Summary
En este trabajo se presenta un nuevo método para estudiar las interacciones de la proteína-proteína usando un biosensores conductimétricos basados en la tecnología híbrida de β-lactamasa. Este método se basa en la liberación de protones al producirse la hidrólisis de β-lactámicos.
Abstract
Biosensores son cada vez más importante y puesto en ejecución en varios campos tales como la detección de patógenos, diagnóstico molecular, monitoreo ambiental y control de la seguridad alimentaria. En este contexto, usamos β-lactamasas como enzimas reportero eficaz en varios estudios de interacción de proteínas. Además, su capacidad para aceptar las inserciones de péptidos o dominios de proteínas estructurados fuertemente alienta el uso de estas enzimas para generar proteínas quiméricas. En un estudio reciente, inserta un fragmento de anticuerpo único dominio en el Bacillus licheniformis BlaP β-lactamase. Estos dominios pequeños, también llamados nanobodies, se definen como los dominios de unión a antígeno de anticuerpos de cadena única de camélidos. Como el común de los anticuerpos de doble cadena, presentan alta afinidad y especificidad para sus blancos. La proteína quimérica resultante exhibió una alta afinidad contra su destino conservando la actividad de β-lactamasa. Esto sugiere que las moléculas nanobody y β-lactamasa siguen siendo funcionales. En el presente trabajo, se presenta un protocolo detallado que combina nuestro sistema híbrido de β-lactamasa a la tecnología de biosensores. La unión específica de la nanobody a su objetivo puede ser detectada gracias a una medición conductimétricos de los protones liberados por la actividad catalítica de la enzima.
Introduction
Biosensores son dispositivos analíticos que combinan una interacción bio-molecular con dispositivos de señalización físicos o químicos denominados transductores1. Las señales registradas se pueden interpretar y convertidas para monitorear las interacciones entre las partes inmovilizadas y libres. La mayoría de los biosensores incluyen el uso de un anticuerpo para detectar analitos tales como hormonas o patógeno diferentes marcadores2. Formatos de sensor diferente pueden utilizarse e incluyen biosensores basados en la masa, magnéticos, ópticos o electroquímicos. Estos últimos están entre los más comúnmente usados sensores y funcionan mediante la conversión de un evento de enlace en una señal eléctrica. Las actuaciones y sensibilidades de todos los biosensores basados en anticuerpos son fuertemente dependientes en básicamente dos parámetros: i) la calidad de los anticuerpos y ii) las características del sistema utilizado para generar la señal2.
Los anticuerpos son proteínas dimérica masa molecular alta (150-160 kDa) que se componen de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. La interacción entre las cadenas pesadas y ligeras sobre todo se estabiliza por interacciones hidrofóbicas, así como un enlace de disulfuro conservado. Cada cadena incluye un dominio variable que interactúa con el antígeno esencialmente a través de tres regiones hipervariables denominado regiones determinación complementarias (CDR1-2-3). A pesar de numerosos avances en el campo, la expresión a gran escala de anticuerpos completos con sistemas de expresión de bajo costo (por ejemplo, e. coli) a menudo conduce a la producción de proteínas inestables y agregadas. Por esta razón varios fragmentos de anticuerpos han sido diseñados como fragmentos de cadena simple variable3 (ScFvs ≈ 25 kDa). Consisten en los dominios variables de respectivamente una pesada y una cadenas ligeras que son covalente por una secuencia de aminoácido sintético. Sin embargo, estos fragmentos a menudo mostrar una estabilidad pobre y tienen la tendencia a agregado, dado que expone gran parte de sus regiones hidrofóbicas al solvente4. En este contexto, fragmentos de anticuerpos de camélidos de cadena única, denominadas nanobodies o VHHs, parecen ser excelentes alternativas de ScFvs. Estos dominios corresponden a los dominios variables de anticuerpos de cadena simple de camélidos. En contraste con anticuerpos convencionales, camélidos anticuerpos están desprovistos de las cadenas ligeras y sólo contienen dos cadenas pesadas5. Por lo tanto, nanobodies son el más pequeño monomérica fragmentos de anticuerpos (12 kDa) capaces de unirse a un antígeno con una afinidad similar a la de anticuerpos convencionales6. Además, presentan mayor estabilidad y solubilidad en comparación con otros anticuerpos completos o fragmentos de anticuerpos. Por último, sus pequeños tamaños y sus extendidos lazos CDR3 les permiten reconocer epítopes crípticos y se unen a la enzima sitios activos7,8. Hoy en día, estos dominios están recibiendo considerable atención y se han combinado a la tecnología de biosensores. Por ejemplo, Huang et al. han desarrollado un biosensor basado en nanobody para la detección y cuantificación de antígeno específico de la próstata humana (PSA)9.
