लिए 1 L. फ़िल्टर प्रोटीन समाधान निष्फल ।
  2. एक मुर्गी अंडे व्हाइट lysozyme (HEWL) स्टॉक समाधान तैयार करें । १०० मिलीग्राम (४०,००० इकाइयों/व्यावसायिक रूप से फॉस्फेट बफर खारा के 10 मिलीलीटर में खरीदे HEWL के mg) (पंजाब के कदम 2.1.1 देखें) । एक ०.२२ माइक्रोन कटऑफ के साथ फिल्टर का उपयोग निस्पंदन द्वारा प्रोटीन समाधान निष्फल ।

2.-संवेदी परख

  1. समाधान और बफर तैयारी
    1. NaCl के 8 ग्राम, KCl के ०.२ ग्राम, एनए2HPO4, और ०.२४ ग्राम के KH2पीओ4 की ८०० मिलीलीटर में आसुत जल को भंग करके ५० mM पंजाबियों को तैयार करें । 1 एल के लिए समाधान की मात्रा को समायोजित करने से पहले 1 एन एचसीएल या 1 n NaOH के साथ पीएच ७.४ को समायोजित करें L. फ़िल्टर बंध्याकरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    2. ऊपर वर्णित के रूप में तैयार पंजाब के १०० मिलीलीटर में कैसिइन hydrolysate के 3 जी भंग करके एक संतृप्ति/अवरुद्ध समाधान तैयार करें । फ़िल्टर निष्फल और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    3. ऊपर वर्णित के रूप में तैयार पंजाबियों की १०० मिलीलीटर में कैसिइन hydrolysate के 1 जी भंग करके एक बाध्यकारी समाधान तैयार (देखें 2.1.1 कदम) । फ़िल्टर निष्फल और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    4. एक धुलाई समाधान तैयार (०.१% के बीच-पंजाबियों) के बीच 20 के १०० μL जोड़कर (१००%) पंजाब के १०० मिलीलीटर में ऊपर वर्णित के रूप में तैयार (2.1.1 कदम देखें) । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    5. एक इलेक्ट्रोड तैयारी समाधान तैयार करें (1% ट्राइटन x-१००-पंजाब) ट्राइटन x-१०० (१००%) पंजाब की १०० मिलीलीटर में 1 मिलीलीटर जोड़कर तैयार के रूप में ऊपर वर्णित (2.1.1 कदम देखें) । 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
    6. एक इलेक्ट्रोड पुनर्जनन समाधान तैयार (३.५ मीटर KCl) आसुत जल में KCl के 26 ग्राम एक अंतिम मात्रा १०० मिलीलीटर को भंग करके । फ़िल्टर निष्फल और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान ।
    7. आसुत जल में NaCl के ०.२९ g भंग करके एक 5 मिमी NaCl समाधान तैयार 1 एल फिल्टर बंध्याकरण और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर के एक अंतिम मात्रा के लिए । फिर, एक डिटेक्शन समाधान तैयार (4 mm benzylpenicillin) भंग करके २६.७ मिलीग्राम benzylpenicillin के 20 मिलीलीटर में 5 मिमी NaCl समाधान. फ़िल्टर बंध्याकरण और स्टोर-20 ° c ।
  2. संवेदक तैयारी और उत्थान
    नोट: polyaniline लेपित संवेदक चिप्स विकसित किया गया है और कृपया डॉ पी Bogaerts, डॉ एस यूनुस और प्रो वाई Glupczynski (Louvain के कैथोलिक विश्वविद्यालय-ला-Neuve-चू मोंट-Godinne) द्वारा प्रदान की । सेंसर के रूप में के रूप में अच्छी तरह से polyaniline इलेक्ट्रो-बहुलकीकरण इन सेंसरों को संश्लेषित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रोटोकॉल का विवरण उनके पिछले काम17में विस्तृत रहे हैं. संक्षेप में, यह प्रणाली आठ व्यक्तिगत चिप्स है कि शास्त्रीय मुद्रित सर्किट बोर्ड (पीसीबी) तकनीक द्वारा निर्मित किए गए पुनः प्रयोग करने योग्य सेंसर का उपयोग करता है । व्यक्तिगत चिप्स तीन इलेक्ट्रोड गोल धब्बे से बना रहे हैं. ऊपर एक काम इलेक्ट्रोड है जिस पर polyaniline इलेक्ट्रो-संश्लेषित किया गया है. मध्य एक संदर्भ इलेक्ट्रोड है और नीचे इलेक्ट्रोड काउंटर इलेक्ट्रोड का गठन. दोनों, संदर्भ और काउंटर इलेक्ट्रोड कार्बन परत के शीर्ष पर ठोस एजी/AgCl मिश्रण का उपयोग कर कार्यात्मक रहे हैं ।
