Summary
Este manuscrito describe métodos para registros electrofisiológicos de neuronas espinales de embriones de pez cebra y larvas. La preparación mantiene las neuronas in situ y a menudo implica la disección mínimo. Estos métodos permiten para el estudio electrofisiológico de una variedad de neuronas de la médula, de la adquisición inicial de la excitabilidad eléctrica a través de las primeras etapas larvales.
Abstract
El pez cebra, introducido por primera vez como un modelo de desarrollo, han ganado popularidad en muchos otros campos. La facilidad de la cría de un gran número de organismos que se desarrollan rápidamente, combinada con la claridad óptica embrionario, sirvió como atributos de peso iniciales de este modelo. Durante las últimas dos décadas, el éxito de este modelo ha sido impulsado además por su susceptibilidad a las pantallas de mutagénesis a gran escala y por la facilidad de transgénesis. Más recientemente, los enfoques de edición gen haber aumentado la potencia del modelo.
Para los estudios del desarrollo neurológico, el embrión de pez cebra y larva proporcionan un modelo al que se pueden aplicar varios métodos. Aquí, nos centramos en los métodos que permiten el estudio de una propiedad esencial de las neuronas, excitabilidad eléctrica. Nuestra preparación para el estudio electrofisiológico de neuronas de la médula de pez cebra implica el uso de pegamento veterinario de sutura para asegurar la preparación de una cámara de registro. Los métodos alternativos para la grabacióna partir de embriones de pez cebra y larvas implicar la unión de la preparación a la cámara utilizando un alfiler fino de tungsteno 1, 2, 3, 4, 5. Un pasador de tungsteno es la más utilizada para montar la preparación en una orientación lateral, aunque se ha usado para montar larvas dorsal del lado hasta 4. El pegamento de sutura se ha usado para montar embriones y larvas en ambas orientaciones. Usando el pegamento, una disección mínima se puede realizar, permitiendo el acceso a las neuronas espinales sin el uso de un tratamiento enzimático, evitando así cualquier daño resultante. Sin embargo, para las larvas, es necesario aplicar un tratamiento enzimático breve para eliminar el tejido muscular que rodea la médula espinal. Los métodos descritos aquí se han utilizado para estudiar las propiedades eléctricas intrínsecas de las neuronas motoras, interneuronas, y las neuronas sensoriales en varios developmental etapas 6, 7, 8, 9.
Introduction
George Streisinger fue pionera en el uso de Danio rerio, conocido comúnmente como el pez cebra, como un sistema modelo para el análisis genético de desarrollo de los vertebrados 10. El modelo ofrece varias ventajas, incluyendo: (1) relativamente simple y barato cría de animales; (2) fertilización externa, lo que permite un fácil acceso a los embriones de las etapas de desarrollo más tempranas; y (3) un embrión transparente, permitiendo la observación directa y repetidas de células, tejidos y órganos, ya que forman.
En las décadas siguientes, varios avances aumentaron aún más el poder del modelo de pez cebra. En particular, las pantallas adelante genéticos y los esfuerzos de secuenciación de todo el genoma jugaron un papel clave en la identificación de mutaciones y genes críticos para muchos procesos de desarrollo 11, 12, 13, 14,"> 15, métodos de clonación 16. Puerta de enlace han permitido la aplicación rutinaria de transgénicos se aproxima a 17, 18. Los recientes avances en la edición genoma, ejemplificada por la transcripción del tipo activador de (Talens) y agrupados repeticiones intercaladas regularmente cortos palindrómicas (CRISPR) -Cas9 nucleasas, permitir la introducción selectiva de mutaciones, así como knock-out y knock-in se aproxima a 19, 20, 21, 22. combinados, estos métodos hacen que el pez cebra un poderoso modelo para el estudio de los mecanismos genéticos que subyacen a los comportamientos específicos y varias enfermedades humanas 23, 24, 25, 26, 27.
