En Face Vorbereitung der Maus Blutgefäße

Für histopathologische Untersuchungen durch Lichtmikroskopie werden dreidimensionale Stücke biologischer Gewebe routinemäßig für die Paraffin-Einbettung verarbeitet, gefolgt von Schnitt und Färbung. Eine Gewebeprobe, die paraffineingebaut worden ist, kann in allen drei Dimensionen mehrere Millimeter betragen. Jedoch muss es zum Zwecke der Lichtmikroskopie zuerst geschnitten werden, so dass Licht durchlaufen und dann gefärbt werden kann, so dass der dünne Abschnitt genügend Kontrast für die Bildgebung ergibt. Da abgetrennte Proben üblicherweise 5-10 μm dick sind, sieht man nur einen sehr kleinen Bruchteil der gesamten Probe in zwei Dimensionen zu einer Zeit. Es ist möglich, sequentielle Abschnitte zu sammeln und nach der Bildgebung jedes Abschnitts einzeln eine computergestützte Rekonstruktion der 3D-Bilder durchzuführen, aber das ist ein langwieriger Job. Die Histopathologie der Blutgefäße, insbesondere für das Studium der Pathogenese der Atherosklerose, stellt einzigartige Probleme dar. Atherosklerose ist eine fokale Krankheit, die sich entwickeltLokal in Gebieten, in denen gestörter Blutfluss auftritt. Darüber hinaus wird die Krankheit innerhalb der Intima, ein dünnes Gewebe, bestehend aus einer Monoschicht von Endothelzellen und extrazelluläre Matrix, von großen Arterien initiiert. Aus diesen Gründen ist es eine Herausforderung, frühe Läsionen mit geschnittenen Blutgefäßen zu lokalisieren und zu studieren, weil man die Läsion leicht vermissen kann. Auch wenn ein Abschnitt einen kranken Bereich einschließt, sieht man nur einen 5-10 μm-Anteil, der Endothelzellen und andere vaskuläre Wandzellen in den Medien und Adventitia enthält.

Die ganze Aufmachung erlaubt es uns, ein weites Gebiet der Blutgefäßoberfläche zu übersehen, wie die gesamte Aorta von der Aortenwurzel bis hinunter zu den iliaca arterien. Unter Verwendung einer solchen Probe, die mit spezifischen Antikörpern und anderen spezifischen Sonden gefärbt ist, kann man die Lage von Läsionen lokalisieren und auch dort, wo verschiedene molekulare Ereignisse in Endothelzellen in Verbindung mit wi auftretenTh atherogenese wie Veränderungen in der Expression, Lokalisierung und posttranslationalen Modifikationen von Proteinen. Neben der Untersuchung der Atherogenese wird die in En-Face-Präparaten beobachtete endotheliale Zellform als Indikator für das regionale zeitlich gemittelte Blutflussmuster verwendet. Solche Daten sind wichtig für das Studium der Mechanosignierung von Endothelzellen in situ. Zu diesem Zweck sind routinemäßige histologische Querschnittsblutgefäße nicht sinnvoll. Für die Gefäßmedizin und die Biologie ist es daher besonders wichtig, eine Technik zur Herstellung von Gesichtspräparationen von Blutgefäßen zu erwerben, die es ermöglichen, einen weiten Bereich der Gefäßoberfläche sowie die tieferen Untergrundgebiete des Gefäßes zu beobachten.