    1. एक ९६ के कुओं में युक्तियां सूई द्वारा इलेक्ट्रोड के 3 बहाकर प्रदर्शन-अच्छी तरह से ३०० µ एल युक्त प्लेट/इलेक्ट्रोड तैयारी समाधान की (1% ट्राइटन X-१००-पंजाब, चरण 2.1.5 देखें.) । कमरे के तापमान पर कोमल मिश्रण के साथ 2 मिनट के लिए प्रत्येक धोने प्रदर्शन ।
    2. कमरे के तापमान पर कोमल मिश्रण के साथ 2 मिनट के लिए आसुत जल के ३०० µ एल/अच्छी तरह से युक्त प्लेट के कुओं में युक्तियां सूई से इलेक्ट्रोड कुल्ला ।
    3. एक ९६ के कुओं में युक्तियां डूबा द्वारा इलेक्ट्रोड पुनर्जीवित-अच्छी तरह से ३०० µ एल के साथ थाली/पुनर्जनन समाधान के (३.५ एम KCl, कदम 2.1.6 देख) 4 ° c या कमरे के तापमान पर 1 घंटे में रात ।
    4. एक ९६ के कुओं में युक्तियां सूई द्वारा इलेक्ट्रोड के 3 बहाकर प्रदर्शन-अच्छी तरह से ३०० µ एल युक्त प्लेट/फास्फेट बफर खारा के अच्छी तरह से (2.1.1 कदम देखें.) । कमरे के तापमान पर कोमल मिश्रण के साथ 2 मिनट के लिए प्रत्येक धोने प्रदर्शन ।
  3. बाध्यकारी परख संवेदक पर किया प्रदर्शन
    1. कोट इलेक्ट्रोड सतह पर पंजाब में तैयार ४० µ जी/एमएल HEWL के 15 µ एल ड्रॉप जमा करके इलेक्ट्रोड के पाणि (polyaniline) सतह पर HEWL । कमरे के तापमान पर 4 डिग्री सेल्सियस या 1 घंटे में रात भर गर्मी ।
    2. फॉस्फेट बफर खारा के साथ इलेक्ट्रोड के तीन बहाकर प्रदर्शन (2.1.1 कदम देखें) एक ९६ के कुओं में संवेदक चिप्स के इलेक्ट्रोड भागों सूई से अच्छी तरह से थाली ३०० µ एल युक्त/फास्फेट बफर खारा की अच्छी तरह से. कमरे के तापमान पर कोमल मिश्रण के साथ 2 मिनट के लिए प्रत्येक धोने प्रदर्शन ।
    3. इलेक्ट्रोड की सतह पर एक ५० µ एल ड्रॉप अवरुद्ध समाधान (चरण 2.1.2 देखें) को जोड़ने के द्वारा संतृप्त । कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन । उसके बाद पिछले चरण में वर्णित के रूप में तीन बार धो (चरण 2.3.2 देखें) ।
    4. BlaP-cAb-Lys3 समाधान बाइंडिंग समाधान में 20 µ g/mL को पतला करें (चरण 2.1.3 देखें) और इलेक्ट्रोड पर इस पतला समाधान की एक 15 µ l ड्रॉप लागू करें । कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए मशीन । प्रतिजन-nanobody प्रतिक्रिया के बाद, धोने समाधान का उपयोग कर पिछले चरण में वर्णित के रूप में तीन बार धो (चरण 2.1.4 देखें). फिर इलेक्ट्रोड एक बार पंजाबियों के साथ कुल्ला (2.1.1 चरण देखें) ।
    5. पता लगाने के लिए, एक डिजिटल मीटर के लिए तांबे सर्किट भाग के माध्यम से सेंसर चिप प्लग । फिर, जांच समाधान की एक ५० µ एल ड्रॉप लागू करने के द्वारा सेंसर प्रतिक्रिया आरंभ (चरण 2.1.7 देखें) सकारात्मक इलेक्ट्रोड पर और NaCl 5 मिमी समाधान की एक ५० µ एल ड्रॉप लागू करने पर नकारात्मक इलेक्ट्रोड (चरण 2.1.7 देखें). कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए मशीन । एक डिजिटल मीटर के साथ संचालन की निगरानी ।
      नोट:-मीटर डॉ पी Bogaerts, डॉ एस यूनुस और प्रो वाई Glupczynski के (कैथोलिक Louvain-ला-Neuve-चू मोंट-Godinne के विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान की गई थी । इस potentiostat एक यूएसबी पोर्ट के माध्यम से कंप्यूटर नियंत्रित है और एक साथ सेंसर के आठ अलग चिप्स का विश्लेषण करती है. यूनुस और सहकर्मियों द्वारा बनाए गए सॉफ्टवेयर17 एक वास्तविक समय साजिश है कि संदर्भ और समय के खिलाफ नमूना इलेक्ट्रोड के बीच कंडक्टर अंतर की माप का प्रतिनिधित्व करता है बनाता है ।