Este trabajo se centra en el desarrollola regulación mental y el papel de la actividad eléctrica en el desarrollo neuronal. La atención se centra en la médula espinal, para el que el modelo de pez cebra ofrece varias ventajas. En primer lugar, es relativamente fácil de acceder pez cebra en estadios embrionario y larval; Por lo tanto, se puede estudiar la función de la médula espinal durante las etapas de desarrollo que tienen menos neuronas y circuitos simples 28, 29. Por otra parte, la médula espinal pez cebra tiene un conjunto diverso de neuronas, similar a otros vertebrados, como se demuestra por los patrones característicos y distintivos de factores de transcripción 30, 31, 32, 33, 34, 35.
La mayoría de los estudios en el pez cebra que tienen como objetivo descubrir los mecanismos que subyacen a la función de los circuitos de la médula espinal, especialmentelos que apoyan la locomoción, se centran comprensiblemente en estadios larvarios 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43. Sin embargo, muchas de las neuronas que forman las redes de locomotoras espinales iniciado su diferenciación en las etapas embrionarias tempranas, ~ 9-10 h después de la fertilización (HPF) 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51. En vista de esto, la comprensión de cómo surgen las propiedades morfológicas y eléctricas de las neuronas espinales y el cambio entre las etapas embrionario y larval es importante para un overacomprensión ll de la formación y la función de circuito locomotor.
Los métodos de disección descritas aquí permiten grabaciones de patch clamp de neuronas de la médula y se han aplicado con éxito en las etapas embrionarias (~ 17-48 HPF) y estadios larvarios (~ 3-7 días después de la fertilización [dpf]). Este enfoque limita la cantidad de disección requerida para proporcionar acceso a las neuronas de interés. El protocolo se diferencia de la mayoría de los otros métodos publicados para la grabación de las neuronas espinales de pez cebra en que pegamento veterinario de sutura se utiliza, en lugar de un pasador de tungsteno bien, para unir el embrión o larva a la cámara de registro. La disponibilidad de dos enfoques diferentes (es decir, cola de sutura contra el pasador de tungsteno) para el montaje de los embriones de pez cebra o larvas para el análisis electrofisiológico proporciona a los investigadores con opciones alternativas para alcanzar sus objetivos experimentales específicas.
En primer lugar, los procedimientos de acceso y grabación en una emergente ulación de las neuronas sensoriales primarias, células Rohon-Barba, se describen. Los cuerpos celulares de estas neuronas se encuentran dentro de la médula espinal dorsal. Existen células Rohon-Barba en numerosas especies de vertebrados, se diferencian en el desarrollo temprano, y subyacen a la respuesta táctil embrionaria 6, 44, 47, 48.
En segundo lugar, los procedimientos de acceso y registro de las neuronas motoras espinales se detallan. surgen de pez cebra neuronas motoras espinales durante dos oleadas de la neurogénesis. Surgen las neuronas motoras primarias nacidos antes-al final de la gastrulación (~ 9-16 hpf), con sólo 3-4 neuronas motoras primaria presentes por hemisegment 45, 46, 49. En contraste, la población nacida después de las neuronas motoras secundarias es más numeroso y se produce durante un período prolongado, a partir de ~ 14 HPFef "> 45, 50. génesis secundaria de neuronas motoras en los segmentos de mediados de tronco se ha completado todo por 51 HPF 50. neuronas motoras secundarias se considera que son la contrapartida de las neuronas motoras en amniotas 46. Curiosamente, las neuronas supraespinales, a través de la dopamina, regulan la locomoción en la larva y el motor secundario génesis neurona en el embrión y larva joven 50, 51. neuronas motoras primarias y secundarias comprenden cada uno varios subtipos diferentes. cada motor primario proyectos subtipo neurona un axón periférico que inerva un grupo muscular característica, lo que resulta en un estereotipo, la identificación de trayectoria axonal. Generalmente, las neuronas motoras secundarias siguen las vías axonales previamente establecidos por las neuronas motoras primarias. por lo tanto, con respecto a las trayectorias axonales, neuronas motoras primarias y secundarias son similares, con la excepción de que el espesor axonal y somata tamaño unare mayor para las neuronas motoras primarias 45.
