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Neuroscience

zebrafish Published: April 18, 2017 doi: 10.3791/55507
Automatic Translation
1, 2, 1,2
1Department of Physiology and Biophysics, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC), 2Neuroscience Graduate Program, University of Colorado Anschutz Medical Campus (UCAMC)

Summary

यह पांडुलिपि zebrafish भ्रूण और लार्वा के रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स से electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए तरीके का वर्णन है। तैयारी सीटू न्यूरॉन्स को बनाए रखता है और अक्सर कम से कम विच्छेदन शामिल है। इन विधियों जल्दी लार्वा चरणों के माध्यम से प्रारंभिक विद्युत उत्तेजना अधिग्रहण से, रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स की एक किस्म के electrophysiological अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं।

Abstract

Zebrafish, पहले एक विकासात्मक मॉडल के रूप में पेश किया, कई अन्य क्षेत्रों में लोकप्रियता हासिल की है। तेजी से विकसित जीवों की बड़ी मात्रा के पालन में आसानी, भ्रूण ऑप्टिकल स्पष्टता के साथ संयुक्त, इस मॉडल की प्रारंभिक सम्मोहक विशेषताओं के रूप में कार्य किया। पिछले दो दशकों में, इस मॉडल की सफलता आगे बड़े पैमाने पर म्युटाजेनेसिस स्क्रीन करने के लिए अपने ज़िम्मा द्वारा और transgenesis में आसानी द्वारा चालित किया गया है। अभी हाल ही में जीन-संपादन दृष्टिकोण मॉडल की शक्ति विस्तार किया है।

neurodevelopmental अध्ययन के लिए, zebrafish भ्रूण और लार्वा एक मॉडल है जो करने के लिए कई तरीकों लागू किया जा सकता हैं। यहाँ, हम तरीकों कि न्यूरॉन्स, विद्युत उत्तेजना का एक अनिवार्य संपत्ति के अध्ययन के लिए अनुमति देने पर ध्यान केंद्रित। zebrafish रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स की electrophysiological अध्ययन के लिए हमारी तैयारी पशुचिकित्सा टांका गोंद के उपयोग के एक रिकॉर्डिंग कक्ष के तैयारी सुरक्षित करने के लिए शामिल है। रिकॉर्डिंग के लिए वैकल्पिक तरीकोंzebrafish भ्रूण और लार्वा से एक ठीक टंगस्टन पिन 1, 2, 3, 4, 5 का उपयोग कर सदन के लिए तैयारी की कुर्की शामिल है। एक टंगस्टन पिन सबसे अधिक बार हालांकि यह लार्वा पृष्ठीय साइड 4 माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, एक पार्श्व अभिविन्यास में तैयारी माउंट करने के लिए प्रयोग किया जाता है। टांका गोंद दोनों झुकाव में भ्रूण और लार्वा माउंट करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। गोंद का उपयोग करना, एक न्यूनतम विच्छेदन एक एंजाइमी उपचार के उपयोग के बिना रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स के लिए पहुंच की अनुमति देते हैं, जिससे किसी भी परिणामी क्षति से बचने के किया जा सकता है,। हालांकि, लार्वा के लिए, यह आवश्यक रीढ़ की हड्डी के आसपास के मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के लिए एक संक्षिप्त एंजाइम उपचार लागू करने के लिए है। तरीकों यहाँ वर्णित कई developmentà पर मोटर न्यूरॉन्स, इन्तेर्नयूरोंस, और संवेदी न्यूरॉन्स के आंतरिक बिजली के गुणों का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया हैएल चरण 6, 7, 8, 9।

Introduction

जॉर्ज स्ट्रीइसिंजर Danio rerio का उपयोग करते हैं, आमतौर पर zebrafish के रूप में जाना का बीड़ा उठाया है, हड्डीवाला विकास 10 में आनुवांशिक विश्लेषण के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में। मॉडल सहित कई लाभ प्रदान करता: (1) अपेक्षाकृत सरल और सस्ती पशुपालन; (2) बाह्य निषेचन, जल्द से जल्द विकास के चरणों से भ्रूण के लिए आसान पहुँच की अनुमति देता है; और (3) एक पारदर्शी भ्रूण, की कोशिकाओं, ऊतकों और अंगों प्रत्यक्ष और दोहराया टिप्पणियों की अनुमति के रूप में वे के रूप में।

आगामी दशकों में, कई अग्रिम आगे zebrafish मॉडल की शक्ति में वृद्धि हुई। विशेष रूप से, आगे आनुवंशिक स्क्रीन और पूरे जीनोम अनुक्रमण प्रयासों कई विकास प्रक्रियाओं 11, 12, 13, 14 के लिए म्यूटेशन और महत्वपूर्ण जीनों की पहचान करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई,"> 15, 16। गेटवे क्लोनिंग तरीकों में सहायता दी है ट्रांसजेनिक की दिनचर्या आवेदन दृष्टिकोण 17, 18। जीनोम संपादन में हाल के अग्रिमों प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह (TALENS) द्वारा उदाहरण और क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) -Cas9 न्युक्लिअसिज़, परिवर्तन के लक्षित परिचय के लिए अनुमति देते हैं, साथ ही साथ नॉक-आउट और दस्तक में 19 दृष्टिकोण, 20, 21, 22। संयुक्त, इन तरीकों zebrafish विशिष्ट व्यवहार और कई मानव रोगों अंतर्निहित आनुवंशिक तंत्र के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली मॉडल बनाने 23, 24, 25, 26, 27।

इस काम को विकसित करने पर केंद्रित हैमानसिक विनियमन और neuronal विकास में विद्युत गतिविधि की भूमिका। फोकस रीढ़ की हड्डी है, जिसके लिए zebrafish मॉडल कई लाभ प्रदान करता है पर है। सबसे पहले, यह भ्रूण और लार्वा चरणों में zebrafish तक पहुँचने के लिए अपेक्षाकृत आसान है; इसलिए, एक विकास के चरणों कम न्यूरॉन्स और सरल circuitry 28, 29 है कि के दौरान रीढ़ की हड्डी समारोह अध्ययन कर सकते हैं। इसके अलावा, zebrafish रीढ़ की हड्डी के रूप में प्रतिलेखन की विशेषता और विशिष्ठ पैटर्न द्वारा प्रदर्शन कारकों 30, 31, 32, 33, 34, 35, न्यूरॉन्स, अन्य रीढ़ के समान की एक विविध सेट है।

zebrafish में अध्ययन के बहुमत है कि तंत्र है कि रीढ़ की हड्डी सर्किट के समारोह आबाद को उजागर करने के उद्देश्य से, विशेष रूप सेजो कि हरकत का समर्थन है, जाहिर है लार्वा चरणों 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43 पर ध्यान केंद्रित कर रहे हैं। हालांकि, न्यूरॉन्स कि रीढ़ की हड्डी लोकोमोटिव नेटवर्क के रूप में के कई जल्दी भ्रूण चरणों में उनके भेदभाव आरंभ किया है, ~ 9-10 घंटे के बाद निषेचन (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51। इसे देखते हुए, कैसे समझ रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स की रूपात्मक और बिजली के गुणों पैदा होती है और भ्रूण और लार्वा चरणों के बीच परिवर्तन एक overa के लिए महत्वपूर्ण हैहरकत सर्किट गठन और समारोह के डालूँगा समझ।

विच्छेदन यहाँ वर्णित तरीकों रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स से पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग की अनुमति है और सफलतापूर्वक भ्रूण चरणों (~ 17-48 HPF) और लार्वा चरणों (~ 3-7 दिनों के बाद निषेचन [DPF]) में लागू किया गया है। यह दृष्टिकोण ब्याज की न्यूरॉन्स के लिए पहुँच प्रदान करने के लिए आवश्यक विच्छेदन की मात्रा को सीमित। प्रोटोकॉल है कि पशु चिकित्सक टांका गोंद में zebrafish रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग प्रयोग किया जाता है, न कि एक ठीक टंगस्टन पिन से, रिकॉर्डिंग कक्ष के भ्रूण या लार्वा संलग्न करने के लिए अन्य तरीकों प्रकाशित के बहुमत से अलग है। दो अलग-अलग दृष्टिकोण की उपलब्धता (यानी, टांका गोंद बनाम टंगस्टन पिन) electrophysiological विश्लेषण के लिए zebrafish भ्रूण या लार्वा बढ़ते के लिए वैकल्पिक विकल्पों के साथ शोधकर्ताओं ने अपने विशिष्ट प्रयोगात्मक लक्ष्यों को प्राप्त करने देता है।