Wie von Jelev und Surchev ¹ überprüft, haben Gefäßbiologen verschiedene Methoden entwickelt, um die Auskleidung der Blutgefäße zu betrachten. In den 1940er und 1950er Jahren wurden einige geniale Methoden entwickelt. Mit diesen Methoden waren sie In der Lage, die grundlegende Organisation der endothelialen Zellen, die die innere Oberfläche der Blutgefäße Linie zu studieren. Wegen der Art und Weise, wie diese Vorbereitungen hergestellt werden (das sogenannte Hautchen-Verfahren ^{2 , 3 , 4} oder Abziehen der Gefäßoberfläche ⁵ ) und die Art und Weise, wie die Probe gefärbt wurde, war es nicht immer möglich, eine ununterbrochene morphologische zu erhalten Information von der Gefäßoberfläche in die tieferen Bereiche der Blutgefäßwand. Die gesamte Pflanze, die mit der Immunfluoreszenzfärbung kombiniert wurde, erlaubte uns, nicht nur die endotheliale Zellmorphologie und die Proteinexpression und die Lokalisierung in diesen Zellen zu untersuchen, sondern auch solche Untersuchungen an den subendothelialen Bereich der Gefäßwand zu erweitern. Frühe Studien mit Blutgefäß en Gesicht Vorbereitungen gefärbt immunoflurescently begann in den 1980er Jahren erscheinen ^,F "> 7. Mit dem Aufkommen der konfokalen Laserscanning-Mikroskopie und der jüngsten Multiphotonenmikroskopie kann man nun in den immunfluoreszenzgefärbten Gefäßproben sowie im Gefäßnetzwerk bei lebenden Tieren klare, fokussierte Bilder der Blutgefäßwandstruktur erhalten ^{8 , 9 , 10 , 11.} Diese computerbasierten bildgebenden Verfahren erzeugen in-fokussierte optisch geschnittene Bilder, und durch Stapeln solcher Bilder kann man rekonstruierte 3D-Bilder der Gefäßwand und des Gefäßnetzwerks in Geweben erhalten Kann Bilder von einem Abschnitt erzeugen ^, der entlang der Z-Achse des rekonstruierten Bildes ^{12 , 13 gemacht wird} .

In diesem Artikel werden wir eine Methode zur Vorbereitung von En-Face-Präparationen der Mausaorta und der Carotis-Arterie zur Immunfluoreszenz-Färbung veranschaulichen. En Gesicht VorbereitungenKann gemacht werden, auch nachdem diese Gefäße experimentell manipuliert worden sind. Zum Beispiel kann eine Carotis-Arterie teilweise ligiert werden und dann eine En-Gesicht Vorbereitung nach einer solchen Operation gemacht. Aus diesem Grund werden wir auch in diesem Artikel beschreiben, wie wir eine partielle Ligation an der Carotis-Arterie machen. Im Vergleich zu ähnlichen Vorbereitungen von größeren Tieren wie Ratten, Kaninchen und Menschen sind die Mausgefäße klein und zerbrechlicher und erfordern so eine zusätzliche Pflege für die Handhabung während der chirurgischen Isolierung von Gefäßen und deren Herstellung für die Antikörperfärbung und Mikroskopie. Weil das am häufigsten verwendete Tiermodell für die genetische Veränderung die Maus ist, wird es für viele Forscher kritisch, Mausgefäße zu behandeln, ohne sie zu beschädigen. In diesem Manuskript werden wir beschreiben, wie man mit den Maus-Blutgefäßen umgehen kann, wenn man Gesichtsvorbereitungen der Maus-Aorta und der Carotis-Arterie herstellt. Zum Zwecke der Demonstration verwenden wir Wildtyp C57 / b6 Mäuse.

Die Protokolle für die Maus partielle Carotis-Arterien-Ligation und Isolierung der Maus-Aorta und Carotis-Arterie für En-Gesicht Immunfärbung sind von der Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt (IBT 2014-9231).