En tercer lugar, se discuten los métodos para la grabación de algunos tipos de interneuronas. Sin embargo, en estos casos, se requiere una cantidad limitada de la eliminación de otras células de la médula espinal, y por lo tanto la médula espinal es menos intacta que para las grabaciones de células Rohon-Barba o neuronas motoras.
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Protocol
Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional Animal Cuidado y Uso (IACUC; Oficina de Recursos Animales de Laboratorio de la Universidad de Colorado Anschutz Medical Campus).
1. El pez cebra Cría
- Elevar y mantener adultos de pez cebra (Danio rerio) a 28,5 ° C en un ciclo de luz h 10 h de oscuridad / 14 y con el tratamiento de agua adecuado y el intercambio 52.
- Elevar el pez cebra embriones / larvas a 28,5 ° C en medio de embrión hasta que alcanzan la etapa deseada (por ejemplo, 2 dpf).
2. Preparación de la disección Materiales
- Dispensador de pegamento para la disección de pez cebra
NOTA: Este protocolo implica el uso de pegamento veterinario de sutura para unir la preparación a la cámara de registro. El uso exitoso de la cola de sutura requiere la aplicación de pequeñas cantidades de cola de una manera controlada. La cola comienza a endurecerse tan pronto como seencuentros un ambiente acuoso. Por lo tanto, dibujar el pegamento en una micropipeta y entregar pequeñas cantidades utilizando un hecho en casa "dispensador de pegamento" que permite la aplicación de presión negativa o positiva por vía oral. La parte central del dispensador de pegamento es un taladro de vidrio, una pieza que se incluye dentro del paquete que contiene los capilares de vidrio de pared delgada de borosilicato (Figura 1A). En un extremo, el orificio está conectado a través de un trozo de tubo flexible a una boquilla, mientras que el otro extremo tiene la micropipeta de vidrio (figura 1).- Retire la bombilla negro de un taladro de vidrio y reemplazarlo con el adaptador de caucho blanco de otro orificio de vidrio (Figura 1B y 1C).
NOTA: Este orificio de vidrio doble adaptador rematados permite la conexión a una micropipeta de vidrio en un extremo y, en el otro extremo, a una pieza de tubo flexible a través de una pequeña apropiado, polipropileno recta (Figura 1B, recuadro). <li> cortar un trozo de tubo flexible a una longitud de ~ 38 cm. Coloque la boquilla (por ejemplo, una punta de la micropipeta 200 l amarillo) en el extremo del tubo flexible no está conectado al orificio de vidrio.
NOTA: La pieza de tubo debe ser lo suficientemente largo para permitir la manipulación de la micropipeta de vidrio bajo un microscopio de disección, mientras que la punta amarilla micropipeta está en la boca (Figura 1D). - Retire la bombilla negro de un taladro de vidrio y reemplazarlo con el adaptador de caucho blanco de otro orificio de vidrio (Figura 1B y 1C).
Figura 1: dispensador de pegamento. Taladro (AC) Un vaso se conecta a un tubo flexible en un extremo y la micropipeta de vidrio en el otro. Los adaptadores de goma permiten unión a través de un pequeño ajuste de polipropileno (B, recuadro) a la tubería y, finalmente, a una micropipeta de vidrio en el otro extremo. (D) El dispensador de pegamento final tiene una boquilla (por ejemplo, hecho de un plaspunta tic pipeta) en un extremo del tubo y el orificio de vidrio con la micropipeta unido en el otro (punta de flecha).
- Disección / cámara de registro
NOTA: La cámara de disección también sirve como la cámara de registro electrofisiológico. La cámara está formada sobre un portaobjetos de vidrio utilizando piezas pre-cortadas de elastómero de silicona curado (Figura 2A).- Para preparar el elastómero de silicona, añadir la base y el agente de curado a un tubo cónico de plástico a una proporción de 4: 1, respectivamente.