सबसे पहले, तक पहुँचने और एक पॉप से ​​रिकॉर्डिंग के लिए प्रक्रियाओं प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स की ulation, Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं, वर्णित हैं। इन न्यूरॉन्स की सेल शरीर पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के भीतर झूठ बोलते हैं। Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं, कई हड्डीवाला प्रजातियों में मौजूद विकास में जल्दी अंतर, और भ्रूण स्पर्श प्रतिक्रिया 6, 44, 47, 48 आबाद।

दूसरा, तक पहुँचने और रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए प्रक्रियाओं विस्तृत कर रहे हैं। Zebrafish रीढ़ की मोटर न्यूरॉन्स न्यूरोजेनेसिस के दो तरंगों के दौरान उत्पन्न होती हैं। पहले जन्मे प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स, gastrulation (~ 9-16 HPF) के अंत में उत्पन्न होती हैं केवल 3-4 प्राथमिक मोटर hemisegment 45, 46, 49 प्रति वर्तमान न्यूरॉन्स के साथ। इसके विपरीत, माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स के बाद में जन्मीं जनसँख्या अधिक संख्या में है और एक लम्बी अवधि के दौरान पैदा होती है, ~ 14 HPF पर शुरू होने वालेएफई "> 45, 50। मध्य ट्रंक क्षेत्रों में माध्यमिक मोटर न्यूरॉन उत्पत्ति ज्यादातर 51 hpf 50 तक पूरा कर लिया गया है। माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स उल्वों में मोटर न्यूरॉन्स के समकक्ष माना जाता है 46। दिलचस्प बात यह है supraspinal न्यूरॉन्स, डोपामाइन के माध्यम से, हरकत को विनियमित प्राथमिक और माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स लार्वा और भ्रूण में माध्यमिक मोटर न्यूरॉन उत्पत्ति और युवा लार्वा 50, 51 में। प्रत्येक कई अलग अलग उपप्रकार प्रत्येक प्राथमिक मोटर न्यूरॉन उप प्रकार परियोजनाओं एक परिधीय अक्षतंतु कि एक विशेषता पेशी समूह innervates, एक टकसाली में जिसके परिणामस्वरूप शामिल।, axonal पथ की पहचान। आम तौर पर, माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स axonal रास्ते पहले से प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स द्वारा स्थापित किया गया, axonal प्रक्षेप पथ के संबंध में पालन करें। इस प्रकार, प्राथमिक और माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स अपवाद के साथ, इसी तरह के हैं कि axonal मोटाई और somata आकार एकप्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स 45 के लिए अधिक से अधिक कर रहे हैं।

तीसरा, इन्तेर्नयूरोंस के कुछ प्रकार से रिकॉर्डिंग के लिए तरीकों पर चर्चा कर रहे हैं। हालांकि, इन मामलों में, अन्य रीढ़ की हड्डी की कोशिकाओं को हटाने की एक सीमित मात्रा में आवश्यकता होती है, और इस तरह रीढ़ की हड्डी Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं या मोटर न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए कम से कम बरकरार है।

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Protocol

(; प्रयोगशाला पशु संसाधन के कार्यालय, कोलोराडो Anschutz विश्वविद्यालय मेडिकल कैम्पस IACUC) सभी पशु प्रक्रियाओं संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. Zebrafish पालन

  1. उठाएँ और एक 10 घंटे अंधेरे / 14 ज प्रकाश चक्र पर और उचित जल उपचार और विनिमय 52 के साथ 28.5 डिग्री सेल्सियस पर वयस्क zebrafish (Danio rerio) बनाए रखें।
  2. भ्रूण मध्यम में 28.5 डिग्री सेल्सियस पर zebrafish भ्रूण / लार्वा उठाएँ जब तक वे वांछित चरण (जैसे, 2 DPF) तक पहुँचते हैं।

2. विच्छेदन सामग्री की तैयारी

  1. Zebrafish विच्छेदन के लिए गोंद की मशीन
    नोट: यह प्रोटोकॉल पशुचिकित्सा टांका गोंद के उपयोग रिकॉर्डिंग कक्ष के तैयारी संलग्न करने के लिए शामिल है। टांका गोंद के सफल उपयोग एक नियंत्रित तरीके से गोंद की छोटी मात्रा के आवेदन की आवश्यकता है। गोंद के रूप में कठोर शुरू होता है के रूप में जल्दएक जलीय वातावरण का सामना करना पड़ता। इसलिए, एक micropipette में गोंद बनाने और उसे एक घर में बने "गोंद मशीन" है कि मुंह से नकारात्मक या सकारात्मक दबाव के आवेदन की अनुमति देता है का उपयोग कर थोड़ी मात्रा देने। गोंद मशीन के मध्य भाग एक गिलास बोर, एक टुकड़ा है कि borosilicate पतली दीवार कांच केशिकाओं (चित्रा 1 ए) युक्त पैकेज में शामिल है है। एक छोर पर, बोर एक मुखपत्र के लिए लचीला ट्यूबिंग का एक टुकड़ा के माध्यम से जुड़ा हुआ है, जबकि दूसरे छोर कांच micropipette (चित्रा 1) आयोजित करता है।
    1. एक गिलास बोर से काले बल्ब निकालें और एक अन्य कांच बोर (चित्रा 1 बी और 1 C) से सफेद रबर एडाप्टर के साथ बदलें।
      नोट: यह डबल एडाप्टर से ढकी कांच बोर एक छोटे, सीधे polypropylene फिटिंग (चित्रा 1 बी, इनसेट) के माध्यम से लचीला ट्यूबिंग का एक टुकड़ा करने के लिए, एक छोर पर एक गिलास micropipette के लिए कनेक्शन की अनुमति देता है और दूसरे छोर पर,।
      2. <li> ~ 38 सेमी की लंबाई के लिए लचीला ट्यूबिंग का एक टुकड़ा काट लें। कांच बोर से कनेक्ट नहीं लचीला टयूबिंग के अंत करने के लिए मुखपत्र (जैसे, एक पीले रंग की 200 μL micropipette टिप) देते हैं।
      नोट: ट्यूबिंग का टुकड़ा काफी देर तक एक चीर-फाड़ दायरे में कांच micropipette के हेरफेर की अनुमति के लिए, जबकि micropipette पीले टिप मुंह (चित्रा 1 डी) में है होना चाहिए।

आकृति 1
चित्र 1: गोंद मशीन। (एसी) एक गिलास बोर एक छोर और अन्य पर कांच micropipette पर लचीला टयूबिंग को जोड़ता है। रबर एडेप्टर दूसरे छोर पर एक गिलास micropipette के लिए, एक छोटे से polypropylene फिटिंग (बी, इनसेट) टयूबिंग के माध्यम से लगाव की अनुमति है और, अंततः। (डी) अंतिम गोंद मशीन एक मुखपत्र है (जैसे, एक plas से बनाया गयाट्यूबिंग के एक छोर पर टिक विंदुक टिप) और अन्य (तीर पर संलग्न micropipette के साथ कांच बोर)।

