Zebrafisch In Situ Spinal Cord Vorbereitung für elektrophysiologische Aufzeichnungen von Spinal Sensory and Motor Neurons

Summary

Dieses Manuskript beschreibt Verfahren zur elektrophysiologischen Aufnahmen von spinalen Neuronen Zebrabärblingembryonen und Larven. Die Herstellung hält Neuronen in situ und beinhaltet oft minimale Dissektion. Diese Verfahren ermöglichen die elektro Untersuchung einer Vielzahl von spinalen Neuronen, von der ersten elektrischen Erregbarkeit Erwerb durch den frühen Larvenstadien.

Abstract

Zebrafisch, zunächst als Entwicklungsmodell eingeführt hat an Popularität gewinnt in vielen anderen Bereichen. Die Leichtigkeit der Aufzucht einer großen Anzahl von sich rasch entwickelnden Organismen, mit der embryonalen optische Klarheit kombiniert, diente als Ausgangs zwingenden Attribute dieses Modells. In den letzten zwei Jahrzehnten hat sich der Erfolg dieses Modells weiter durch seine Ansprechbarkeit auf groß angelegte Mutagenese-Bildschirme und durch die Leichtigkeit der Transgene angetrieben worden. In jüngster Zeit haben Gen-Editing Ansätze, um die Leistung des Modells erweitert.

Für Studien der neurologischen Entwicklung der Larve Zebrafischembryo und liefern ein Modell, an dem mehrere Methoden angewendet werden können. Hier konzentrieren wir uns auf Methoden, die die Studie einer wesentlichen Eigenschaft von Neuronen, elektrische Erregbarkeit ermöglichen. Unsere Vorbereitung für die elektrophysiologische Untersuchung von Zebrabärbling spinalen Neuronen beinhaltet die Verwendung von Tierarzt Naht Kleber, um die Vorbereitung auf eine Aufzeichnungskammer zu sichern. Alternative Methoden zur Aufzeichnungvon Zebrabärbling - Embryonen und Larven betreffen die Befestigung des Präparates an die Kammer eine feine Wolframstift ^{1, 2, 3, 4, 5} verwendet wird . Ein Wolframstift wird am häufigsten verwendet , um die Zubereitung in einer seitlichen Orientierung zu montieren, obwohl sie verwendet wurde Larve dorsale Seite nach oben ⁴ zu montieren. Der Naht Leim verwendet worden Embryonen und Larven in beiden Orientierungen zu montieren. Unter Verwendung des Klebers kann eine minimale Dissektion durchgeführt werden, die den Zugang zu spinalen Neuronen ohne die Verwendung einer enzymatischen Behandlung, um dadurch eventuelle Schäden zu vermeiden. Doch für die Larven, ist es notwendig, eine kurze Enzymbehandlung anzuwenden, um das Muskelgewebe rund um das Rückenmark zu entfernen. Die hier beschriebenen Methoden sind verwendet worden, die intrinsischen elektrischen Eigenschaften von Motorneuronen, Inter und sensorischen Neuronen an mehreren developmenta zu studierenl Stufen ^{6, 7, 8, 9.}

Introduction

George Streisinger Pionier bei der Verwendung von Danio rerio, das gemeinhin als Zebrabärbling bekannt, als Modellsystem für die genetische Analyse von Wirbel Entwicklung ^10. Das Modell bietet mehrere Vorteile, einschließlich: (1) relativ einfach und kostengünstig Tierhaltung; (2) externe Befruchtung, die einen leichten Zugang zu Embryonen von den frühesten Entwicklungsstadien; und (3) ein transparentes Embryo ermöglicht direkte und wiederholte Beobachtungen von Zellen, Geweben und Organen, wie sie bilden.

In den folgenden Jahrzehnten stiegen einige Fortschritte weiter die Leistung des Zebrabärbling-....

Protocol

(; Amt für Labortier Ressourcen, University of Colorado Anschutz Medical Campus IACUC) Alle Tierverfahren wurden von der Institutional Animal Care und Use Committee genehmigt.

1. Zebrabärbling Haltung

1. Erhöhen und adulten Zebrabärbling (Danio rerio) bei 28,5 ° C in einem 10 h Dunkelheit / 14 Stunden Licht - Zyklus und mit einem geeigneten Wasserbehandlung und Austausch ⁵² aufrechtzuerhalten.
2. Heben Zebrabärbling Embryonen / Larven bei 28,5 ° C in Embryomedium , bis sie die gewünschte Stufe (zB 2 dpf) erreichen.

2. Herstellung von Dissection Mater....

Results

Wir haben erfolgreich von Rohon Beard-Neuronen in 17 hpf Embryonen bis 7 dpf Larven (5A und 5B) aufgezeichnet. Wenn Rohon Beard-Zellen aufgenommen wurden, wurde die Zubereitung montiert dorsal-Seite nach oben. Eine solche Montage ermöglicht die eindeutige Identifizierung von Rohon-Beard auf ihrer oberflächlichen dorsalen Positionen und große Größen soma Zellen basieren. Die Identifizierung wird durch das stereotypisch hyperpolarisiertem Ruhemembranpotent.......