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Representative Results

डिजाइन और इंजीनियरिंग के chimeric प्रोटीन BlaP-कैब-Lys3

चित्रा 1 BalP वर्ग के एक स्वतंत्र लूप में cAb-Lys3 के सम्मिलन का प्रतिनिधित्व करता है a β-lactamase से बैसिलस licheniformis. संमिलन Asp198 और Lys199 अवशेषों के बीच प्रदर्शन किया गया था । कैब-Lys3 के हर तरफ एक thrombin क्लीवेज साइट पेश की गई । BlaP-cAb-Lys3 chimeric प्रोटीन एंकोडिंग प्लाज्मिड एक गठित अभिव्यक्ति के साथ बदल कोशिकाओं एम्पीसिलीन की एक छोटी सी एकाग्रता की उपस्थिति में विकसित करने में सक्षम थे । यह परिणाम इंगित करता है कि हाइब्रिड β-lactamase में घुलनशील है, सही रूप से जोड़ और सफलतापूर्वक जीवाणुओं के periplasmic अंतरिक्ष में जहां यह एम्पीसिलीन के खिलाफ प्रतिरोधक क्षमता प्रदान कर सकते हैं उत्सर्जित किया जा सकता है । हम आगे हमारे chimeric प्रोटीन के bifunctionality का विश्लेषण किया । जैसा कि हमारे पिछले अध्ययनों में बताया गया है, हमारे डेटा से पता चला है कि β-lactamase के रूप में के रूप में अच्छी तरह से chimeric प्रोटीन के कैब-Lys3 moieties उनकी जैविक गतिविधियों को बनाए रखा15.

Conductimetric की परख

सेंसर चिप्स इस परख के लिए इस्तेमाल चित्रा 2 में दिखाया गया है । इन प्रयोगों के लिए प्रयुक्त सेंसरों में ८ चिप्स होते हैं. प्रत्येक चिप तीन इलेक्ट्रोड शामिल हैं: एक काम इलेक्ट्रोड, एक काउंटर-इलेक्ट्रोड, और एक संदर्भ इलेक्ट्रोड. इन 8 चिप्स को सेंसर में 4 पेयर के रूप में व्यवस्थित किया जाता है । प्रत्येक जोड़ी के लिए, लेबल चिप्स में से एक "-" एक नकारात्मक नियंत्रण से मेल खाती है, जबकि लेबल चिप "+" परीक्षण नमूना से मेल खाती है ।