  1. विच्छेदन / रिकॉर्डिंग कक्ष
    नोट: विच्छेदन कक्ष भी इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग कक्ष के रूप में कार्य करता है। चैम्बर ठीक हो सिलिकॉन elastomer (चित्रा 2 ए) के पूर्व में कटौती टुकड़े का उपयोग कर एक गिलास स्लाइड पर ही बना है।
    1. सिलिकॉन elastomer तैयार करने के लिए, एक 4 पर एक प्लास्टिक शंक्वाकार ट्यूब को आधार और इलाज एजेंट जोड़ें: क्रमश: 1 के अनुपात,।
    2. अच्छी तरह से elastomer आधार और इलाज एजेंट मिलाएं और दो 100 म पेट्रि डिश में मिश्रण डालना। एक पेट्री डिश में <1 मिमी और की एक मोटाई के elastomer अन्य में 2.5 मिमी डालो ~।
    3. सिलिकॉन elastomer ~ 4-5 दिनों के लिए हवा के संपर्क से इलाज करने के लिए अनुमति दें। ठीक elastomer जल्दी ही आवश्यक है, तो 60 डिग्री सेल्सियस पर यह सेते हैं।
    4. निम्न आकारों के लिए ठीक हो सिलिकॉन elastomer के टुकड़े काट लें:
      1. ~ 1 मिमी से-thick ठीक elastomer, एक ~ 3.8 x 6.3 सेमी आयत काट; इस टुकड़े चैम्बर (चित्रा 2 ए) के नीचे के रूप में कार्य करता है। ~ 2.5 मिमी मोटी ठीक हो सिलिकॉन से, एक आयत ~ 3.8 x 6.3 सेमी काटा। बाद आयत से, एक आंतरिक आयत ~ 2.5 एक्स 5 सेमी काट; जिसके परिणामस्वरूप फ्रेम चैम्बर (चित्रा 2 ए) के शीर्ष के रूप में कार्य करता है।
    5. विच्छेदन / रिकॉर्डिंग कक्ष बनाने के लिए, एक गिलास स्लाइड (5 x 7.6 सेंटीमीटर) के शीर्ष पर सीधे पतली सिलिकॉन आयत जगह, सिलिकॉन और गिलास (चित्रा 2 ए) के बीच किसी भी हवाई बुलबुले को दूर करने के लिए सुनिश्चित बना रही है। सिलिकॉन आयत फ्रेम, मोटा elastomer से काट सिलिकॉन की पतली नीचे की परत के शीर्ष पर, रखें।
    6. सत्यापित करें कि सिलिकॉन परतों को एक दूसरे से अच्छी तरह से देते हैं और वहाँ दो परतों (चित्रा 2 ए) के बीच कोई हवाई बुलबुले हैं कि।
    7. उपयोग के बाद, नीचे सिलिकॉन रखना से मोटी आयत सिलिकॉन फ्रेम को हटाने के द्वारा चैम्बर विघटितएर कि गिलास स्लाइड से जुड़ा हुआ है। कुल्ला कम फाहा वाइप के साथ उपयोग करने से पहले और प्रत्येक रिकॉर्डिंग सत्र के बाद और शुष्क DDH 2 हे के साथ सिलिकॉन सतहों।
    8. चैम्बर सूखी स्टोर सिलिकॉन के दो टुकड़ों के बीच कवक विकास को रोकने के।
      नोट: विषाक्त पदार्थों या औषधीय एजेंटों कि सिलिकॉन से आसानी से कुल्ला नहीं हो सकता है उपयोग किया जाता है, तो उन उद्देश्यों के लिए विशिष्ट कक्षों समर्पित करते हैं।

चित्र 2
चित्र 2: इलैक्ट्रोफिजियोलॉजी कक्ष और विच्छेदन उपकरण। (ए) विच्छेदन और electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया चैम्बर एक गिलास स्लाइड जिस पर, ठीक हो सिलिकॉन elastomer के दो टुकड़े रखा जाता है एक दूसरे के ऊपर पर स्तरित एक फ्रेम और एक अच्छी तरह से करने के लिए एक नीचे प्रदान करने के लिए होते हैं। , ~ 2.5 एक्स 5 सेमी, अच्छी तरह के आकार कोशिकी रिकॉर्डिंग के छोटी मात्रा (2-2.5 एमएल) के उपयोग की अनुमति देता हैउपाय। नीचे सिलिकॉन परत zebrafish भ्रूण का उपयोग कर ऊतक चिपकने वाला है कि गिलास का पालन नहीं करता की सुरक्षित स्थिति के लिए अनुमति देता है। (बी) एक गिलास micropipette (ऊपर) विच्छेदन के दौरान गोंद प्रसव के लिए प्रयोग किया जाता है। पतली दीवार कांच ~ 75 सुक्ष्ममापी की एक व्यास के साथ एक टिप बनाने, एक लंबी, पतला अंत कि बाद में कट जाता है बनाने के लिए खींचा जाता है। पतला कांच micropipette गोंद मशीन (चित्रा -1 डी, तीर) और सामने से भरे सक्शन के आवेदन के माध्यम गोंद के साथ के मुक्त अंत से जुड़ी है। अन्य micropipette (नीचे), खींच लिया एक एक पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए इस्तेमाल किया के लिए के रूप में, पश्च मस्तिष्क की transection के लिए और त्वचा को हटाने के लिए प्रयोग किया जाता है। (सी) एक ईमानदार माइक्रोस्कोप के तहत, एक micromanipulator अंतिम विच्छेदन चरणों के लिए micropipette छल किया जाता है। एक गिलास micropipette, बी, नीचे के रूप में, इलेक्ट्रोड धारक (तीर) से जुड़ा हुआ है। स्नायु हटाने एक द्वारा हासिल की हैहवा आउटलेट (तीर) से जुड़े टयूबिंग के माध्यम से चूषण pplying। अपने दूसरे छोर पर, ट्यूबिंग एक पानी निकलने की टोंटी (काला तीर) है कि, इसके दूसरे पक्ष (तारांकन) पर, एक मुखपत्र से जुड़ी ट्यूबिंग है को जोड़ता है।

रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स से पैच-क्लैंप रिकॉर्डिंग के लिए भ्रूण और लार्वा की 3. विच्छेदन

चित्र तीन
चित्र 3: zebrafish रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय विच्छेदन। (एए ') पूर्ववर्तीमस्तिष्क transection (क) एक 2 DPF भ्रूण की, त्वचा भ्रूण (ख) के बाएँ और दाएँ किनारों पर कट जाता है के बाद। एक दूसरा कट, पहले करने के लिए खड़ा है, तो किया जाता है (ग)। इसके बाद, त्वचा एक micropipette का उपयोग, चिमटी हड़पने और दूर त्वचा को खींचने के लिए अनुमति देता है उठाया है। (बी) त्वचा को हटाया पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी को उजागर करता है। काली रेखा व्याख्यान चबूतरे वाला, स्कीn हटा दिया गया है और रीढ़ की हड्डी (तारांकन), मेनिन्जेस के भीतर निहित की सतह, सामने आ रहा है। त्वचा काली रेखा (तीर) को बरकरार दुम बनी हुई है। (सीसी ') गिलास micropipette की नोक मेनिन्जेस पर दबाया जाता है, और तेज, पार्श्व, लघु आंदोलनों मेनिन्जेस छेद करने में किया जाता है। (डीडी 'और ई') एक बार मेनिन्जेस (डीडी ') को भेदा जाता (rostrally दो खंडों में मेनिन्जेस आंसू में ले जाया गया, micropipette उन्नत और ईई) है'। Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स के somata आम तौर पर मेनिन्जेस (तीर) को हटाने पर उभरते हैं। (FG ') एक 7 DPF लार्वा में, मांसपेशियों की परतों रीढ़ की हड्डी के पृष्ठीय पहलू को कवर, Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स के लिए उपयोग में बाधा उत्पन्न। त्वचा को हटाने के बाद, लार्वा 0.05% कोलैजिनेज़ के साथ इलाज किया जाता है। (एफ) 0.05% कोलैजिनेज़ के साथ एक 5 मिनट ऊष्मायन भी कठोर है जिसके परिणामस्वरूपअत्यधिक मांसपेशियों की क्षति में, के रूप में अस्तव्यस्त मांसपेशी (तीर और इनसेट) इसका सबूत। रेखा: (एफ ') अत्यधिक कोलैजिनेज़ उपचार भी Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स (तीर), टीजी (GFP islet2b) में GFP की उनकी अभिव्यक्ति द्वारा यहां से पता चला नुकसान हो सकता है। टीजी (islet2b: GFP) में लाइन, पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि न्यूरॉन्स भी GFP (तीर) व्यक्त करते हैं। 0.05% कोलैजिनेज़ के साथ एक खनन 1 मिनट ऊष्मायन पर्याप्त मांसपेशी (G) loosens जबकि myotome आकृति विज्ञान (तीर और इनसेट) के संरक्षण। (जी ') वर्णक कोशिकाओं सबसे पृष्ठीय मांसपेशियों की परत (तीर) के शीर्ष पर मौजूद हैं। (एच और आई) टीजी (islet2b: GFP) में लाइन, Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स (तीर) और पृष्ठीय रूट नाड़ीग्रन्थि (तीर) 7 DPF पर GFP व्यक्त करने के लिए जारी है। टीजी के विचारों के पृष्ठीय: 2 DPF पर (islet2b GFP) zebrafish भ्रूण (एच) एकघ 7 DPF (आई)। पैनल एक स्केल सलाखों में = 500 सुक्ष्ममापी; BE (पैनल बी में दिखाया गया) सलाखों स्केल 80 सुक्ष्ममापी =; एफ 'और जी' (पैनल एफ में दिखाया गया है) सलाखों स्केल = 200 सुक्ष्ममापी; एच और मैं (पैनल एच में दिखाया गया है) 100 सुक्ष्ममापी स्केल सलाखों =। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