1. linke partielle Carotis-Arterie-Ligation

1. Bereiten Sie den chirurgischen Raum vor, indem Sie einen 12 Zoll x 14 Zoll Heizkissen auf den Tisch legen und das Pad und die Tischplatte mit einem großen, sauberen chirurgischen Tuch abdecken. Stellen Sie den Arm des Auslegerständers so ein, dass sich das Sichtfeld des Stereomikroskops im Mittelbereich des Heizkissens befindet.
2. Schalten Sie den Heizkissen auf den Tisch ein und stellen Sie den 3-Einstellregler auf den mittleren Heizpegel. Bei dieser Temperatureinstellung beträgt die Oberfläche der Chirurgie (siehe 1.6.1) 38-40 ° C.
   1. Legen Sie einen sauberen Käfig auf ein anderes Heizkissen. Drehen Sie den Heizkissen wie oben. Dieser Käfig wird zur Wiederherstellung nach der Operation verwendet (siehe 1.16) sowie Gehäuse.
   Auf dem chirurgischen Tisch legen Sie einen autoklavierten Sterilisationsbeutel mit Irisschere (1 Paar), Gewebezange (1 Paar), Supergriffpinzette (2 Paar), Federschere (1 Paar), stumpfer Retraktor (1 Paar 2,5 mm breit) , Runde Nadelhalter (1), sterilisierte 6-0 Seidennaht, Baumwollspitzapplikatoren, Mini-Baumwollspitzapplikatoren, Chirurgische Vorhänge und 2 "x 2" Gazeschwämme. Legen Sie auch eine Quetschflasche mit 70% Ethanol und eine andere mit Chlorhexidin chirurgischen scrubon die chirurgische Tabelle.
3. Wiegen Sie eine Maus. Das Körpergewicht wird benötigt, um die entsprechende Menge an Analgesie zu bestimmen, die unmittelbar vor der Operation verabreicht wird.
4. Lege eine Maus in die Induktionskammer.
5. Schalten Sie den Sauerstoffbehälter und den Anästhesieverdampfer ein, um die Maus in der Induktionskammer zu betäuben. Halten Sie das Isofluran-Niveau bei 2%. Es dauert 3-5 Minuten, bevor die Maus aufhört zu bewegen.
   1. Während die Maus anesthe istTized, legen Sie ein kleineres Stück von sterilen chirurgischen drapieren (24 Zoll x 24 Zoll) unter dem Stereomikroskop, um eine chirurgische Oberfläche zu schaffen. Dann legen Sie eine Acryl-Chirurgie (die mit 70% Alkohol gereinigt wurde) auf der drapierten Oberfläche. Die chirurgische Platte sollte also auf dem Heizkissen liegen, aber durch zwei Schichten von chirurgischen Vorhängen getrennt sein.
6. Wenn die Maus in der Induktionskammer aufhört, die Maus auf einen prächirurgischen Vorbereitungsbereich zu bringen und ihre Nase in den mit dem Verdampfer verbundenen Nase-Kegel (2% Isofluran) zu positionieren. Entfernen Sie die Haare um den Zervikalbereich mit einem elektrischen Trimmer oder Haar-Entferner-Lotion. Wir empfehlen Haare entfernen Lotion, weil diese Methode nicht produzieren lose Haare Stücke, die schwer zu entfernen sind aus dem chirurgischen Bereich.
7. Mit der Nase-Kegel an Ort und Stelle, bewegen Sie die Maus auf die chirurgische Tafel.
   1. Tafeln Sie die rechten und linken Vorderpfoten auf die chirurgische Tafel. Tape down beide Hinterbeine togeAuf der rechten Seite der Maus. Dies führt zu einer leichten Drehung des Mauskörpers, so dass die linke Seite des Halsbereichs der Maus besser für eine Operation positioniert wird.