चित्रा 3 एक potentiometric के लिए संकर β-lactamase प्रौद्योगिकी को जोड़ती है कि इस काम में इस्तेमाल प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध विवरण का प्रतिनिधित्व करता है. इस सेटअप में, दो इलेक्ट्रोड का उपयोग किया जाता है: i) एक संदर्भ इलेक्ट्रोड और ii) एक polyaniline (PANI) लेपित इलेक्ट्रोड. HEWL के रूप में अंय अध्ययनों18,19में बताया पाणि लेपित इलेक्ट्रोड पर adsorbed है । पर्याप्त धोने के बाद, BlaP-cAb-Lys3 (के लिए "+" लेबल चिप्स) या BlaP बिना डाला nanobody (के लिए "-" लेबल चिप्स) इलेक्ट्रोड पर लागू कर रहे हैं. इलेक्ट्रोड पर β-लस्टम (benzylpenicillin) के अलावा निम्नलिखित इलेक्ट्रोड कंडक्टर में परिवर्तन मापा जाता है. दरअसल, β-लस्टम hydrolysis द्वारा β-लैक्टमेज़ प्रोटॉन की एक रिलीज उत्पन्न करता है; जो एक बहुत ही कम प्रतिक्रिया समय के साथ इलेक्ट्रोड कंडक्टर में महत्वपूर्ण परिवर्तन बनाने के लिए दिखाया गया था. यह आंकड़ा 4 में प्रस्तुत किया गया है कि BlaP-कैब की बाइंडिंग-lys3 को HEWL मैटीरियल को पाणि इलेक्ट्रोड पर दर्शाने वाले सेंसर की परख का पता लगाया जा सकता है और इस मैटीरियल β-lactamase गतिविधि से उत्पन्न प्रोटॉन रिलीज को मापने के द्वारा निगरानी की जा सकती है । इसके विपरीत, जब प्रयोग BlaP के साथ किसी भी डाला nanobody के बिना किया गया था कोई कंडक्टर अंतर का पता चला ।

Figure 1
चित्रा 1: chimeric प्रोटीन BlaP-कैब-Lys3 HEWL के साथ बातचीत का प्रतिनिधित्व योजना. BlaP में दिखाया गया है कि सियान, कैब-Lys3 में नारंगी और HEWL में नीला रंग है. यह आंकड़ा BlaP (PDB id: 4BLM) और cAb-Lys3/HEWL परिसर (PDB id: 1MEL) के tridimensional संरचनाओं के संयोजन से प्राप्त किया गया था । β-lactamase 2 डोमेन शामिल हैं: α/β डोमेन और α डोमेन, उत्प्रेरक साइट इंटरफ़ेस पर दोनों डोमेन के बीच स्थित है । संमिलन के लिए इस्तेमाल पाश पीले रंग में प्रकाश डाला और α डोमेन में एक विलायक उजागर पाश में स्थित है । टैक्सी-Lys3 के एन-एण्ड सी-टर्मिनल पार्ट्स लाल रंग में दर्शाए गए हैं । कैब-Lys3 का CDR3 लूप HEWL उत्प्रेरक स्थल के साथ अधिकांश संपर्क बनाता है । HEWL करने के लिए cAB-Lys3 की बाइंडिंग अपनी एंजाइमी गतिविधि को रोकता है । यह आंकड़ा और यहां प्रस्तुत परिणाम हमारे पिछले काम15में प्रकाशित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: प्रयोग में प्रयुक्त सेंसर का चित्र. प्रत्येक संवेदक 8 व्यक्तिगत चिप्स का एक समूह भी शामिल है । प्रत्येक चिप पर, वहाँ तीन इलेक्ट्रोड हैं: एक काम इलेक्ट्रोड, एक संदर्भ इलेक्ट्रोड, और एक काउंटर आयन इलेक्ट्रोड. कॉपर-कवर्ड भाग को किसी कंप्यूटर से कनेक्टेड डिजिटल मीटर से प्लग किया जाता है । व्यक्तिगत चिप्स 4 जोड़े के रूप में आयोजित कर रहे हैं, जहां "-" लेबल चिप्स नकारात्मक नियंत्रण इलेक्ट्रोड और कर रहे हैं "+" लेबल चिप्स नमूना इलेक्ट्रोड हैं. यह सेटअप अलग प्रायोगिक प्रतिकृति या HEWL/β-lactamase सांद्रता एक साथ परीक्षण किया जा करने के लिए अनुमति देता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: प्रयोगात्मक सेटअप के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व हमारे में प्रयुक्त संवेदी परख । HEWL एक पाणि (polyaniline) लेपित इलेक्ट्रोड पर स्थिर किया गया था । chimeric प्रोटीन BlaP-cAb-Lys3 तो इलेक्ट्रोड पर लागू किया गया था. मैटीरियल β-lactamase गतिविधि, जो benzylpenicillin के hydrolysis द्वारा प्रेरित प्रोटॉन की रिहाई को मापने के द्वारा निर्धारित किया जाता है, सीधे HEWL और chimeric प्रोटीन के बीच बातचीत के लिए आनुपातिक है । प्रोटॉन रिलीज विद्युत कंडक्टर परिवर्तन है कि एक संकेत है कि उपयोगकर्ता द्वारा व्याख्या की जा सकती में परिवर्तित कर रहे है लाती है । कंडक्टर अंतर के विकास के बीच मनाया पाणि लेपित और समय के एक समारोह के रूप में संदर्भ इलेक्ट्रोड. यह आंकड़ा और यहां प्रस्तुत परिणाम हमारे पिछले काम15में प्रकाशित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: conductimetric की चित्रमय प्रतिनिधित्व BlaP-cAb-Lys3 HEWL के लिए विशिष्ट सहभागिता दिखा माप । benzylpenicillin के अलावा एक तीर से संकेत दिया है । इस संभावित अंतर प्रोटॉन एंटीबायोटिक hydrolysis पर होने वाली रिलीज से परिणाम । माप के साथ प्रदर्शन किया गया हाइब्रिड प्रोटीन BlaP-cAb-Lys3 (लाल) और देशी β-lactamase BlaP बिना किसी भी डाला nanobody (नीला), एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में. अलग curves अलग चिप्स पर प्रदर्शन स्वतंत्र माप का प्रतिनिधित्व करते हैं । यह आंकड़ा और यहां प्रस्तुत परिणाम हमारे पिछले काम15में प्रकाशित किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

