Ein Verfahren zur Herstellung von Gesichtspräparaten der Kartoffel-Arterie und Aorta der Maus ist beschrieben. Solche Präparate, wenn sie mit spezifischen Antikörpern immunfluoreszenz gefärbt sind, ermöglichen es uns, die Lokalisation von Proteinen und die Identifizierung von Zelltypen innerhalb der gesamten Gefäßwand durch konfokale Mikroskopie zu untersuchen.
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In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Abschnitte von Paraffin eingebetteten Geweben werden routinemäßig für das Studium der Gewebe Histologie und Histopathologie verwendet. Es ist jedoch schwierig zu bestimmen, was die dreidimensionale Gewebemorphologie aus solchen Abschnitten ist. Darüber hinaus dürfen die untersuchten Abschnitte der Gewebe nicht die Region innerhalb des Gewebes enthalten, die für den Zweck der laufenden Studie notwendig ist. Diese letztere Begrenzung behindert histopathologische Untersuchungen von Blutgefäßen, da sich vaskuläre Läsionen fokalisiert entwickeln. Dies erfordert eine Methode, die es uns ermöglicht, eine breite Fläche der Blutgefäßwand von ihrer Oberfläche zu tieferen Regionen zu untersuchen. Ein ganzes Vorfeld der Vorbereitung der Blutgefäße erfüllt diese Anforderung. In diesem Artikel werden wir zeigen, wie man Vorbereitungen der Maus-Aorta und der Carotis-Arterie vorbereitet und sie immunofluoreszierend für konfokale Mikroskopie und andere Arten der fluoreszenzbasierten Bildgebung färbt.
Einleitung
Für histopathologische Untersuchungen durch Lichtmikroskopie werden dreidimensionale Stücke biologischer Gewebe routinemäßig für die Paraffin-Einbettung verarbeitet, gefolgt von Schnitt und Färbung. Eine Gewebeprobe, die paraffineingebaut worden ist, kann in allen drei Dimensionen mehrere Millimeter betragen. Jedoch muss es zum Zwecke der Lichtmikroskopie zuerst geschnitten werden, so dass Licht durchlaufen und dann gefärbt werden kann, so dass der dünne Abschnitt genügend Kontrast für die Bildgebung ergibt. Da abgetrennte Proben üblicherweise 5-10 μm dick sind, sieht man nur einen sehr kleinen Bruchteil der gesamten Probe in zwei Dimensionen zu einer Zeit. Es ist mö....
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Protokoll
Die Protokolle für die Maus partielle Carotis-Arterien-Ligation und Isolierung der Maus-Aorta und Carotis-Arterie für En-Gesicht Immunfärbung sind von der Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt (IBT 2014-9231).
1. linke partielle Carotis-Arterie-Ligation
- Bereiten Sie den chirurgischen Raum vor, indem Sie einen 12 Zoll x 14 Zoll Heizkissen auf den Tisch legen und das Pad und die Tischplatte mit einem großen, sauberen chirurgischen Tuch abdecken. Stellen Sie den Arm des Auslegerständers so ein, dass sich das Sichtfeld des Stereomikroskops im Mittelbereich des Heizkissens befindet.
- Schalten Sie den....
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Ergebnisse
Ein typisches En-Face-Immunfluoreszenzbild des Endothels ist in Abbildung 3 dargestellt. Dieses Bild zeigt einen einzigen optischen Abschnitt einer Maus-Aorta in der Nähe der Öffnung einer Intercostal-Arterie (die große dunkle Ei-förmigen Bereich). Die Aorta wurde mit Anti-VE-Cadherin (grün) und Anti-VCAM-1 (vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1) (rot) doppelt gebeizt. Jede endotheliale Zelle wird mit einer grünen linearen Färbung am Adherens-Übergang umrissen. Wegen der geri.......