- Mezclar la base de elastómero y el agente de curado a fondo y se vierte la mezcla en dos 100 mm placas de Petri. Verter el elastómero a un espesor de <1 mm en una placa de Petri y ~ 2,5 mm en el otro.
- Deje que el elastómero de silicona se seque por exposición al aire durante ~ 4-5 días. Si se necesita elastómero curado antes, incubar que a 60 ° C.
- Cortar piezas de elastómero de silicona curado a los siguientes tamaños:
- Del ~ 1 mmde espesor elastómero curado, cortar un rectángulo ~ 3,8 x 6,3 cm; esta pieza sirve como la parte inferior de la cámara (Figura 2A). Desde el ~ 2,5 mm de espesor de silicona curado, cortar un rectángulo ~ 3,8 x 6,3 cm. Desde el último rectángulo, cortar un rectángulo interna ~ 2,5 x 5 cm; la trama resultante sirve como la parte superior de la cámara (Figura 2A).
- Para hacer que la cámara de disección / grabación, colocar el rectángulo de silicona delgada directamente en la parte superior de un portaobjetos de vidrio (5 x 7,6 cm), teniendo cuidado de eliminar cualquier burbuja de aire entre la silicona y el cristal (Figura 2A). Coloque el marco del rectángulo de silicona, cortado del elastómero más grueso, en la parte superior de la capa inferior delgada de silicona.
- Compruebe que las capas de silicona se adhieren bien el uno al otro y que no hay burbujas de aire entre las dos capas (Figura 2A).
- Después del uso, desmantelar la cámara mediante la eliminación de la trama de silicona rectángulo grueso de la disposición de silicona inferiorer que está unido al portaobjetos de vidrio. Enjuague las superficies de silicona con ddH 2 O antes de su uso y después de cada sesión de grabación y seco con toallitas de bajo pelusa.
- Almacenar la cámara seca para evitar el crecimiento de hongos entre las dos piezas de silicona.
NOTA: Si se utilizan toxinas o agentes farmacológicos que pueden no enjuagar fácilmente a partir de la silicona, dedicar cámaras específicas para esos fines.
Figura 2: cámara de Electrofisiología y herramientas de disección. (A) La cámara utilizada para las disecciones y registros electrofisiológicos consiste en un portaobjetos de vidrio sobre el que se colocan dos piezas de elastómero de silicona curado, en capas uno encima del otro para proporcionar un bastidor y una parte inferior de un pozo. El tamaño del pozo, ~ 2,5 x 5 cm, permite el uso de volúmenes pequeños (2-2,5 ml) de registro extracelularsolución. La capa de silicona inferior permite un posicionamiento seguro del embrión usando adhesivo de tejido de pez cebra que no se adhiere al vidrio. (B) Una micropipeta de vidrio (arriba) se utiliza para la entrega de pegamento durante la disección. El vidrio de pared delgada se tira para crear un extremo largo, cónico que se corta más tarde, la creación de una punta con un diámetro de ~ 75 m. La micropipeta de vidrio cónico está unido al extremo libre del dispensador de pegamento (Figura 1D, punta de flecha) y el frente llena con pegamento a través de la aplicación de succión. La otra micropipeta (parte inferior), se retiró como para que se utiliza para una grabación de patch-clamp, se utiliza para la transección del cerebro posterior y para la eliminación de la piel. (C) bajo un microscopio vertical, un micromanipulador se utiliza para maniobrar la micropipeta para los pasos finales de disección. Una micropipeta de vidrio, como en B, parte inferior, se une al soporte del electrodo (flecha). eliminación del músculo se consigue mediante unaPLICACIÓN succión a través del tubo conectado a la salida de aire (punta de flecha). En su otro extremo, el tubo se conecta a una llave de paso (punta de flecha negro) que, en su otro lado (asterisco), tiene tubo conectado a una boquilla.