इस काम में हम एक वाहक प्रोटीन के रूप में BlaP β-lactamase का उपयोग कर एक nanobody functionalize करने के लिए एक विधि वर्तमान और हम हम सफलतापूर्वक एक potentiometric संवेदक परख में परिणामी संकर प्रोटीन को लागू कर सकते हैं कि दिखा. हमारे काम का मुख्य नवाचार पहलू अंय के लिए है, जो विद्युत संकेत उत्पंन एंजाइमी गतिविधि के लिए एंटीबॉडी भाग के युग्मन आबंध है । यह तथाकथित प्रोटीन प्रविष्टि प्रौद्योगिकी के लाभ और सीमाएं है कि इस खंड का मुख्य ध्यान केंद्रित किया जाएगा प्रस्तुत करता है ।

संकर β-lactamase प्रौद्योगिकी के लाभ ।

β-लैक्टमेज़ कुशल एंजाइमों हैं
सबसे महत्वपूर्ण मापदंडों में से एक है कि संवेदनशीलता और संकेत करने वाली शोर अनुपात एक एंजाइमी के प्रभाव को संकेत उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल किया गतिविधि है । इस संदर्भ में, β-लैक्टमेज़ कई लाभ वर्तमान: वे छोटे हैं (≈ 29 केडीए), monomeric, बहुत स्थिर, और अधिक महत्वपूर्ण बात, प्रदर्शन उच्च विशिष्ट गतिविधि और अन्य एंजाइमों की तुलना में उच्च कारोबार potentiometric सेंसर परख में इस्तेमाल किया जैसे ग्लूकोज oxidase, यूरीस, lipase, peroxydase या क्षार फॉस्फेट२०. इन सभी कारणों के लिए, β-लैक्टमेज़ विभिंन उपसेंसर परख के लिए पसंद के एंजाइमों हैं ।

β-lactamase में प्रत्यक्ष सम्मिलन उत्पादन उपज और डाला प्रोटीन की स्थिरता में सुधार कर सकते हैं/
कई immunosensor परख के सीमित पहलुओं में से एक की गुणवत्ता (जैसे स्थिरता, पवित्रता) है एंटीबॉडी analyte का पता लगाने के लिए इस्तेमाल किया2। वर्तमान में, एंटीबॉडी या एंटीबॉडी टुकड़े की कम लागत उत्पादन प्रणालियों (उदा. ई. कोलाई) चुनौतीपूर्ण रहते हैं और अक्सर गरीब घुलनशीलता और स्थिरता के साथ एकीकृत प्रोटीन के लिए नेतृत्व21. हमारे संकर β-lactamase प्रौद्योगिकी के लिए एक अच्छा दृष्टिकोण इन कठिनाइयों से उबरने के बाद से हम पहले से पता चला है कि इस रणनीति अभिव्यक्ति उपज में सुधार और डाला प्रोटीन की स्थिरता डोमेन लगता है14। विशेष रूप से, वर्तमान अध्ययन में, हमारे संकर β-lactamase प्रणाली का उपयोग करते हुए, chimeric प्रोटीन नाम BlaP-cAb-Lys3 सफलतापूर्वक ई. कोलाई में एक बहुत अच्छी उपज के साथ व्यक्त किया गया था (≈ संस्कृति के प्रति लीटर शुद्ध प्रोटीन की 10 मिलीग्राम) और सजातीयता को शुद्ध ।