Como mencionado por encima, un parámetro importante en los ensayos de biosensor es la eficiencia del sistema utilizado para generar la señal eléctrica. Por esta razón, base enzimática biosensores electroquímicos han atraído cada vez más y se han utilizado ampliamente para diversas aplicaciones tales como salud, seguridad alimentaria y vigilancia del medio ambiente. Estos biosensores se basan en la hidrólisis catalítica de un substrato por una enzima para generar la señal eléctrica. En este contexto, β-lactamasas fueron demostrados para ser más específicos, más sensibles y fáciles de aplicar experimentalmente que muchas otras enzimas tales como fosfatasa alcalina o peroxidasa de rábano picante10. Β-lactamasas son enzimas que son responsables de la resistencia bacteriana a los antibióticos β-lactámicos por les hidrolización. Son monoméricos, muy estable, eficiente y de pequeño tamaño. Por otra parte, las inserciones de dominio/péptido en β-lactamasas generan proteínas quiméricas bifuncional que mostraron ser eficientes herramientas para el estudio de las interacciones proteína-ligando. De hecho, estudios recientes han demostrado que la inserción de fragmentos variables de anticuerpos en los resultados de β-lactamasa TEM1 en una proteína quimérica que sigue siendo capaz de unirse con alta afinidad a su antígeno de la blanco. Curiosamente, el atascamiento del antígeno fue demostrado para inducir la regulación alostérica de la actividad catalítica de TEM111,12. Además, hemos demostrado en varios estudios que la inserción de dominio de proteína en forma permisiva de bucle de la β-lactamasa de Bacillus licheniformis BlaP genera proteínas quiméricas funcionales que se adaptan bien a monitorizar las interacciones proteína-ligando13 ,14. Recientemente hemos insertado un nanobody, denominado taxi-Lys3, en este sitio de inserción permisiva de BlaP15. Este nanobody fue demostrado para enlazar a la lisozima de clara de huevo de gallina (HEWL) y para inhibir su actividad enzimática16. Demostramos que la proteína híbrida generada, llamada BlaP-cAb-Lys3, conserva una especificidad alta / afinidad contra HEWL mientras que la actividad de β-lactamasa se mantuvo sin cambios. Luego con éxito combina la tecnología híbrida de β-lactamasa para un biosensor electroquímico y demostró que la cantidad de señal eléctrica generada era dependiente de la interacción entre BlaP-cAb-Lys3 y HEWL inmovilizada en un electrodo. De hecho, hidrólisis de β-lactámicos por BlaP inducen una liberación de protones que se puede convertir en una señal eléctrica cuantitativa. Esta combinación de la tecnología híbrida de β-lactamasa con un biosensor electroquímico es rápida, sensible y cuantitativo y permite la medición en tiempo real de la señal generada. Esta metodología se describe en este documento.
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Protocol
1. preparación de la muestra de proteína
- Producir y purificar la proteína híbrida BlaP-cAb-Lys3 como se informó en nuestro anterior estudio15. Almacenar la proteína en 50 m m tampón fosfato pH 7,4 con la siguiente composición: 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4 , 8 g de NaCl y 0.24 g de KH2PO4 disueltos en 800 mL de agua destilada el pH de la solución a 7.4 antes de fijan ajustar el volumen final de la solución a 1 L. filtro esterilizar la solución de proteína.