8. Desinfizieren Sie den Schnittbereich mit 70% Alkohol, Chlorhexidin chirurgisches Peeling und wieder mit 70% Alkohol. Bedecken Sie die Maus mit einer sterilisierten chirurgischen Abdeckung, außer für den Zervikalschnitt.
9. Bestätigen Sie mit der Zehe, dass die Maus vollständig anästhesiert wird und geben Sie Analgesie (Caprofen 3-5 mg / kg) über intraperitoneale oder subkutane Injektion.
10. Unter dem Seziermikroskop einen ventralen Mittellinienschnitt um den Zervikalbereich mit einer Skalpell- oder Irisschere machen.
    HINWEIS: Wir verwenden Scheren, weil der Arbeitsabstand des Stereomikroskops begrenzt ist, was es schwierig macht, ein Skalpell zu verwenden.
11. Setzen Sie die linke Arteria carotis (LCCA) frei, indem Sie beiseite schieben und die Speicheldrüsen, die die Blutgefäße auf die linke Seite des a abdecken, neu positionierenNimal.
12. Identifizieren Sie alle Blutgefäße im chirurgischen Bereich ( Abbildung 1 ). Die LCCA verzweigt sich in die linke A. carotis interna (ICA) und die linke A. carotis externa (ECA). Die oberflächliche Schilddrüsenarterie (STA) entsteht aus dem ECA auf der medialen Seite. Die Okzipitalarterie (OA) entsteht meist aus dem ECA, aber bei einigen Mäusen entsteht sie aus dem ICA.
13. Ligate alle Arterien Äste außer der OA mit sterilisierten 6-0 Seide Naht. Um dies zu erreichen, machen Sie die folgenden zwei Ligations.
    1. Entfernen Sie vorsichtig das Bindegewebe um und unterhalb der linken A. carotis interna (ICA). Greifen Sie ein Stück vorgebildete 6-0 Seidennaht (~ 2,5 cm) mit Pinzette und geben Sie es unter der Arterie. Mit einem anderen Paar Pinzette, ziehen Sie die Naht etwa 1/3 seiner Länge und ligieren die Arterie.
    2. Entfernen Sie das Bindegewebe um die linke äußere Carotis-Arterie (ECA) in der gleichen Weise wie oben beschrieben und machen eine Ligation proximal zum linken überlegenen ThyroiD-Arterie (STA) ( Abbildung 1 ). Achten Sie darauf, dass keine Nervenfasern beschädigt werden, die im chirurgischen Bereich laufen.
14. Wenn diese Verpflichtungen gemacht wurden, bringen Sie die Speicheldrüsen in die ursprüngliche Position zurück und hydratisieren das chirurgische Feld, indem sie 2-3 Tropfen steriler Kochsalzlösung platzieren. Schließen Sie die Haut mit 6-0 beschichteten Vicrylnähten.
15. Nach der Operation die Maus in den vorgewärmten Käfig stellen (siehe 1.2.1). Die Maus sollte innerhalb von 5 Minuten aufwachen und anfangen zu laufen. Sobald bestätigt, dass sich die Maus normal verhält, bringen Sie den Käfig in den Tierwohnzimmer.
16. Beobachten Sie die Maus täglich für die ersten 3 Tage der Erholung. Die Maus kann so lange gehalten werden, wie das Experiment unter den verschiedenen Bedingungen erfordert, die das experimentelle Protokoll verlangt. En Gesicht Vorbereitungen können jederzeit nach der Operation gemacht werden.