एंटीबॉडी और एंजाइमी moieties के बीच युग्मन आबंध सस्ता और तेजी से सेंसर परख बनाता है
पारंपरिक immunosensors में, analyte का पता लगाने प्राथमिक एंटीबॉडी कि सेंसर चिप पर मैटीरियल है के उपयोग की आवश्यकता है । बाद में, एक माध्यमिक एंटीबॉडी कि एक एंजाइम या एक लेबल जांच के लिए युग्मित है भी एक औसत दर्जे का संकेत उत्पंन करने के लिए आवश्यक है । इस दृष्टिकोण कई मशीन और धुलाई कदम शामिल है और इसलिए समय लगता हो सकता है । इसके अलावा, इस प्रोटोकॉल के बाद से कई एंटीबॉडी की आवश्यकता होती है और माध्यमिक एंटीबॉडी और एक एंजाइम के बीच युग्मन आबंध/जांच भी जरूरी है । इसके विपरीत, हमारी प्रणाली केवल एक संकर प्रोटीन का उपयोग करता है का पता लगाने और analyte मात्रा, और इसलिए माध्यमिक एंटीबॉडी के उपयोग के बिना वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देता है ।

इसके अलावा, यह एक β-लैक्टमेज़ वर्ग में डोमेन प्रविष्टि नोट करने के लिए महत्वपूर्ण है allosteric स्विच-की तरह व्यवहार22,23का प्रदर्शन प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए दिखाया गया था । इस तरह के स्विचों में कई आवेदन मिल सकता है-आधारित-संवेदी परख ।

हाइब्रिड β-lactamase तकनीक की सीमाएं ।

प्रोटीन इंजीनियरिंग द्वारा प्रेरित सीमाएं ।
इस प्रणाली में, मुख्य कठिनाई को डिजाइन और β-lactamase में एंटीबॉडी moiety डालने के द्वारा एक संकर प्रोटीन प्राप्त करने के लिए है । इस परिणामस्वरूप chimeric प्रोटीन bifunctional होना चाहिए: एंजाइमी moiety को कुशलतापूर्वक hydrolyse β-लस्टम एंटीबायोटिक्स बिजली के संकेत उत्पन्न करने में सक्षम रहना चाहिए, जबकि एंटीबॉडी moiety उच्च अपनत्व के साथ लक्षित analyte के लिए बाध्य करना होगा और विशिष्टता. bifunctional chimeric प्रोटीन प्राप्त करने के लिए, विभिन्न मापदंडों steric बाधाओं से बचने के क्रम में विचार किया जाना चाहिए । पहला महत्वपूर्ण बिंदु सम्मिलन स्थल की स्थिति है. हालांकि यह दिखाया गया है कि एकाधिक सम्मिलन अंक संभव हैं24,25,26, सम्मिलन पदों अक्सर वाहक प्रोटीन की सक्रिय साइट से दूर विलायक उजागर छोरों में स्थित हैं. यह संभावित गठन परिवर्तन या steric डाला प्रोटीन द्वारा प्रेरित बाधा को कम करता है । एक ही कारण के लिए, यह भी सिफारिश की है कि डाला प्रोटीन की सक्रिय साइट के सम्मिलन साइट से दूर स्थित है ताकि अपनी गतिविधि के परिवर्तन को रोकने के लिए । अंत में, प्रोटीन की प्रविष्टि है कि वर्तमान लचीला या पड़ोसी एन-और सी-टर्मिनल उग्रवाद बेहतर सहन किया जाएगा । दरअसल, दूर और कठोर उग्रवाद chimeric प्रोटीन के दोनों भागीदारों पर steric बाधाओं को लागू कर सकते हैं, और इस तरह उनके संबंधित जैविक गतिविधियों को बदल । इसलिए, यह उल्लेख करने के लिए महत्वपूर्ण है कि डाला प्रोटीन के आकार के परिणामस्वरूप chimeric प्रोटीन पर ही कम प्रभाव पड़ता है । वास्तव में, यह है कि बड़े संरचित डोमेन सफलतापूर्वक β-लैक्टमेज़ में डाला जा सकता है, के रूप में उनके N-और C-टर्मिनल के रूप में लंबे समय के रूप में लचीला या एक दूसरे को बंद कर रहे है दिखाया गया है13,14,2, 3 , 4 , 5 , ६ , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. वर्तमान अध्ययन में, BlaP में सम्मिलन स्थल अपनी सक्रिय साइट से दूर स्थित है और डाला nanobody अपेक्षाकृत लंबी और लचीली (एक्स-रे संरचना में दिखाई नहीं) है कि दूर paratope से दूर स्थित हैं । इन विशिष्ट सुविधाओं को सुनिश्चित करना है कि ंयूनतम steric बाधाओं संकर प्रोटीन के दोनों भागीदारों के जैविक रूप से सक्रिय सतहों पर लगाया जाता है । हालांकि, जब डाला प्रोटीन एक वाहक प्रोटीन में इष्टतम प्रविष्टि के लिए अनुशंसित मानदंड मौजूद नहीं है, यह संभव है आदेश में लिंकर क्षेत्रों इंजीनियर के लिए संभावित steric बाधाओं को कम करने के लिए । दरअसल, एक लचीला linker की उपस्थिति (उदा Gly-Ser पुनरावृत्ति) वाहक और डाला प्रोटीन कनेक्ट करने के लिए नाटकीय रूप से एक वाहक एक में बड़े और संरचित प्रोटीन के सम्मिलन की दिशा में सहनशीलता में वृद्धि दिखाया गया था30 ,12.