- Preparar una solución de reserva de lisozima (HEWL) de huevo de gallina. Disolver 100 mg (40.000 unidades/mg) de HEWL comercialmente comprado en 10 mL de solución salina buffer fosfato (PBS ver paso 2.1.1). Esterilizar la solución de la proteína por filtración utilizando filtros con un corte de 0.22 μm.
2. biosensor ensayos
-
Preparación de la solución y buffer
- Preparar 50 mM PBS disolviendo 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4y 0.24 g de KH2PO4 en 800 mL de agua destilada. Ajustar a pH 7,4 con 1 N HCl o NaOH N 1 antes de ajustar el volumen de la solución a 1 L. filtro esterilizar y almacenar a 4 ° C.
- Preparar una solución de saturación/bloqueo disolviendo 3 g de hidrolizado de caseína en 100 mL de PBS, preparado como se describió anteriormente (ver paso 2.1.1). Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
- Preparar una solución vinculante disolviendo 1 g de hidrolizado de caseína en 100 mL de PBS, preparado como se describió anteriormente (ver paso 2.1.1). Filtro de esterilizar y almacenar a 4 ° C.
- Preparar una solución de lavado (0,1% Tween - PBS) mediante la adición de 100 μL de Tween 20 (100%) en 100 mL de PBS, preparado como se describió anteriormente (ver paso 2.1.1). Almacenar a 4 ° C.
- Preparar una solución de preparación del electrodo (1% Tritón X-100-PBS) Añadir 1 mL de Tritón X-100 (100%) en 100 mL de PBS, preparado como se describió anteriormente (ver paso 2.1.1). Almacenar a 4 ° C.
- Preparar una solución de regeneración de electrodos (3, 5 M KCl) disolviendo 26 g de KCl en agua destilada hasta un volumen final 100 mL. Filtro esterilizado y almacenar a 4 ° C.
- Preparar una solución de NaCl de 5 mM por disolución 0,29 g de NaCl en agua destilada hasta un volumen final de 1 L. filtro esterilizar y almacenar a 4 ° C. Luego, prepare una solución de detección (4 mM bencilpenicilina) disolviendo 26,7 mg de benzilpenicilina en 20 mL de solución de NaCl de 5 mM. Filtro de esterilizar y almacenar a-20 ° C.
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Regeneración y preparación del sensor
Nota: La polianilina cubierta sensor chips fueron desarrollados y proporcionados amablemente por el Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus y Prof. Y. Glupczynski (católico Universidad de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). La descripción del sensor así como los protocolos de la polimerización de electro de polianilina usados para sintetizar estos sensores se detallan en su anterior trabajo17. Brevemente, este sistema utiliza sensores reutilizables de ocho fichas individuales que fueron fabricados por técnicas de clásicos del circuito impreso (PWB). Fichas individuales se componen de tres electrodos redondos puntos. La superior es el electrodo de trabajo el cual polianilina fue sintetizado con electro. El medio es el electrodo de referencia y el electrodo inferior constituye el contraelectrodo. Tanto, la referencia y los electrodos de contador son funcionalizados con amalgama de Ag/AgCl sólido sobre la capa de carbón.- Realizar 3 lavados de los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 300 μL/pocillo de solución de preparación del electrodo (ver de 1% Tritón X-100-PBS, paso 2.1.5.). Realizar cada lavado durante 2 min con mezcla suave a temperatura ambiente.
- Enjuague los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 300 μL/pocillo de agua destilada por 2 min con mezcla suave a temperatura ambiente.
- Regenerar los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 300 μL/pocillo de la solución de regeneración (3.5 M KCl, ver paso 2.1.6) durante la noche a 4 ° C o 1 h a temperatura ambiente.