2. En Gesicht Immunfärbung

1. Euthanasiere eine Maus mit CO ₂ durch Inhalationsüberdosierung.
2. Tape die Maus in einer Rückenlage (Bauch Seite nach oben) Position auf eine Sektion Platte.
3. Exponieren Sie die Bauchhöhle, indem Sie eine Mittellinie mit Irisschere machen.
4. Setzen Sie die Thoraxhöhle aus, indem Sie die Rippen seitlich zum Sternum schneiden.
5. Machen Sie einen Einschnitt in die Hohlvene oder schneiden Sie eine der femoralen Arterien, um Blut zu entwässern.
6. Setzen Sie eine 26-G-Nadel ein, die an einem Schwerkraft-Perfusions-Setup (120 cm Wasserdruck) in den Scheitel des linken Ventrikels angebracht ist, und peritutieren Sie das Kreislaufsystem mit Kochsalzlösung, die Heparin (40 U / ml) enthält. Setzen Sie die Perfusion fort, bis die aus dem Schnitt fließende Kochsalzlösung klar wird.
7. Umschalten des Perfusionssystems von Kochsalzlösung auf die Fixierlösung mit 4% Paraformaldehyd in PBS (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) und Fortsetzung der Perfusierung für 5 weitere min.
8. Ernten Sie die Aorta und beide linke und rechte Carotis-Arterien mit Stumpfschere und Pinzette und legen Sie sie in ein 50 ml konisches Röhrchen mit dem Fixiermittel auf Eis.
2 ).
9. Übertragen Sie jedes Gefäß getrennt auf eine Vertiefung einer 12-Well-Platte, die 0,5 ml einer permeabilisierenden Lösung (0,1% Triton X-100 in PBS) pro Vertiefung enthält. Permeabilisieren Sie die Blutgefäße für 10 min mit Schaukeln bei Raumtemperatur (RT).
10. Kurz mit PBS waschen.
11. Um nicht-spezifische Antikörperbindungsstellen zu blockieren, inkubieren Sie Blutgefäße in 10% normalem Serum aus den Tierarten, in denen die sekundären Antikörper hergestellt wurden, in TTBS (Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS) mit 2,5% Tween 20) für 30 min mit Schaukeln bei RT
12. Inkubieren von Gefäßen mit den primären Antikörpern, die in geeigneter Weise in TTBS mit 10% normalem Serum (wie oben beschrieben) über Nacht mit Kippen bei 4 ° C verdünnt werden. Die EbeneDer Verdünnung muss für jeden Antikörper bestimmt werden.
13. Führen Sie die folgende Kontrollfärbung durch.
    1. Inkubieren von Gefäßen mit TTBS anstelle eines primären Antikörpers, gefolgt von einer Inkubation mit einem sekundären Antikörper.
    2. Inkubieren von Gefäßen mit TTBS, die nicht immunes (oder präimmunes) Serum oder Ig des gleichen Tieres (Spezies) enthalten, in dem primäre Antikörper hergestellt wurden, gefolgt von Inkubation mit einem sekundären Antikörper.
    3. Weglassen Sie die Inkubation mit einem sekundären Antikörper. Diese Kontrollproben müssen in gleicher Weise behandelt werden und gleichzeitig bei der Färbung mit spezifischen Antikörpern durchgeführt werden.
14. Waschen Sie die Blutgefäße 3 mal mit TTBS für jeweils 10 min mit Schaukeln bei RT.
15. Inkubieren mit fluoreszenzmarkierten sekundären Antikörpern, die in geeigneter Weise in TTBS mit 10% normalem Serum (wie oben beschrieben) für 1 h mit Schütteln bei RT verdünnt werden. Die Kernfärbung mit DAPI (4 ', 6-Diamidino-2-phenylindol) kann gleichzeitig durchgeführt werdenT diese Stufe durch Zugabe von 1/5000 Volumen einer DAPI-Stammlösung, die 5 mg / ml DAPI in H ₂ O enthält.
16. 3 mal mit TTBS für jeweils 10 min mit Schaukeln bei RT waschen.
17. Spülen Sie kurz in PBS.
18. Legen Sie einen Tropfen des Anti-Fade-Reagenzes auf ein Deckglas (22 mm x 50 mm) und legen Sie ein Blutgefäß auf das Deckglas mit dem Endothel nach unten.
19. Legen Sie ein Gleitglas (22 mm x 75 mm) auf das Blutgefäß und vermeiden Sie dabei, Blasen zu fangen.
20. Legen Sie die Folie auf ein sauberes Laborwischtuch ( zB Kimwipe) und bedecken Sie die Folie mit zwei Laborlöchern. Legen Sie leicht 3,5 kg Gewicht ( z. B. eine Flasche Wasser auf ein dickes Buch.) Auf der Folie für maximal 5 min, um die En-Face-Blutgefäßprobe zu glätten.
21. Entfernen Sie das Gewicht und wischen Sie überschüssige Lösung aus dem Deckglas ab.
22. Nagellack an den 4 Ecken des Deckglases anbringen, die Rutschen in eine Schiebebox legen, Deckel nach oben legen und bei RT im Dunkeln halten(Oder 4 ° C) über Nacht. Dieser Prozess pflanzt das Gewebe weiter und macht es leichter, die Mikroskopie bei hohen Vergrößerungen durchzuführen.
23. Das Deckglas komplett mit Nagellack abdichten.
24. Führen Sie die Mikroskopie durch, sobald der Nagellack trocken ist.
25. Falls erforderlich, lagern Sie die Folien bei -20 ° C.