विद्युत के लिए निहित सीमाएं ।
हालांकि विद्युत/potentiometric के विकास के एक बढ़ती क्षेत्र बन गया है संवेदी, इन परख महत्वपूर्ण सीमाएं है कि जब करने के लिए विचार किया जा करने की आवश्यकता है जब यह है कि सेंसर प्रयोग डिजाइनिंग । सबसे पहले, सभी शामिल है कि एच+ रिलीज या जारी रखने के लिए बहुत कमजोर बफर समाधान के उपयोग की आवश्यकता है (यानी < 5 mM)31 के क्रम में महत्वपूर्ण संभावित मतभेदों को मापने के लिए । एच+ रिलीज पर प्रेरित पीएच परिवर्तन प्रोटीन गुण और संकेत उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया एंजाइमी गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं । दूसरे, पीएच और ईओण के तरल पदार्थ में ताकत काफी भिंन हो सकते है और फलस्वरूप प्रतिक्रिया में महत्वपूर्ण बदलाव में परिणाम और३२की पृष्ठभूमि शोर वृद्धि हुई है । यही कारण है, विभिंन अनुसंधान समूहों के लिए nanotechnologies विकसित करने की कोशिश की है विद्युत संवेदक तत्वों के आकार में कमी के क्रम में डिवाइस के इंटरफेस पर होने वाली प्रक्रियाओं के लिए संकेत-शोर अनुपात को बढ़ाने के लिए३३, ३४ , ३५. एक परिणाम के रूप में, यह भी एक ही एंजाइम के कई अणुओं के साथ लेबल एंटीबॉडी अणुओं को विकसित करने के लिए अपने लक्ष्य३२के लिए एक अणु के बंधन से उत्पंन संकेत को बढ़ाने के लिए संभव है । हालांकि, इन सीमाओं के बावजूद, conductometric/LODs 10-8 से 10-11 एम३६की रेंज में पता लगाने की अनुमानित सीमाओं के साथ उच्च कुशल और संवेदनशील उपकरणों रहते हैं ।