- Realizar 3 lavados de los electrodos sumergiendo las puntas en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 300 μL/pocillo de solución salina buffer fosfato (vea el paso 2.1.1.). Realizar cada lavado durante 2 minutos con una mezcla suave a temperatura ambiente.
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Vinculante el análisis realizado en el sensor
- Capa HEWL sobre la superficie PANI (polianilina) del electrodo depositando una gota de 15 μl de 40 μg/mL HEWL preparado en PBS sobre la superficie del electrodo. Incubar durante una noche a 4 ° C o 1 hora a temperatura ambiente.
- Realizar tres lavados de los electrodos con una solución buffer fosfato (ver paso 2.1.1) sumergiendo las piezas de electrodo de los chips de sensores en los pocillos de una placa de 96 pocillos con 300 μL/pocillo de solución salina buffer fosfato. Realizar cada lavado durante 2 min con mezcla suave a temperatura ambiente.
- Saturar los electrodos mediante la adición de una gota de 50 μl de la solución de bloqueo (ver paso 2.1.2) sobre la superficie del electrodo. Incubar durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, lave tres veces como se describe en el anterior paso (ver paso 2.3.2).
- Diluir la solución BlaP-cAb-Lys3 a 20 μg/mL en solución de encuadernación (véase el paso 2.1.3) y aplique una gota de 15 μl de esta solución diluida en los electrodos. Incubar 10 min a temperatura ambiente. Después de la reacción antígeno-nanobody, lave tres veces como se describe en el paso anterior utilizando la solución de lavado (ver paso 2.1.4). Luego enjuague el electrodo una vez con PBS (ver paso 2.1.1).
- Para la detección, enchufe la viruta del sensor a través de la parte del circuito de cobre a un multímetro digital. A continuación, iniciar la respuesta del sensor mediante la aplicación de una gota de 50 μl de la solución de detección (ver paso 2.1.7) hacia los electrodos positivos y la aplicación de una gota de 50 μl de solución de NaCl al 5 mM sobre los electrodos negativos (ver paso 2.1.7). Incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Monitor de la conductancia con un multímetro digital.
Nota: El multímetro fue proporcionado por el Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus y Prof. Y. Glupczynski (Universidad Católica de Lovaina-la-nueva - CHU Mont-Godinne. Este potenciostato está controlado por ordenador mediante un puerto USB y analiza simultáneamente las ocho diversas virutas del sensor. El software creado por Yunus y colaboradores17 crea un trazado en tiempo real que representa la medición de la diferencia de conductancia entre los electrodos de referencia y muestra contra el tiempo.
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Representative Results
Diseño e ingeniería de la proteína quimérica BlaP-cAb-Lys3
La figura 1 representa la inserción de cabina Lys3 en un bucle permisiva de la BalP clase A β-lactamase del bacilo licheniformis. La inserción se realizó entre residuos Asp198 y Lys199. Un sitio de la hendidura de la trombina fue introducido a cada lado de la cabina-Lys3. Las células transformadas con un plásmido de expresión constitutiva codificando la proteína quimérica BlaP-cAb-Lys3 eran capaces de crecer en presencia de una pequeña concentración de ampicilina. Este resultado indica que la β-lactamasa del híbrido es soluble, correctamente doblados y puede ser excretado con éxito en el espacio periplasmic de las bacterias donde eficientemente puede proporcionar resistencia frente a ampicilina. Además analizamos la bifunctionality de la proteína quimérica. Como se informó en los estudios previos, nuestros datos demostraron que el β-lactamase, así como los bandos Lys3 cAb de la proteína quimérica conservan sus actividades biológicas15.
Ensayo de biosensores conductimétricos
El sensor de chips utilizados para este ensayo se muestra en la figura 2. Los sensores usados para estos experimentos contienen chips de 8. Cada chip incluye tres electrodos: un electrodo de trabajo, un contra electrodo y electrodo de un referencia. Estos 8 chips se organizan como 4 pares en el sensor. Para cada par, uno de los chips con la etiqueta "-" corresponde a un control negativo, mientras que el chip con la etiqueta "+" corresponde a la muestra.