  1. Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग के लिए भ्रूण के विच्छेदन
    1. रिंगर के समाधान के ~ 2-3 एमएल (चित्रा 2A) युक्त एक विच्छेदन कक्ष में एक भ्रूण रखें। सदन के लिए 0.4% tricaine समाधान के जोड़ने ~ 100 μL द्वारा भ्रूण को स्थिर।
    2. एक लंबी, पतली टिप, एक इंजेक्शन micropipette (चित्रा 2 बी, ऊपर) 53 के लिए इसी तरह प्राप्त करने के लिए एक बॉक्स रेशा का उपयोग कर खींचने एक micropipette पर पतली दीवार कांच micropipettes खींच लें।
    3. कांच बोर ओ करने के लिए खींच लिया गिलास micropipette संलग्नगोंद मशीन च। विदारक माइक्रोस्कोप के तहत उपयोग चिमटी गिलास micropipette की नोक को तोड़ने के लिए इतना है कि टिप है ~ 75 सुक्ष्ममापी (चित्रा 2 बी, ऊपर)।
      नोट: टिप आकार इतना बड़ा करने के लिए नकारात्मक दबाव (मुँह चूषण) के आवेदन के माध्यम टिप में गोंद की कुशल लदान करने के लिए किया जाना चाहिए micropipette सामने भरने, लेकिन काफी छोटा सकारात्मक दबाव के माध्यम से गोंद की सटीक आवेदन की अनुमति के लिए ।
    4. मुखपत्र के माध्यम से चूषण लगाने से गोंद की ~ 3-5 μL के साथ कांच micropipette लोड करें। विच्छेदन कक्ष के गोंद से भरे टिप ले आओ।
      नोट: गोंद के साथ micropipette भरने मजबूत चूषण की आवश्यकता है। micropipette कमजोर चूषण के साथ जल्दी से भर जाता है, तो टिप बहुत बड़ी है।
    5. रिकॉर्डिंग चैम्बर (चित्रा 3 ए और 3 ए ') में भ्रूण रखें भ्रूण और युवा लार्वा (≤72 HPF) से रिकॉर्डिंग के लिए, मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के लिए कोई जरूरत नहीं है।
    6. लाओगोंद-लोडेड भ्रूण / लार्वा जबकि मुंह ट्यूब के माध्यम से micropipette को मामूली सकारात्मक दबाव बनाए रखने के सिर के पास micropipette की नोक (जलीय समाधान के प्रवेश को रोकने के लिए)। एक बार जब टिप भ्रूण के सिर के पास है, चैम्बर के तल पर गोंद की एक छोटी बूंद को निष्कासित करने के लिए पर्याप्त सकारात्मक दबाव लागू होते हैं।
      नोट: गोंद जलीय समाधान के साथ संपर्क में एक बार कठोर, तो यह लागू करते हैं और हल्के सकारात्मक दबाव बनाए रखने के रूप में यह विच्छेदन समाधान में रखा गया है के लिए महत्वपूर्ण है।
    7. गोंद की बूंद की ओर भ्रूण / लार्वा स्थानांतरित करने के लिए इतना है कि सिर गोंद के साथ संपर्क में आता है एक विदारक पिन उपकरण का उपयोग करें। सिर पर भ्रूण पृष्ठीय साइड अप और प्रेस अनुकूल बनाएं गोंद के साथ अच्छे संपर्क सुनिश्चित करने।
    8. गोंद धीरे-धीरे कठोर के रूप में, स्थिति फिर से भ्रूण / लार्वा इतना है कि यह नीचे पृष्ठीय साइड अप उदर साइड निहित है, विदारक पिन का उपयोग करें। गोंद की बूंद में विदारक पिन उपकरण डुबकी और अधिक और सिर के पार गोंद के धागे आकर्षितभ्रूण के आगे अपनी स्थिति को सुरक्षित करने के लिए।
      नोट: Tricaine दर, जिस पर गोंद कठोर को गति। गोंद के साथ काम करने के लिए अधिक समय देने के लिए, भ्रूण / लार्वा को स्थिर करने के लिए आवश्यक tricaine की न्यूनतम राशि का उपयोग करें। साथ ही, सख्त दर गोंद के विभिन्न बहुत से भिन्न हो सकते हैं। तदनुसार, जब गोंद का एक नया बैच का उपयोग कर, विच्छेदन के लिए उपयोग करने से पहले सख्त की दर का पता लगाने।
    9. एक बार सिर सुरक्षित रूप से सिलिकॉन से जुड़ा हुआ है और गोंद जम गया है, एक और गिलास micropipette साथ पश्च मस्तिष्क के स्तर पर transection के द्वारा भ्रूण / लार्वा बलिदान (चित्रा 3A- एक और 4A- क)।
      ध्यान दें: पूर्ववर्तीमस्तिष्क transection विधि है कि यहाँ मानवीय पशु बलि के लिए प्रयोग किया जाता है। हालांकि, प्रयोगात्मक लक्ष्यों के आधार पर (जैसे, कल्पित तैराकी के अध्ययन), एक और तरीका जरूरत हो सकती है।
    10. सदन के लिए पूंछ संलग्न करने से पहले, ट्रंक से त्वचा को हटा दें।
      1. उपयोगएक ताजा कांच micropipette (चित्रा 2 बी, नीचे) अल्पज्ञता पूर्ववर्तीमस्तिष्क (चित्रा 3A- ख और 4A- ख) करने की स्थिति दुम पर त्वचा में कई बार कटौती करने के लिए। पियर्स त्वचा अल्पज्ञता पृष्ठीय रूप के लिए ट्रंक के प्रत्येक पक्ष पर rostro-दुम अक्ष के लम्बवत पिपेट ले जाकर घुड़सवार (चित्रा 3A- ख) नमूनों या पार्श्व घुड़सवार नमूनों (चित्रा 4A- ख) के लिए ट्रंक के संपर्क में पक्ष पर।
    11. चिमटी हड़पने के लिए के लिए त्वचा की एक फ्लैप बनाने के लिए, के स्तर पर और लंबवत कदम 3.1.10.1 (चित्रा 3A- ग और 4A- ग) में प्रारंभिक कटौती करने के लिए त्वचा micropipette के साथ कई बार खुरच।
    12. चिमटी का प्रयोग, धीरे-धीरे त्वचा फ्लैप उठाने और त्वचा दुमदारी खींच।
      नोट: यह अक्सर ट्रंक से त्वचा की सम्पूर्णता को हटाने का परिणाम है। हालांकि, यह someti हैआवश्यक एमईएस को दोहराया प्रदर्शन scraping और त्वचा की खींच कर कई वर्गों में त्वचा को हटाने के लिए। कुछ अनुप्रयोगों के लिए, त्वचा के आंशिक हटाने ब्याज (आंकड़े 3B और 4 बी) की रीढ़ की हड्डी क्षेत्रों के लिए पर्याप्त पहुँच अनुमति दे सकता है।
    13. भ्रूण / लार्वा की पूंछ के पास गोंद का एक छोटा सा ड्रॉप वितरित करें। विच्छेदन कक्ष के नीचे करने के लिए पूंछ संलग्न करने के लिए इस गोंद का प्रयोग करें। इस चरण के दौरान, के रूप में गोंद कठोर, यह सुनिश्चित करें कि ट्रंक पृष्ठीय रूप उन्मुख रहता है और है कि यह मजबूती से कक्ष से जुड़ा हुआ है विदारक पिन उपकरण के साथ ट्रंक की स्थिति को समायोजित।
    14. इस प्रारंभिक विच्छेदन के बाद, रिंगर समाधान के साथ बड़े पैमाने पर तैयारी कुल्ला tricaine और मलबे को हटाने के लिए। तैयारी ~ 5 मिनट के लिए आराम करने के लिए अनुमति दें।
    15. कोशिकी रिकॉर्डिंग समाधान के साथ विच्छेदन समाधान बदलें। यदि आवश्यक हो, एक immobilizing एजेंट तैयारी करने के लिए (, α-bungarotoxin [अंतिम conce जोड़ने जैसे।1 माइक्रोन की ntration])।
      नोट: 1 माइक्रोन α-bungarotoxin ~ 30 मिनट के भीतर 1 भ्रूण DPF से 2 immobilizes। पुराने लार्वा के लिए, α-bungarotoxin के एक उच्च एकाग्रता की जरूरत हो सकती। अ-bungarotoxin रिकॉर्डिंग, जो आमतौर पर 1 घंटे की अवधि के भीतर प्रदर्शन कर रहे हैं के दौरान स्नान समाधान में बनाए रखा है। समाधान रिकॉर्डिंग है कि इस तरह के रूप में कोबाल्ट द्विसंयोजक फैटायनों, होते हैं, एक immobilizing एजेंट के अलावा आवश्यकता नहीं है। लंबे समय तक रिकॉर्डिंग अवधि (1 घंटे से अधिक) की आवश्यकता होती है प्रयोगों के लिए, तैयारी 0.5-1 एमएल / मिनट की दर से स्नान समाधान के साथ भरकर रखा जाता है।
    16. एक 40x पानी विसर्जन लंबे समय से काम कर रहे दूरी उद्देश्य के साथ सुसज्जित एक ईमानदार जटिल सूक्ष्मदर्शी का चरण के लिए घुड़सवार भ्रूण के साथ विच्छेदन कक्ष ले जाएँ।
      नोट: यह माइक्रोस्कोप रिग जहां रिकॉर्डिंग प्रदर्शन किया जाएगा का हिस्सा है। रिग भी एक headstage, एक पैच-क्लैंप एम्पलीफायर, एक micromanipulator, और एक डाटा अधिग्रहण / कंप्यूटर प्रणाली (चित्रा 2C के साथ सुसज्जित किया जाना चाहिए)।
    17. Headstage (आंकड़े 2 बी, नीचे और 2C, तीर) के इलेक्ट्रोड धारक पर एक खाली borosilicate मोटी दीवार कांच micropipette माउंट करें। इलेक्ट्रोड धारक (तीर) की हवा आउटलेट से एक छोर पर और एक तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी के लिए दूसरे छोर (चित्रा 2C में ट्यूबिंग संलग्न (~ 90 सेमी: 0.16 सेमी, बाहरी व्यास: 0.32 सेमी, और लंबाई भीतरी व्यास) , काला तीर)।
      1. ट्यूबिंग का एक और टुकड़ा के एक छोर पर एक मुखपत्र प्लेस (~ लंबाई में 60-70 सेमी) और तीन तरह से पानी निकलने की टोंटी को दूसरे छोर (चित्रा 2C, काले तारांकन) पर देते हैं।
        नोट: यह ट्यूबिंग प्रणाली सील गठन के दौरान रिकॉर्डिंग विंदुक के अंदर करने के लिए सकारात्मक और नकारात्मक दबाव के आवेदन के लिए अनुमति देता है।
    18. रीढ़ की हड्डी के सबसे पृष्ठीय भाग को micropipette टिप ले आओ और धीरे मेनिन्जेस बेध। स्विफ्ट के साथ पालन करें, लघु, बग़ल में आंदोलनों शौचालय की ओरसेन मेनिन्जेस (चित्रा -3 सी और 3 सी ')।
    19. बाद micropipette टिप मेनिन्जेस चल गया है, अग्रिम और मेनिन्जेस रीढ़ की हड्डी (चित्रा 3 डी और 3 डी ') से दूर खींच करने के लिए micropipette बढ़ा।
    20. 1 से 2 hemisegments से अधिक अग्रिम Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं (चित्रा 3E और 3E ') को सामने लाने, rostrally micropipette ले जाएँ।
      नोट: केवल कुछ Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं को बेनकाब करने के लिए आवश्यक मेनिन्जेस की न्यूनतम राशि काटना। प्रत्येक रिकॉर्डिंग के बाद, अतिरिक्त विच्छेदन अधिक Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं प्रकट करने के लिए किया जाता है। दोनों भ्रूण और लार्वा में, Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स कभी कभी पैच micropipette के साथ संपर्क पर फट सकता है। अन्य रीढ़ की हड्डी न्यूरॉन्स इस तरह से व्यवहार नहीं करते हुए यह कहा कि इस तरह के उनके mechanosensitivity रूप Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं के अद्वितीय गुणों को प्रतिबिंबित हो सकता है। इस बात का समर्थन, कई समाधान रचनाओं (जैसे, आयनिक घटकों मेंऔर परासारिता) का परीक्षण किया गया है, और कोई भी Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं के इस व्यवहार को रोका है।
  2. Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं से रिकॉर्डिंग के लिए लार्वा के विच्छेदन
    नोट: 7 DPF लार्वा में, पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी के आसपास के मांसपेशी हटाया जाना चाहिए। 3.1.15 को 3.1.1 चरणों का पालन करें एंजाइम के साथ इलाज से पहले (एक लार्वा एक भ्रूण के लिए प्रतिस्थापित के साथ)।
    1. मांसपेशियों को निकालने के लिए 1 मिनट के लिए 0.05% कोलैजिनेज़ साथ लार्वा सेते हैं।
    2. रिंगर समाधान के साथ तैयारी ~ 5 बार धोने से कोलैजिनेज़ निकालें। पूरी तरह से दूर करने के लिए कोलैजिनेज़ कोशिकी समाधान के ~ 5 के साथ rinses का पालन करें।
    3. विच्छेदन के शेष के बाहर ले जाने के रिकॉर्डिंग रिग के माइक्रोस्कोप के मंच पर रिकॉर्डिंग कक्ष बढ़ते के बाद। इलेक्ट्रोड धारक को एक borosilicate मोटी दीवार पैच micropipette (चित्रा 2 बी, नीचे) संलग्न करें और धीरे के नीचे के खिलाफ यह brushing द्वारा micropipette की नोक तोड़सिलिकॉन कक्ष।
    4. मांसपेशी दूर चिढ़ाने और पृष्ठीय रीढ़ की हड्डी का पर्दाफाश करने के थोड़ा टूट micropipette का प्रयोग करें। तैयारी से मांसपेशी फाइबर निकालने के लिए, ट्यूबिंग इलेक्ट्रोड धारक आउटलेट से जोड़कर सक्शन लागू होते हैं। एक मांसपेशी फाइबर की लंबाई के साथ micropipette स्थानांतरित करने के लिए है, जबकि चूषण लागू करने micromanipulator का प्रयोग करें।
      नोट: लक्ष्य पहले micropipette का उपयोग यंत्रवत् मांसपेशियों को ढीला करने के लिए और फिर दूर चूसना करने के लिए और अलग-अलग मांसपेशी फाइबर दूर करने के लिए है। कभी कभी, मांसपेशी को हटाने के दौरान, micropipette suctioned ऊतक के साथ भरा हुआ हो जाता है।
      1. micropipette unclog करने के लिए, कक्ष के नीचे के खिलाफ micropipette ब्रश थोड़ा टिप को तोड़ने, जबकि टयूबिंग के माध्यम से हवा बह रही सामग्री को निकालने के लिए।
        नोट: micropipette टिप के आकार से ज्यादा बड़े हो जाता है, एक नया micropipette जरूरत हो सकती है। micropipette टिप के आकार और अधिक महत्वपूर्ण है जब मांसपेशियों परतों सीएल को हटानेरीढ़ की हड्डी या मेनिन्जेस (छोटे micropipette सुझावों अधिक नियंत्रित कार्य के लिए कुछ) आसपास के झिल्ली को osest।
    5. चरणों में वर्णित के रूप में मेनिन्जेस निकालें 3.1.18-3.1.20 एक नया micropipette (चित्रा 2 बी, नीचे) का उपयोग कर।