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Diskussion
Bei der Handhabung von Maus-Blutgefäßen ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass das Endothel zerbrechlich ist und dass jede übermäßige mechanische Kraft die Endothelzellen beschädigt. Zum Beispiel brechen oder lösen sich Endothelzellen von der Gefäßwand, wenn das Gefäß zu kräftig perfundiert wird, was leicht passieren kann, wenn das Gefäßsystem mit einer handbetriebenen Spritze perfundiert wird.
Um einen konstanten Perfusionsdruck zu erhalten, verwenden wir ein Schwerkraftperfusionssyst.......
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Danksagungen
Die Forschungsaktivitäten der Autoren werden durch Stipendien des Nationalen Instituts für Gesundheit an Dr. Abe (HL-130193, HL-123346, HL-118462, HL-108551) unterstützt.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| 0,9 % Natriumchlorid-Injektionslösung USP 500 mL | Beutel Fisher Scientific | NC9788429 | |
| 12-Well-Platten | Fisher Scientific | 12556005 | |
| 6-0 beschichtete Vicryl-Naht | Ethicon | J833G | |
| AF488 Anti-Ratten-IgG | Life Technologies | A11006 | |
| AF546 Anti-Kaninchen-Anti-Kaninchen IgG | Life Technologies | A11035 | |
| Anti-CD144 (Ve-Cad) | BD Biosciences | BD555289 | |
| Anti-VCAM-1 (H-276) Kaninchen polyklonales IgG | Santa Cruze Biotechnology | Sc-8304 | |
| Aoto Flow System | Braintree Scientific | EZ-AF9000 | |
| Autoklav Wrap. 24 Zoll x 24 Zoll | Cardinal Health | 4024 | |
| Stumpfe Retraktoren, 2,5 mm breit | Fine Science Tools | 18200-10 | |
| Caprofen (Rimadyl) | zoetis | NADA#141-199 | |
| Chlorhexidin-Peeling, 2% | Med-Vet International | RXCHLOR2-PC | |
| Curity Mullschwämme 2 x 2 | Cardinal Health | KC2146 | |
| Elektrisches Heizkissen, 12 x 14 | Fisher Scientific | NC0667724 | |
| Extra feine Graefe Pinzette | Fine Science Tools | 11152-10 | |
| Irisschere | Fine Science Tools | 14090-11 | |
| Mikro-Deckglas 22 mm x 50 mm | VWR | 48393059 | |
| Objektträger | Fisher Scientific | 12-550-18 | |
| normales Ziegenserum | Equitech-Bio | GS05 | |
| Paraformaldehyd-Lösung 4% in PBS | Santa Cruze Biotechnology | SC-281692 | |
| Petrischalen 100 mm x 15 mm | Fisher Wissenschaftliche | FB0875713 | |
| Prolong Gold Antifading Eindeckmittel mit DAPI | Life Technologies | P-36935 | |
| Puritan Corton Tupfer | VWR | 10806-005 | |
| Puritan Mini Aplikatoren mit Wattespitze | VWR | 82004-050 | |
| Nadelhalter mit rundem Griff | Fine Science Tools | 12076-12 | |
| Seidennaht 6/0 | Fine Science Werkzeuge | 18020-60 | |
| Federschere | ROBOZ | RS-5601 | |
| Strabismusschere | Fine Science Tools | 14075-09 | |
| Super Grip Pinzette | Fine Science Tools | 00649-11 | |
| Transparenter Verband | Cardinal Health | TD-26C | |
| Triton X-1000 | Fisher Scientific | AC327371000 |
Referenzen
- Jelev, L., Surchev, L. A novel simple technique for en face endothelial observations using water-soluble media -'thinned-wall' preparations. J Anat. 212 (2), 192-197 (2008).
- Neill, J. F. The effect on venous endothelium of alterations in blood flow through the vessels in vein walls, and the possible relation to thrombosis. Ann Surg....
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Nachdrucke und Genehmigungen