Figura 3 representa la descripción esquemática de la disposición experimental utilizada en este trabajo que combina la tecnología híbrida de β-lactamasa para un biosensor potenciométrico. En esta configuración, se utilizan dos electrodos: i) un electrodo de referencia y ii) un electrodo revestido de polianilina (PANI). HEWL se adsorbe sobre el electrodo revestido de PANI, según ha informado en otros estudios18,19. Después de lavados adecuados, BlaP-cAb-Lys3 (para "+" etiquetado fichas) o BlaP sin nanobody insertado (para "-" etiquetado chips) se aplican en los electrodos. Tras la adición de β-lactámicos (bencilpenicilina) en los electrodos, se miden cambios en la conductancia del electrodo. En efecto, los β-lactámicos hidrólisis por β-lactamasas genera una liberación de protones; que fue demostrado para crear cambios significativos en la conductancia de electrodo con un tiempo de respuesta muy corto. Los ensayos de biosensor presentados en la figura 4 indican que el atascamiento de BlaP-cAb-lys3 a HEWL inmovilizada en el electrodo PANI puede ser detectado y monitoreado midiendo la liberación de protones resultantes de la actividad de β-lactamasa inmovilizados. En cambio, ninguna diferencia de conductancia fue detectada cuando el experimento se realizó con BlaP sin cualquier nanobody insertado.
Figura 1: esquema que representa la proteína quimérica BlaP-cAb-Lys3 interactuando con HEWL. BlaP aparece en cyan, cAb-Lys3 en naranja y HEWL en azul. Esta cifra se obtuvo mediante la combinación de las estructuras tridimensionales de BlaP (PDB ID: 4BLM) y el complejo de cAb-Lys3/HEWL (PDB ID: 1MEL). El β-lactamase contiene 2 dominios: el dominio α/β y el dominio α, el sitio catalítico se encuentra en la interfase entre ambos dominios. El circuito utilizado para la inserción es resaltado en amarillo y situado en un bucle expuestos al solvente en el dominio α. Las partes de N y C terminal del taxi Lys3 aparecen en rojo. El bucle de CDR3 del taxi Lys3 hace que la mayoría de los contactos con el sitio catalítico de HEWL. La Unión de la cabina-Lys3 a HEWL inhibe su actividad enzimática. Esta cifra y los resultados presentados aquí han sido publicados en nuestro anterior trabajo15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: imagen del sensor utilizado en el experimento de. Cada sensor incluye un grupo de 8 chips individuales. En cada chip, hay tres electrodos: un electrodo de trabajo, un electrodo de referencia y un electrodo de iones de contador. La parte cubierta de cobre se conecta a un multímetro conectado a un ordenador. Los chips individuales se organizan como 4 pares donde el "-" etiquetados chips son electrodos de control negativo y el "+" etiquetados chips son los electrodos de la muestra. Esta configuración permite diferentes repeticiones experimentales o HEWL / concentraciones de β-lactamasa a probarse al mismo tiempo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: representación esquemática de la disposición experimental utilizada en nuestro ensayo de biosensor. HEWL fue inmovilizada sobre un electrodo revestido de PANI (polianilina). La proteína quimérica BlaP-cAb-Lys3 entonces fue aplicada sobre el electrodo. La actividad β-lactamase inmovilizado, que se determina midiendo la liberación de protones inducidos por la hidrólisis de la bencilpenicilina, es directamente proporcional a la interacción entre la proteína quimérica y HEWL. La liberación de protones induce cambios de conductividad eléctrica que se convierten en una señal que puede ser interpretada por el usuario. Evolución de la diferencia de conductancia observada entre el PANI revestido y el electrodo de referencia en función del tiempo. Esta cifra y los resultados presentados aquí han sido publicados en nuestro anterior trabajo15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: representación gráfica de los conductimétricos mediciones mostrando la interacción específica de BlaP-cAb-Lys3 HEWL. La adición de bencilpenicilina está indicada por una flecha. Esta diferencia de potencial resulta de la liberación de protones que ocurre al producirse la hidrólisis antibiótica. Las mediciones se realizaron con la proteína híbrida BlaP-cAb-Lys3 (rojo) y la nativa de β-lactamasa BlaP sin cualquier nanobody insertado (azul), como control negativo. Las diferentes curvas representan mediciones independientes realizadas en diferentes fichas. Esta cifra y los resultados presentados aquí han sido publicados en nuestro anterior trabajo15. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este trabajo presentamos un método para funcionalizar un nanobody utilizando la BlaP β-lactamasa como una proteína portadora y mostramos que podemos implementar con éxito la proteína híbrida resultante en un ensayo de sensor potenciométrico. El aspecto de innovación principal de nuestro trabajo en comparación con otros ensayos de biosensor es el acoplamiento covalente de la parte del anticuerpo a la actividad enzimática que genera la señal eléctrica. Esta tecnología de inserción de proteína llamada presenta ventajas y limitaciones que serán el foco principal de esta sección.