चित्रा 4
चित्र 4: zebrafish रीढ़ की हड्डी के पार्श्व विच्छेदन। एक पार्श्व अभिविन्यास में zebrafish भ्रूण बढ़ते मोटर न्यूरॉन्स के लिए उपयोग की सुविधा। मांसपेशियों और मेनिन्जेस के विच्छेदन को हटाने मोटर न्यूरॉन्स का पर्दाफाश करने के एक 40x पानी विसर्जन उद्देश्य के साथ अनुकूलित एक ईमानदार खुर्दबीन के नीचे किया जाता है (चित्रा 2 देखें)। (ए) मोटर न्यूरॉन सेल शरीर में रीढ़ की हड्डी के भीतर पेट और पार्श्व स्थित हैं। भ्रूण कक्ष से जुड़े होते हैं, ताकि उनके पृष्ठीय पक्ष इलेक्ट्रोड धारक सामना करता है।ध्यान दें कि टांका गोंद सफेद दिखाई देता है एक बार यह (तारांकन) कठोर। एक बार जब पूर्ववर्तीमस्तिष्क transected है (क), त्वचा एक साइट पूर्ववर्तीमस्तिष्क एक गिलास micropipette का उपयोग करने के लिए (ख) दुम पर अल्पज्ञता कई बार काटा जाता है। अतिरिक्त सतही कटौती (ग), पहला सेट करने के लिए खड़ा (ख), एक त्वचा टैब कि चिमटी त्वचा को हटाने के लिए प्राप्त कर सकते हैं के रूप में। (बीजी) एक खाली गिलास micropipette, एक छोटी, पतला टिप (चित्रा 2 बी, नीचे) को खींच लिया, इलेक्ट्रोड धारक से जुड़ी है। micropipette बाद ठीक विच्छेदन और मांसपेशियों के ऊतकों को हटाने के लिए micromanipulator का उपयोग चतुराई है। (बी) के गिलास micropipette की नोक पहले धीरे, कक्ष के नीचे के खिलाफ यह brushing एक दांतेदार अंत और एक बड़ा टिप व्यास बनाकर थोड़ा टूट गया है। micropipette मांसपेशी फाइबर की लंबाई के साथ ले जाया गया, जबकि चूषण लागू किया जाता है है। मांसपेशी फाइबर एक परत निकाल दिए जाते हैंएक समय में अंतर्निहित मेनिन्जेस के विघटन को रोकने के लिए। भ्रूण में, सबसे पृष्ठीय मांसपेशी परतों पहले निकाल दिए जाते हैं, के रूप में इन पतले हो जाते हैं। त्वचा अधिक दुम hemisegments (तीर) से न निकले। (सी) एक hemisegment में पेशी के पृष्ठीय आधे हटा दिया गया है (तीर)। (डी) काले लाइनों एक hemisegment मांसपेशी फाइबर से रहित है, बरकरार रीढ़ की हड्डी (तारांकन) को कवर मेनिन्जेस साथ हदबंदी। (ईई ') एक micropipette का प्रयोग, दबाव की स्थिति में मेनिन्जेस लिए आवेदन किया है थोड़ा मोटर न्यूरॉन somata के पृष्ठीय। त्वरित, लघु, micropipette के पार्श्व गति मेनिन्जेस के भेदी के लिए सीसा। (एफएफ ') micropipette पेट उन्नत है, hemisegment के उदर पहलू की ओर, और neuronal ऊतकों से मेनिन्जेस अलग करने के लिए उठाया। (जीजी ') मेनिन्जेस की लंबाई के साथ rostrally micropipette ले जाकर transected कर रहे हैंhemisegment। न्यूरॉन्स तुरंत संपर्क में रीढ़ की हड्डी से उभरने और अब पैच इलेक्ट्रोड (तीर) के लिए उपलब्ध हैं। स्केल सलाखों = (ए) में 500 सुक्ष्ममापी; स्केल सलाखों = बीजी में 100 सुक्ष्ममापी (पैनल बी में दिखाया गया है)।