Ein typisches En-Face-Immunfluoreszenzbild des Endothels ist in Abbildung 3 dargestellt. Dieses Bild zeigt einen einzigen optischen Abschnitt einer Maus-Aorta in der Nähe der Öffnung einer Intercostal-Arterie (die große dunkle Ei-förmigen Bereich). Die Aorta wurde mit Anti-VE-Cadherin (grün) und Anti-VCAM-1 (vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1) (rot) doppelt gebeizt. Jede endotheliale Zelle wird mit einer grünen linearen Färbung am Adherens-Übergang umrissen. Wegen der geringen Unebenheit der Probe sind einige Adhäsionsübergänge außerhalb dieses optischen Abschnitts. Anti-VCAM-1-Färbung ist stärker bei der Öffnung der Intercostal-Arterie, wo gestörte Blutströmung bekannt ist. Abb. 4 zeigt die Anfärbung der Carotis-Arterien mit Anti-VE-Cadherin (grün), Anti-VCAM-1 (rot) und DAPI (lila). Die linke Carotis-Arterie (LCA) wurde teilweise ligiert, während die rechte Carotis-Arterie (RCA) unberührt war. Die Gefäßproben wurden 1 Tag nach dem Chirurgie und fleckig Beachten Sie erhöhte Anti-VCAM-1-Färbung im ligierten Gefäß. Proben, die immunfluoreszenz mit verschiedenen Antikörpern gefärbt sind, können verwendet werden, um das Expressionsniveau der interessierenden Proteine, das Ausmaß der posttranslationalen Modifikationen von Zielproteinen und natürlich das Muster der Lokalisierung verschiedener Proteine ​​innerhalb von Endothelzellen sowie in anderen Zellen innerhalb der Blutgefäßwand 10 , 11 .

Abbildung 1 : Detaillierte Schiffsanatomie im Mauszervikalbereich. Das Gefäßnetz vor und nach der Dissektion ist links dargestellt. Alle Arterien sind im rechts dargestellten Diagramm gekennzeichnet. Schwarze Linien zeigen Ligation an. Maßstab: 1 Teilung = 1 mm._blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 2: Diagramm, wie Carotis Arterien und Aorta in En Face Vorbereitungen gemacht werden. Punktierte Linien entlang der Gefäßwand zeigen, dass Schnitte gemacht werden, um die Gefäße zu öffnen. Die farbigen Mikrophotographien zeigen die tatsächlichen Vorbereitungen. Maßstab: 1 Teilung = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 3: Ein En-Face- Bild des mit Anti-VE-Cadherin (Green) und Anti-VCAM-1 (Rot) gefärbten Endothels. Ein konfokaler einzelner optischer Abschnitt von Endothelzellen in der Nähe einer Intercostalöffnung istgezeigt. Man beachte, dass die VCAM-1-Expression in Endothelzellen erhöht wird, die sich am Gefäßabzweig befinden, wo der Blutfluss nicht-laminar ist. Das Bild wurde mit einem Objektiv von 60X (NA 1.4, Öl) aufgenommen. Maßstab = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Abbildung 4: En-Gesichtsbilder der linken und rechten Carotis-Arterien, die mit Anti-VE-Cadherin (grün), Anti-VCAM-1 (rot) und DAPI (lila) gefärbt sind. Die linke Carotis-Arterie wurde teilweise ligiert und die richtige Carotis wurde intakt geblieben. Diese Vorbereitungen wurden 24 Stunden nach der Operation gemacht. Eine erhöhte Expression von VCAM-1 auf der ligierten Seite gegenüber dem intakten Gefäß ist offensichtlich. Diese Bilder wurden in der Nähe der Verzweigung der gemeinsamen Carotis-Arterien vonMit einem Laser-Scan-konfokalen Mikroskop mit einem 60X (NA 1.4, Öl) Objektiv Objektiv. Maßstäbe = 20 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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