Ventajas de la tecnología híbrida de β-lactamasa.
Β-lactamasas son enzimas eficientes
Uno de los parámetros más importantes que influyen en la sensibilidad y la relación señal a ruido de un biosensor es la actividad enzimática que se utiliza para generar la señal. En este contexto, β-lactamasas presentan varias ventajas: son pequeños (≈29 kDa), monomérica, muy estable y más importante, exhiben alta actividad específica y alta rotación en comparación con otras enzimas utilizados en los análisis potenciométricos de sensor como la glucosa oxidasa, ureasa, lipasa, peroxidasa o fosfatasa alcalina20. Por todas estas razones, β-lactamasas son enzimas de la opción para varios ensayos de biosensor.
Inserción directa en el β-lactamase puede mejorar el rendimiento de producción y la estabilidad del proteína/dominio insertado.
Uno de los aspectos limitantes de muchos ensayos inmunosensor es la calidad (estabilidad, pureza) de los anticuerpos utilizados para detectar el analito2. Actualmente, sistemas de bajo costo de producción de anticuerpos o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo e. coli) siendo difíciles y a menudo conducen a proteínas agregadas con pobre solubilidad y estabilidad21. Nuestra tecnología de β-lactamasa del híbrido parece ser un buen método para superar estas dificultades, ya que anteriormente hemos mostrado que esta estrategia mejora el rendimiento de la expresión y la estabilidad de la proteína insertado dominios14. En particular, en el presente estudio, utilizando nuestro sistema híbrido de β-lactamasa, la proteína quimérica llamada BlaP-cAb-Lys3 fue con éxito expresada en e. coli con un muy buen rendimiento (≈10 mg de proteína pura por litro de cultivo) y purificada a homogeneidad.
Acoplamiento covalente entre el anticuerpo y fracciones enzimáticas hace ensayos de sensor más barato y más rápido
En los inmunosensores convencional, la detección del analito requiere la utilización de anticuerpos primarios que están inmovilizados en el chip del sensor. Posteriormente, un anticuerpo secundario que está acoplado a una enzima o una sonda marcada también es necesaria para generar una señal medible. Este enfoque involucra varias incubaciones y pasos de lavado y por lo tanto puede ser desperdiciador de tiempo. Además, este protocolo es caro ya que se requieren varios anticuerpos y acoplamiento covalente entre el anticuerpo secundario y una sonda de enzima también es necesario. En contraste, nuestro sistema sólo utiliza una proteína híbrida para detectar y cuantificar el analito y por lo tanto, permite en tiempo real monitoreo sin el uso de anticuerpos secundarios.
Además, es importante tener en cuenta que la inserción dominio en clase que un β-lactamasas fue demostrado para generar las proteínas híbridas exhibiendo comportamiento alostérico interruptor22,23. Tales interruptores podrían encontrar numerosas aplicaciones en ensayos basados en biosensores.
Limitaciones de la tecnología híbrida de β-lactamasa.