  1. मोटर न्यूरॉन और interneuron रिकॉर्डिंग के लिए भ्रूण के विच्छेदन
    1. रिंगर के समाधान युक्त एक विच्छेदन कक्ष में भ्रूण रखें और tricaine के साथ भ्रूण को स्थिर, कदम 3.1.1 में के रूप में।
    2. पार्श्व भ्रूण माउंट, इसकी पृष्ठीय पक्ष चैम्बर है कि उपयोगकर्ता के लिए अनुकूल के पक्ष का सामना करना पड़ के साथ (आमतौर पर मनमानी पर निर्भर करता है)। चरणों का पालन करें 3.1.2-3.1.17 और सुनिश्चित करें कि भ्रूण सिलिकॉन (चित्रा 4 ए और 4 ए ') के खिलाफ फ्लैट बनी हुई है।
    3. एक टिप है कि ~ 25 सुक्ष्ममापी स्क्रैप करने के लिए टूट कर दिया गया है के साथ एक borosilicate मोटी दीवार micropipette का उपयोग करने और मांसपेशियों दूर सक्शन और चरणों में वर्णित के रूप में मेनिन्जेस का पर्दाफाश, 3.2.4-3.2.4.1 (चित्रा 4 बी - <strong> 4D)।
    4. एक बार जब मांसपेशी परतों ब्याज (चित्रा 4D) के hemisegment (रों) से हटा दिया जाता है, एक नया एक एक अक्षुण्ण टिप (चित्रा 2 बी, नीचे) है कि के साथ कांच micropipette बदलें। एक पद के लक्ष्य न्यूरॉन्स के लिए पृष्ठीय है कि कम से मेनिन्जेस पंचर। Micromanipulator का प्रयोग, micropipette मेनिन्जेस पर नीचे धक्का और फिर इसे तेजी से आंसू और मेनिन्जेस (चित्रा 4E और 4E ') पार करने के लिए ले जाने के बग़ल में।
    5. मेनिन्जेस फटने पर, अग्रिम और मेनिन्जेस रीढ़ की हड्डी (चित्रा 4F और 4F ') से दूर लिफ्ट करने के लिए micropipette बढ़ा। Hemisegment (चित्रा 4 जी और 4 जी ') की लंबाई के साथ झिल्ली आंसू rostrally micropipette ले जाएँ।
      नोट: Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं और प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए, विच्छेदन मेनिन्जेस immediat से दूर समाशोधन के लिए सीमित हैई लक्ष्य क्षेत्र। इसके विपरीत, इन्तेर्नयूरोंस और माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए, यह आवश्यक रीढ़ की हड्डी के भीतर न्यूरॉन्स कि ब्याज की सेल के लिए उपयोग में बाधा को दूर करने के लिए है। उत्तरार्द्ध मामले में, रीढ़ की हड्डी circuitry की व्यापक विघटन के कारण, पढ़ाई आंतरिक विद्युत झिल्ली गुणों का विश्लेषण करने के लिए सीमित कर रहे हैं।

4. रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स से electrophysiological रिकॉर्डिंग

  1. Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं और मोटर न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए, जब विंदुक समाधान (चित्रा 2 बी, नीचे) के साथ भर borosilicate मोटी दीवार कांच के ~ 3 MΩ एक प्रतिरोध करने के लिए खींच लिया केशिकाओं का उपयोग करें।
    1. ट्यूबिंग स्नान में micropipette विसर्जित करने से पहले इलेक्ट्रोड धारक से जोड़कर धीरे बह द्वारा सकारात्मक दबाव लागू करें।
      ध्यान दें: सकारात्मक दबाव micropipette टिप को अवरुद्ध से मलबे को रोकता है और बंद करने के लिए पी तीन तरह पानी निकलने की टोंटी बदल कर बनाए रखा हैosition। एक बार लक्ष्य न्यूरॉन के पास, सकारात्मक दबाव कोशिका झिल्ली, एक उपयोगी सूचक है कि micropipette काफी निकट मुहर गठन आरंभ करने के लिए है की एक विशिष्ट खरोज का परिणाम देगा।
    2. जबकि मुखपत्र के माध्यम से अतिरिक्त प्रकाश चूषण लागू करने के ओपन पोजीशन के लिए पानी निकलने की टोंटी वाल्व बदल कर सकारात्मक दबाव छोड़ें।
    3. कोशिका झिल्ली और micropipette टिप के बीच एक GΩ सील के गठन के बाद, सक्शन के संक्षिप्त स्पंदन झिल्ली टूटना और एक पूर्ण-कोशिका विन्यास प्राप्त करने के लिए लागू होते हैं।
    4. एक इनपुट प्रतिरोध 500 MΩ और एक पहुँच प्रतिरोध 10 MΩ के साथ एक स्थिर पूर्ण-कोशिका विन्यास की स्थापना, के बाद, या तो वोल्टेज या वर्तमान क्लैंप मोड में रिकॉर्डिंग प्राप्त करते हैं।

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Representative Results

(चित्रा 5 ए और 5 ब) हम सफलतापूर्वक लार्वा DPF 7 के माध्यम से 17 hpf भ्रूण में Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स से दर्ज की गई है। जब Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं दर्ज किया गया, तैयारी पृष्ठीय साइड अप घुड़सवार किया गया था। इस तरह लगाने उनके सतही पृष्ठीय पदों और बड़े सोम आकारों के आधार पर Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं की स्पष्ट पहचान के लिए अनुमति देता है। पहचान अतिरिक्त इन न्यूरॉन्स की टकसाली hyperpolarized आराम झिल्ली क्षमता (चित्रा 5, इनसेट तालिका) 6, 54 से पुष्टि की है। इसके अलावा, प्राथमिक संवेदी न्यूरॉन्स के रूप में, Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स synaptic इनपुट की कमी है। इसलिए, बिजली की उत्तेजना के अभाव में, झिल्ली क्षमता में कोई बदलाव नहीं है, जबकि वर्तमान क्लैंप मोड (चित्रा 5 ब ') में रिकॉर्डिंग होने चाहिए। Rohon-दाढ़ी कोशिकाओं से प्रारंभिक रिकॉर्डिंग के बाद से zebrafish में प्रदर्शन किया गया <sup वर्ग = "xref"> 6, विभिन्न ट्रांसजेनिक लाइनों (जैसे, टीजी (islet2b: GFP), टीजी (NGN: GFP), और टीजी (isletss: GFP)) उत्पन्न हो रही हैं कि इन न्यूरॉन्स में फ्लोरोसेंट संवाददाताओं से व्यक्त करते हैं, आगे की सुविधा उनकी पहचान 55, 56, 57।