इस अध्ययन में, हमें पता चला है कि हम सफलतापूर्वक एक nanobody है कि एक वर्ग एक β-lactamase नाम BlaP में HEWL लक्ष्यों को सम्मिलित कर सकते हैं, और है कि उत्पन्न संकर प्रोटीन दोनों जैविक गतिविधियों को बरकरार रखता है: i) HEWL और द्वितीय की कडी बाइंडिंग) क्षमता को hydrolyse β-लस्टम एंटीबायोटिक्स. इस अध्ययन के विभिंन nanobodies या BlaP में एंटीबॉडी टुकड़े और potentiometric सेंसर परख में इस संकर प्रोटीन प्रौद्योगिकी के कार्यांवयन के सम्मिलन के लिए अवधारणा का एक सबूत का गठन किया । इस प्रौद्योगिकी के संभावित विभिंन प्रोटीन epitopes का पता लगाने और कई नैदानिक उपकरणों में कार्यांवित किया जा सकता है । वास्तव में, विकास और ऐसे परख के प्रभावी उपयोग हमारे समाज में महत्वपूर्ण हो गए है और अनिवार्य रूप से सामाजिक और आर्थिक कम लागत और आसान के लिए विभिंन क्षेत्रों में प्रौद्योगिकियों संचालित करने के लिए द्वारा संचालित कर रहे है जैसे खाद्य और स्वास्थ्य प्रणाली, विशेष रूप में विकासशील देशों । इसके अलावा, nanotechnologies ऐसे सेंसर के विकास में एक बढ़ती हुई भूमिका निभाते हैं । आजकल सिग्नल प्रोसेसिंग तकनीकें पोर्टेबल डिवाइसेस पर उपलब्ध हैं जैसे स्मार्टफोन और टैबलेट और सिग्नल प्रोसेसिंग के लिए पहले से मौजूद विभिन्न स्मार्टफ़ोन एप्लिकेशन३७। उदाहरण के लिए, हाल ही में, एक potentiometric सेंसर डिवाइस एक smartphone में एकीकृत किया गया है ग्लूकोज एकाग्रता की निगरानी की अनुमति देने के लिए३८. स्वास्थ्य विशेषज्ञों का विश्वास है कि इस तरह के अभिनव उपकरणों के लिए आने वाले वर्षों में और अधिक महत्वपूर्ण स्वास्थ्य समाधान हो जाएगा३९,४०।

अंत में, यह काम एक उदाहरण है कि क्षमता और हमारे प्रोटीन प्रविष्टि प्रौद्योगिकी के लाभ से पता चलता है का प्रतिनिधित्व करता है । हमें उंमीद है कि इस काम के लिए अनुसंधान और चिकित्सा प्रयोजनों के लिए अभिनव और उपयोगी प्रौद्योगिकियों के विकास में योगदान देगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक बेल्जियम के Walloon क्षेत्र को SENSOTEM और NANOTIC अनुसंधान परियोजनाओं के ढांचे के भीतर स्वीकार करते हैं और साथ ही उनके वित्तीय सहायता के लिए वैज्ञानिक अनुसंधान (F.R.S.-एफ. एन. आर. एस.) के लिए राष्ट्रीय कोष भी तैयार करते हैं.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
KH2PO4 Sigma-Aldricht V000225 
K2HPO4 Sigma-Aldricht 1551128
NaCl Sigma-Aldricht S7653
Tris–HCl Roche 10812846001
EDTA  Sigma-Aldricht E9884
KCl Sigma-Aldricht P9541
Na2HPO4  Sigma-Aldricht NIST2186II
2-mercaptoethanol Sigma-Aldricht M6250
alanine Sigma-Aldricht A7627
HClO4 Fluka 34288 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht
casein hydrolysate Sigma-Aldricht 22090
benzylpenicillin sodium Sigma-Aldricht B0900000
hen egg white lysozyme Roche 10837059001
heptane Sigma-Aldricht 246654
methanol Sigma-Aldricht 322415
ammonium hydroxide solution Sigma-Aldricht 380539 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?)
Laboratory consumables
6-well plate  Greiner Bio-One 657165 CELLSTAR 6-Well Plate
Equipment
pH meter WTW 1AA110 Lab pH meter inoLab pH 7110
vacuum and filtration system Nalgene NALG300-4100 Filter holders with receiver, distributor : VWR
potentiometric sensor chips manufactured by Yunus and colleagues (ref 16)
PGSTAT30 Autolab Metrohm Autolab discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N
digital multimeter, METRAHit 22M Gossen Metrawatt discontinued, successor Metrahit Base

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References

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अभियांत्रिकी निर्गम १३२ β-lactamase हाइब्रिड प्रोटीन प्रौद्योगिकी (बीएचपी) conductimetric nanobodies आणविक बातचीत lysozyme
एक β-lactamase-आधारित Conductimetric के उपयोग के लिए गैर-आणविक बातचीत का पता लगाने के लिए परख
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Vandevenne, M., Dondelinger, M.,… More

Vandevenne, M., Dondelinger, M., Yunus, S., Freischels, A., Freischels, R., Crasson, O., Rhazi, N., Bogaerts, P., Galleni, M., Filée, P. The Use of a β-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions. J. Vis. Exp. (132), e55414, doi:10.3791/55414 (2018).

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