Limitaciones inducidas por ingeniería de proteínas.
En este sistema, la dificultad principal es diseñar y obtener una proteína híbrida mediante la inserción de la molécula de anticuerpo en la β-lactamasa. Esta proteína quimérica resultante debe ser bifuncional: la molécula enzimática debe ser capaz de hidrolizar eficientemente antibióticos β-lactámicos para generar la señal eléctrica, mientras que la molécula de anticuerpo debe enlazar al analito específico con alta afinidad y especificidad. Para obtener las proteínas quiméricas bifuncionales, varios parámetros deben considerarse para evitar restricciones estérica. El primer punto crítico es la posición del sitio de inserción. Aunque se ha demostrado que varios puntos de inserción son posibles24,25,26, inserción de posiciones se encuentran a menudo en disolvente expuestos lazos lejos del sitio activo de la proteína transportadora. Esto reduce al mínimo posibles cambios conformacionales o impedimento estérico inducido por la proteína insertada. Por las mismas razones, también se recomienda que el sitio activo de la proteína insertada estar situado lejos de la zona de inserción para prevenir alteraciones de su actividad. Por último, inserción de proteínas que presentan las extremidades flexible o vecino N - y c-terminal será mejor tolerada. De hecho, distantes y rígidas de las extremidades pueden imponer limitaciones estérica en ambas partes de la proteína quimérica y así alterar sus respectivas actividades biológicas. Por lo tanto, es importante mencionar que el tamaño de la proteína insertada tiene solamente un impacto pequeño sobre la proteína quimérica resultante. De hecho, se ha demostrado que grandes dominios estructurados pueden ser insertados con éxito en β-lactamasas, mientras sus extremidades de N y C terminal flexibles o cerca de uno a13,14,2, 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 , 28 , 29. en el presente estudio, el sitio de inserción en BlaP se encuentra lejos de su sitio activo y el nanobody insertado tiene extremidades relativamente largo y flexibles (no visibles en la estructura de rayos x) que se encuentran lejos del paratope. Estas características específicas garantizan que mínimo estérica restricciones se impongan a la superficie biológicamente activa de ambos socios de la proteína híbrida. Sin embargo, cuando la proteína insertada no presenta los criterios recomendados para su óptima inserción en una proteína del portador, es posible Ingeniero vinculador regiones con el fin de reducir posibles limitaciones estérica. De hecho, la presencia de un linker flexible (por ejemplo Gly-Ser repeticiones) para conectar el portador y la proteína insertada fue demostrada para aumentar dramáticamente la tolerancia hacia la inserción de proteínas grandes y estructuradas en un portador de una30 ,12.
Limitaciones inherentes a la electroquímica biosensores.
Aunque el desarrollo de biosensores electroquímicos/potenciométricos se ha convertido en un campo cada vez mayor, estos ensayos tienen limitaciones importantes que deben considerarse al diseñar el experimento de biosensor. Primero, todos los biosensores que implican la liberación de H+ o absorción requieren el uso de soluciones tampón muy débil (es decir, < 5 mM)31 para medir diferencias de potencial. La variación del pH inducida sobre el lanzamiento de H+ puede afectar a las propiedades de la proteína y la actividad enzimática que se utiliza para generar la señal. En segundo lugar, pH y fuerza iónica en biofluidos pueden variar significativamente y por lo tanto resultan en variaciones importantes en la respuesta y aumentar el ruido de fondo de los biosensores32. Por esta razón, varios grupos de investigación han intentado desarrollar nanotecnologías para disminuir los tamaños de los elementos del sensor electroquímico para aumentar la relación señal a ruido para los procesos que ocurren en la interfaz del dispositivo33, 34 , 35. en consecuencia, también es posible desarrollar moléculas de anticuerpo marcadas con varias moléculas de la misma enzima para aumentar la señal resultante de la Unión de una molécula a su destino32. Sin embargo, a pesar de estas limitaciones, conductrimétrico/biosensores siguen siendo dispositivos altamente eficientes y sensibles con unos límites de detección (LODs) en el rango de 10-8 10-11 M36.