चित्रा 5
चित्रा 5: 1 में Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स से पूरे सेल वोल्टेज और वर्तमान-क्लैंप रिकॉर्डिंग और 2 भ्रूण DPF और 7 लार्वा DPF। (ए) जावक का वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग और आवक धाराओं 1- (पतली काली रेखा) में 2- (घने काले लाइन) 7-DPF (ग्रे लाइन) भ्रूण / लार्वा Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स से प्राप्त किया गया है, और। पकड़े संभावित था -80 mV और धाराओं +20 mV के एक depolarizing कदम से हासिल कर रहे थे। (बी) के एकल कार्रवाई क्षमता से संक्षिप्त (1 एमएस) वर्तमान हासिल कर रहे हैंइंजेक्शन (~ 0.35 एनए) 1- (पतली काली रेखा) के Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स के लिए, 2- (घने काले लाइन), और 7-DPF (ग्रे लाइन) भ्रूण / लार्वा। (बी ') बिजली की उत्तेजना के अभाव में, इस तरह के सहज पोस्टअन्तर्ग्रथनी depolarizations के रूप में झिल्ली क्षमता में कोई बदलाव नहीं,, Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स में होते हैं। इनसेट तालिका 1- (n = 21) और 2 (एन = 9) भ्रूण DPF और 7 (n = 7) लार्वा DPF का Rohon-दाढ़ी न्यूरॉन्स से दर्ज की झिल्ली क्षमता आराम के मूल्यों का सारांश है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

ट्रांसजेनिक लाइनों है कि अन्य रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन subtypes के स्पष्ट पहचान की अनुमति भी उपलब्ध हैं। इनमें mnx1 ट्रांसजेनिक लाइन टीजी (mnx1: GFP) जल्दी ही अपने विनिर्देश (~ 14-16 HPF) के बाद रीढ़ की हड्डी में मोटर न्यूरॉन्स के सबसेट में हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) को व्यक्त करता है <sup वर्ग = "xref"> 58, 59। प्रत्येक hemisegment (चित्रा 6A) के भीतर प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स के टकसाली स्थिति, एक साथ mnx1 ट्रांसजेनिक में GFP की अभिव्यक्ति के साथ के कारण, यह विभिन्न प्राथमिक मोटर न्यूरॉन उपप्रकार (चित्रा 6B और 6C) की पहचान करना संभव है। रिकॉर्डिंग इलेक्ट्रोड समाधान में एक फ्लोरोसेंट डाई भी शामिल है, axonal प्रक्षेप पथ के दृश्य के लिए अनुमति देता है, मोटर न्यूरॉन पहचान के अतिरिक्त पुष्टि प्रदान कुछ इन्तेर्नयूरोंस भी टीजी (mnx1: GFP) में GFP व्यक्त के रूप में लाइन। वैकल्पिक रूप से, एक और ट्रांसजेनिक लाइन है कि मोटर न्यूरॉन्स की पहचान की अनुमति देता है ET2 लाइन 60 है।

चित्रा 6
चित्र 6: zebrafish Embry DPF 1 की मोटर न्यूरॉन्स से पूरे सेल वोल्टेज और वर्तमान क्लैंप रिकॉर्डिंगओएस। (ए) एक कार्टून प्राथमिक मोटर न्यूरॉन zebrafish रीढ़ की हड्डी में मौजूद उप-प्रकारों के विशिष्ट आकारिकी संबंधी विशेषताओं को दर्शाया गया है। प्राथमिक मोटर न्यूरॉन्स (या दुम [कैप] यानी, व्याख्यान चबूतरे वाला [ROP], औसत दर्जे [MIP]) 45 एक खंड के भीतर अपने सोमा की स्थिति से पहचाने जाते हैं। इसके अलावा, प्रत्येक उप-प्रकार एक अलग पथ के माध्यम से परिधि के लिए एक अक्षतंतु फैली हुई है। टीजी (mnx1: GFP) के संयुक्त उपयोग लाइन और डाई लेबलिंग टकसाली axonal आर्बर और एक रिकॉर्डिंग के दौरान मोटर न्यूरॉन उप प्रकार की पहचान का पता चलता है। यहाँ प्रस्तुत तरीकों का उपयोग करना, यह एक ही hemisegment भीतर तीन अलग-अलग प्राथमिक मोटर न्यूरॉन उपप्रकार से रिकॉर्ड क्रमानुसार करना संभव है। (बी) वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग दिखाई जाती हैं कि ROP, MIP, और टोपी, सभी से एक भी hemisegment में प्राप्त किया गया। 20 mV के एक वोल्टेज कदम -80 mV की एक होल्डिंग क्षमता से धाराओं को प्रकाश में लाना करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। (सी) वर्तमान क्लैंप आर के दौरानROP, MIP, और टोपी, संक्षिप्त (1 एमएस, ~ 0.4 एनए) से ecordings वर्तमान इंजेक्शन एक संभावित कार्रवाई को गति प्रदान करने के लिए लागू किया गया था। झिल्ली क्षमता mV ~ में आयोजित किया गया -65। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

प्राथमिक और माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स के बीच एक मुख्य अंतर पहले जन्मे न्यूरॉन्स की बड़ी somata है। हालांकि, माध्यमिक मोटर न्यूरॉन उपप्रकार सोमा आकार या स्थिति से पहचाने जाने योग्य नहीं हैं। विशिष्ट माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग के लिए, दो ट्रांसजेनिक लाइनों, टीजी (gata2: GFP) और टीजी (islet1: GFP), पेट और पृष्ठीय रूप पेश एक्सोन क्रमश: 55, 61 के साथ माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया है। हालांकि, एक तिहाई माध्यमिक मोटर न्यूरॉन उप प्रकार zebrafish रीढ़ की हड्डी में मौजूद है, AXO साथकि इस परियोजना पृष्ठीय रूप एनएस और पेट 62। तदनुसार, डाई आकृति विज्ञान के आधार (चित्रा 7A) 8, 9 पर उप-प्रकारों की पहचान करने के रिकॉर्डिंग के दौरान माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स को भरने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता। अक्सर, वोल्टेज क्लैंप (चित्रा 7B, तारांकन) या वर्तमान क्लैंप रिकॉर्डिंग (चित्रा 7C और 7 सी ', तीर) माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स, से के दौरान सहज या synaptic घटनाओं दर्ज हैं।

चित्रा 7
चित्र 7: भ्रूण DPF 2 के माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स से पूरे सेल वोल्टेज और वर्तमान क्लैंप रिकॉर्डिंग। (ए) टीजी (gata2: GFP) में लाइन, दो अलग अलग माध्यमिक मोटर न्यूरॉन उपप्रकार GFP 62 व्यक्त करते हैं। बाईं hemisegment में, एक उदर माध्यमिक मोटर न्यूरॉन(तारांकन और तीर सोम और अक्षतंतु से संकेत मिलता है, क्रमशः)। पड़ोसी hemisegment में राइट (दुम) पर, वहाँ एक उदर / पृष्ठीय माध्यमिक मोटर न्यूरॉन (; तीर दो एक्सोन, एक पेट [नीचे तीर] पेश और अन्य पृष्ठीय रूप [शीर्ष तीर] से संकेत मिलता है तारांकन सोमा को इंगित करता है) है। इन न्यूरॉन्स रिकॉर्डिंग के दौरान एक लाल फ्लोरोसेंट डाई के साथ लेबल रहे थे। उदर / पृष्ठीय माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स की पहचान करने के लिए, यह सुनिश्चित करना है कि विच्छेदन आसन्न दुम hemisegment में पेशी को दूर नहीं करता है, जिससे हानिकारक या पृष्ठीय अक्षतंतु को हटाने के लिए महत्वपूर्ण है। रिकॉर्डिंग के बाद, न्यूरॉन सोमा के रूप में यह तैयारी (ऊपर दाईं ओर तारांकन) से दूर खींच लिया जाता है micropipette के लिए जुड़ा रहता। रंगों का उपयोग करते समय रिकॉर्डिंग के दौरान न्यूरॉन्स को भरने के लिए, डाई अक्सर लीक जबकि इलेक्ट्रोड, रीढ़ की हड्डी और पृष्ठदंड (व्याख्यान चबूतरे वाला [बाएं] hemisegment <में नीचे तारांकन में दिखाई दे रहा है स्नान में एक लाल फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि में जिसके परिणामस्वरूप / Em>)। (बी) वोल्टेज-क्लैंप रिकॉर्डिंग उदर और उदर / पृष्ठीय माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स से प्राप्त किया गया। वोल्टेज कदम (-30 के लिए, -10, 10, 30, +50, +70, +90, और 110 mV) जावक और आवक धाराओं प्राप्त किये। Unclamped कार्रवाई क्षमता / depolarizations रिकॉर्डिंग (तारांकन) में मौजूद हो सकता है। (सी) माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स, संक्षिप्त (1 एमएस) बढ़ाने आयाम की वर्तमान इंजेक्शन से वर्तमान क्लैंप रिकॉर्डिंग के दौरान एक संभावित कार्रवाई (तारांकन) को गति प्रदान करने न्यूरॉन्स के लिए लागू किया गया। (ग ') ~ 0.4-ना वर्तमान इंजेक्शन द्वारा माध्यमिक मोटर न्यूरॉन्स में शुरू हो रहा एकल कार्रवाई की क्षमता के उदाहरण दिखाए जाते हैं। इस स्तर पर, सहज कार्रवाई क्षमता भी (सी और सी ', तीर) मनाया जाता है। (डी) लंबे समय तक (100 एमएस) वर्तमान इंजेक्शन (~ 0.35 एनए) कार्रवाई क्षमता का दोहराव फायरिंग ट्रिगर। झिल्ली क्षमता mV ~ में आयोजित किया गया -65।लोड / 55,507 / 55507fig7large.jpg "target =" _ blank "> यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