Discussion

Die hier beschriebenen Methoden ermöglichen die elektrische und morphologische Charakterisierung von sensorischen und motorischen Neuronen von Zebrabärbling Embryonen nach minimaler Zerlegung des Rückenmarks. Neurone bleibt für mindestens 1 h gesund, die Frist auf diesen Aufnahmen auferlegt. Neurone wurden unter Verwendung der Standard Gesamtzellkonfiguration aufgezeichnet, sowie von nukleierten Patches; Das letztere Verfahren minimiert Raum-clamp - Probleme , die eine detaillierte Untersuchung der biophysikalischen lon.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Vakuumfilter/Vorratsflasche, 0,22 mm Pore	Corning	431096
Spritzenfilter 0,2 mm	Whatman	6780-2502
Tricain	Sigma	A-5040	Ethyl-3-aminobenzoat, Methansulfonat, Salz
α-Bugarotoxin	Tocris	11032-79-4
Tetrodotoxin	Tocris	4368-28-9
Alexa-549 Hydrazinsalz	Molekulare Sonden	A-10438	Fluoreszenzfarbstoff
Spin-X Zentrifugenröhrenfilter	Corning	8161
Glasobjektträger	Fisher	12-550C
Sylgard Silikon Elastomer-Kit	Dow Corning	184	Silikon-Elastomer-Petrischalen
	Falcon	351029
Kapillaren aus Borosilikatglas	Harvard Apparatus	30-0038	Innen- und Außendurchmesser von 0,78 und 1,0 mm (dünnwandige Glaskapillaren)
Kapillaren aus Borosilikatglas	Drummond Scientific	1-000-1000-100	Innen- und Außendurchmesser von 1,13 und 1,55 mm (dickwandige Glaskapillaren)
Miniatur-Stabverschraubung aus Polypropylen mit Widerhaken	Cole-Palmer	6365-90
Vetbond Klebstoff	3M	1469SB
Collagenase XI	Sigma	C7657
Mikroelektrodenabzieher	Sutter Instruments	Modell P-97
Verstärker	Molecular Devices	Axopatch 200B
Kopftisch	Molecular Devices	CV203BU
Motorisierter Mikromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Tygon-Schlauch	Fisher	14-169-1B	ID 1/16 IN, OD 1/8 IN und WALL 1/32 IN (flexible Laborschläuche)
Elektrodenhalter	Molecular Devices	1-HC-U
Pharmaseal Dreiwege-Absperrhähne	Baxter	K75
Digitizer	Axon Instruments	Digidata 1440A
Inverses Mikroskop	Zeiss	Axioskop2 FS plus
40X/0,80W Achroplan Objektiv	Zeiss
Software zur Datenerfassung und -analyse	Axon Instruments		PClamp 10 - Clampex und Clampfit
Mikropipettenabzieher	Sutter Instruments	Modell P-97
Name	Company<	strong>Katalognummer	Comments
Dissektions- und Aufzeichnungslösungen (in mM)
Alle Lösungen, mit Ausnahme der intrazellulären, sind ~2-3 Monate haltbar, wenn sie filtriert (0,22 mm Filterbecher) und bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.
Die intrazelluläre Lösung wird filtriert (0,2 mm Spritzenfilter) und gefroren (-20 &Grad; C) in kleinen Aliquoten, die am Tag der Anwendung einzeln aufgetaut werden.
Sezieren/Klingeln" s Lösung			145 NaCl, 3 KCl, 1,8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7,4 (mit NaOH)
Pipette (intrazelluläre) Aufnahmelösung			135 KCl, 10 EGTA-Säure, 10 HEPES; pH 7,4 (mit KOH).
Bad (extrazellulär) zur Aufzeichnung von Lösung/Spannungs- und Stromzange			125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7,4 (mit NaOH).
Alexa-594 Hydrazinsalz-Stammlösung.			Bereiten Sie einen 13,2 mM Stamm in ddH2O, aliquot (~100 µ l) und bei -20 °C lagern. Zur Verwendung wird die 132-fache Lösung mit Pipettenlösung auf eine Endkonzentration von 100 mM verdünnt. Nach der Verdünnung die Alexa-594 mit Pipettenlösung filtrieren  mit einem Zentrifugenrohrfilter.
Name	Unternehmen	<>Katalognummer	Kommentare
Immobilisierungsmittel
0,4%iges Ethyl-3-aminobenzoat-Methansulfonatsalz (Tricain)			Bereiten Sie eine 0,4%ige Stammlösung in 0,2 M Tris, pH 9 (0,4 g Tricain/100 mL 0,2 M Tris
Den pH-Wert mit NaOH auf 7 einstellen und bei -20 °C lagern.
Zur Verwendung die Stammlösung ~25-fach im Embryomedium verdünnen
250 mM α-Bungarotoxin			Bereiten Sie einen 250 mM Stamm in ddH2O (1 mg/500 mL) vor, bereiten Sie 100 & Mikro vor; L aliquots und sotre bei -20 °C.
Zur Verwendung 2.500-fach mit extrazellulärer Lösung auf eine Endkonzentration von 100 nM verdünnen.
1 mM Tetrodotoxin			Bereiten Sie eine 1 mM Brühe in ddH2O (1 mg/3 mL) vor, bereiten Sie 100 & micro; L aliquots und sotre bei -20 °C.
Zur Verwendung 2.000-fach mit extrazellulärer Lösung auf eine Endkonzentration von 500 nM verdünnen.