En este estudio, hemos demostrado que podemos insertar con éxito un nanobody dirigido HEWL en una β-lactamasas de clase A llamado BlaP, y que la proteína híbrida generada mantiene ambas actividades biológicas: i) apretado vinculante de HEWL y ii) la capacidad para hidrolizar Antibióticos β-lactámicos. Este estudio constituye una prueba de concepto para la inserción de varios fragmentos de nanobodies o anticuerpo en BlaP y la aplicación de esta tecnología híbrida de proteína en los ensayos de sensor potenciométrico. Esta tecnología potencialmente podría utilizar para detectar diferentes epítopos de la proteína e implementada en numerosas herramientas de diagnóstico. De hecho, el desarrollo y uso efectivo de estos ensayos se han convertido en cruciales en nuestra sociedad y son esencialmente impulsada por necesidades sociales y económicas de bajo costo y fácil de operar tecnologías en diversos campos tales como sistemas de alimentación y salud, especialmente en países en desarrollo. Además, nanotecnologías juegan un creciente papel en el desarrollo de estos sensores. Hoy en día, tecnologías de procesamiento de señal están disponibles en dispositivos portátiles como smartphones y tablets y smartphone diferentes aplicaciones ya existen para el procesamiento de la señal37. Por ejemplo, recientemente, un dispositivo sensor potenciométrico se ha integrado en un teléfono inteligente para permitir la concentración de glucosa control38. Los expertos en salud están seguros de que estos tipo de innovadores dispositivos serán soluciones de salud más importantes en los próximos años39,40.
En conclusión, este trabajo representa un ejemplo que muestra el potencial y ventajas de nuestra tecnología de inserción de proteína. Esperamos que este trabajo contribuirá al desarrollo de tecnologías innovadoras y útiles para la investigación y con fines médicos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Los autores reconocen la región valona de Bélgica en el marco de los proyectos de investigación SENSOTEM y NANOTIC, así como la nacional fondos para la investigación científica (F.R.S.-F.N.R.S) por su apoyo financiero.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| KH2PO4 | Sigma-Aldricht | V000225 | |
| K2HPO4 | Sigma-Aldricht | 1551128 | |
| NaCl | Sigma-Aldricht | S7653 | |
| Tris–HCl | Roche | 10812846001 | |
| EDTA | Sigma-Aldricht | E9884 | |
| KCl | Sigma-Aldricht | P9541 | |
| Na2HPO4 | Sigma-Aldricht | NIST2186II | |
| 2-mercaptoethanol | Sigma-Aldricht | M6250 | |
| alanine | Sigma-Aldricht | A7627 | |
| HClO4 | Fluka | 34288 | 1M HClO4 solution, distributor : Sigma-Aldricht |
| casein hydrolysate | Sigma-Aldricht | 22090 | |
| benzylpenicillin sodium | Sigma-Aldricht | B0900000 | |
| hen egg white lysozyme | Roche | 10837059001 | |
| heptane | Sigma-Aldricht | 246654 | |
| methanol | Sigma-Aldricht | 322415 | |
| ammonium hydroxide solution | Sigma-Aldricht | 380539 | 28% NH3 in H2O, purified by double-distillation (concentrated?) |
| Laboratory consumables | |||
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657165 | CELLSTAR 6-Well Plate |
| Equipment | |||
| pH meter | WTW | 1AA110 | Lab pH meter inoLab pH 7110 |
| vacuum and filtration system | Nalgene | NALG300-4100 | Filter holders with receiver, distributor : VWR |
| potentiometric sensor chips | manufactured by Yunus and colleagues (ref 16) | ||
| PGSTAT30 Autolab | Metrohm Autolab | discontinued, succesor Autolab PGSTAT302N | |
| digital multimeter, METRAHit 22M | Gossen Metrawatt | discontinued, successor Metrahit Base |
References
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