तरीकों यहाँ वर्णित रीढ़ की हड्डी के कम से कम विच्छेदन के बाद zebrafish भ्रूण के संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स की बिजली और रूपात्मक लक्षण वर्णन के लिए अनुमति देते हैं। न्यूरॉन्स कम से कम 1 घंटे, समय सीमा इन रिकॉर्डिंग पर लगाया के लिए स्वस्थ रहते हैं। न्यूरॉन्स मानक पूर्ण-कोशिका विन्यास का उपयोग कर दर्ज किया गया है, साथ ही केन्द्रक पैच से के रूप में; बाद विधि अंतरिक्ष क्लैंप मुद्दों है कि आयन धाराओं 9 की एक विस्तृत जैवभौतिक अध्ययन में बाधा कर सकते हैं कम करता है।

एक महत्वपूर्ण चुनौती त्वचा को हटाने के लिए और सीमित विच्छेदन ब्याज की न्यूरॉन्स के लिए पहुँच प्रदान करने के लिए आवश्यक प्रदर्शन करने के लिए आदेश में भ्रूण या कक्ष के लार्वा के फर्म लगाव प्राप्त करने के लिए है। तैयारी भी ठीक से पूर्ण-कोशिका पैच-क्लैंप तरीकों के लिए रिकॉर्डिंग चैम्बर के लिए सुरक्षित किया जाना चाहिए। एक विधि है कि पशु चिकित्सक टांका गोंद के उपयोग के माध्यम से इस चुनौती को पूरा करती है भ्रूण या करने के लिए लार्वा संलग्न करने के लिएविच्छेदन / रिकॉर्डिंग चैम्बर यहाँ वर्णित है, एक दृष्टिकोण (, ड्रोसोफिला जैसे) 63 है कि अन्य मॉडल जीवों के विच्छेदन के लिए इस्तेमाल किया गया है। हमारे दूसरों अनुभव प्रशिक्षण से, हम पाते हैं कि गुरु सबसे महत्वपूर्ण कदम गोंद की थोड़ी मात्रा का नियंत्रित और सटीक वितरण है। यहाँ, एक गोंद मशीन उपकरण है, जो एक उपयोगकर्ता में गोंद लोड करने के लिए या एक micropipette की नोक से यह निष्कासित करने के लिए नकारात्मक और सकारात्मक दबाव लागू करने के लिए अनुमति देता है चर्चा की है। टांका गोंद का उपयोग करना, भ्रूण और लार्वा मजबूती से चैम्बर से जुड़ी और उन्मुख या तो पृष्ठीय साइड ऊपर या पार्श्व जा सकता है। इस तरह, न्यूरॉन्स की एक किस्म के लिए विभिन्न पहुँच विकल्प उपलब्ध हैं। इसके अलावा, कक्ष तल पर सिलिकॉन elastomer की परत 1 मिमी यहाँ निर्दिष्ट, संभावित ऑप्टिकल फायदे प्रदान करने से भी पतली हो सकता है। एक अन्य विधि, और अधिक सामान्यतः एक रिकॉर्डिंग कक्ष के तैयारी संलग्न करने के लिए प्रयोग किया जाता है, ठीक टंगस्टन पिन का उपयोग शामिल है 1 <sup>, 2, 3, 4, 5। जबकि उस तरीकों भिन्न होते हैं, दोनों zebrafish रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स के लिए electrophysiological उपयोग की अनुमति, विकल्प है कि लक्ष्यों और प्रयोग की चुनौतियों के आधार पर चुना जा सकता है के साथ शोधकर्ताओं affording।

Zebrafish तैयारी यहाँ वर्णित भेदभाव के अपने प्रारंभिक चरणों के दौरान सीटू रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स की बिजली और रूपात्मक अध्ययन के लिए अनुमति देता है। रीढ़ की हड्डी में न्यूरॉन्स से रिकॉर्डिंग इन विधियों का उपयोग करके, हम, कई परिवर्तन के सेलुलर प्रभाव में अंतर्दृष्टि प्राप्त की है यहां तक कि lesioned जीन 6, 64, 65 की पहचान करने से पहले।

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Disclosures

लेखकों ने प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की अनुपस्थिति की घोषणा की।

Acknowledgments

इस काम एनआईएच (F32 NS059120 RLM और R01NS25217 और P30NS048154 को ABR को) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore Corning 431096
Syringe filter 0.2 mm Whatman 6780-2502
Tricaine Sigma A-5040 Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt 
α-bugarotoxin Tocris 11032-79-4
Tetrodotoxin Tocris 4368-28-9
Alexa-549 hydrazine salt Molecular Probes A-10438 fluorescent dye
Spin-X centrifuge tube filter Corning 8161
Glass microscope slide Fisher 12-550C
Sylgard silicone elastomer kit Dow Corning 184 silicone elastomer
Petri dishes Falcon 351029
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus 30-0038 inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries)
Borosilicate glass capillaries Drummond Scientific 1-000-1000-100 inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries)
Miniature barbed polypropylene fitting  Cole-Palmer 6365-90
Vetbond tissue adhesive  3M 1469SB
Collagenase XI Sigma C7657
Microelectrode puller Sutter Instruments  Model P-97 
Amplifier Molecular Devices Axopatch 200B
Head stage Molecular Devices CV203BU
Motorized micromanipulator   Sutter Instruments MP-285
Tygon tubing Fisher 14-169-1B ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing)
Electrode holder Molecular Devices 1-HC-U
Pharmaseal Three-Way Stopcocks  Baxter K75
Digitizer Axon Instruments Digidata 1440A
Inverted microscope  Zeiss Axioskop2 FS plus
40X/0.80W Achroplan objective Zeiss
Data acquisition and analysis software  Axon Instruments PClamp 10 - Clampex and Clampfit 
Micropipette puller Sutter Instruments Model P-97
Name Company Catalog Number Comments
Dissection and Recording Solutions (in mM)
All solutions, except the intracellular, are stable for ~2-3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT).
The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20 °C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. 
Dissection/Ringer’s solution 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH)
Pipette (intracellular) recording solution 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH).
Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH).
Alexa-594 hydrazine salt stock solution.  Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~100 µl) and store at -20 °C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution  with a centrifuge tube filter.
Name Company Catalog Number Comments
Immobilizing agents
0.4% ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) Prepare a 0.4% stock solution in 0.2 M Tris, pH 9 (0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris
Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20 °C.
For use, dilute the stock solution ~25 fold in embryo media
250 mM α-bungarotoxin Prepare a 250 mM stock in ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C.
For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM.
1 mM Tetrodotoxin Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C.
For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM.

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zebrafish<em&gt; सीटू</em&gt; रीढ़ की हड्डी रीढ़ की हड्डी में संवेदी और मोटर न्यूरॉन्स से electrophysiological रिकॉर्डिंग के लिए तैयारी
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Moreno, R. L., Josey, M., Ribera, A. … More

Moreno, R. L., Josey, M., Ribera, A. B. Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons. J. Vis. Exp. (122), e55507, doi:10.3791/55507 (2017).

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