3. La disección de embriones y larvas de patch-clamp grabaciones de Spinal neuronas
Figura 3: la disección dorsal de la médula espinal de pez cebra. (AA') después de la sección posterior del cerebro (a) de un embrión de 2-dpf, la piel se corta en los lados izquierdo y derecho del embrión (b). Un segundo corte, perpendicular a la primera, se lleva a cabo a continuación (c). A continuación, la piel se levanta con una micropipeta, lo que permite unas pinzas para agarrar y tirar lejos la piel. (B) La eliminación de la piel expone la médula espinal dorsal. Rostral a la línea de negro, la estación de esquín se ha eliminado y la superficie de la médula espinal (asterisco), contenida dentro de las meninges, está expuesto. La piel permanece intacta caudal a la línea de negro (flecha). (CC') La punta de la micropipeta de vidrio se presiona en las meninges, y,, movimientos cortos laterales rápidos se lleva a cabo para perforar las meninges. (DD 'y EE') Una vez que las meninges se perforan (DD '), la micropipeta es avanzado y (EE') se trasladaron rostral a rasgar las meninges en dos segmentos. El somas de las neuronas Rohon-Barba típicamente surgen tras la eliminación de las meninges (flecha). (FG') En una larva 7-dpf, capas de músculo cubre la cara dorsal de la médula espinal, lo que dificulta el acceso a las neuronas Rohon-barba. Después de la eliminación de la piel, la larva se trata con 0,05% de colagenasa. (F) una incubación de 5 min con 0,05% de colagenasa es demasiado estrictas, lo que resultaen el daño muscular excesiva, como se evidencia por el músculo deshilachado (flecha y recuadro). (F') de tratamiento excesivo colagenasa también puede dañar las neuronas Rohon-Beard (flecha), revelados aquí por su expresión de GFP en la Tg (islet2b: gfp) línea. En la Tg (islet2b: gfp) de la línea, las neuronas ganglionares de la raíz dorsal también expresan GFP (punta de flecha). Un breve 1 min de incubación con 0,05% de colagenasa suficientemente afloja el músculo (G), mientras que la conservación de la morfología miotoma (flecha y recuadro). Células de pigmento (G') están presentes en la parte superior de la capa de músculo más dorsal (punta de flecha). (H y I) En la Tg (islet2b: gfp) de la línea, las neuronas Rohon-Beard (flechas) y el ganglio de la raíz dorsal (punta de flecha) continúan expresando GFP a 7 dpf. Dorsal vistas de Tg (islet2b: gfp) embriones de pez cebra en 2 dpf (H) unad 7 dpf (I). En el panel de una escala bares = 500 m; SER (que se muestra en el Panel B) Escala bares = 80 m; F 'y G' (que se muestra en el Panel F) Escala bares = 200 m; H e I (que se muestra en el Panel H) Escala bares = 100 m. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
- La disección de embriones para las grabaciones de las células Rohon-Barba
- Colocar un embrión en una cámara de disección que contiene ~ 2-3 ml de solución de Ringer (Figura 2A). Inmovilizar el embrión mediante la adición de ~ 100 l de solución de tricaína 0,4% a la cámara.
- Tire micropipetas de vidrio de pared delgada en una micropipeta extractor utilizando un filamento de cuadro para obtener una punta larga y delgada, similar a una micropipeta de inyección (Figura 2B, parte superior) 53.
- Fije la micropipeta de vidrio tirado a la perforación o de vidriof el dispensador de pegamento. Bajo el microscopio de disección, pinzas de uso para romper la punta de la micropipeta de vidrio de modo que la punta es de ~ 75 m (Figura 2B, parte superior).
NOTA: El tamaño de la punta debe ser lo suficientemente grande para permitir la carga eficiente de la cola en la punta a través de la aplicación de presión negativa (boca de aspiración) para front-llenar la micropipeta, pero lo suficientemente pequeño para permitir que la aplicación precisa de la cola a través de presión positiva . - Cargar la micropipeta de vidrio con ~ 3-5 l de pegamento mediante la aplicación de succión a través de la boquilla. Llevar la punta pegamento lleno a la cámara de disección.
NOTA: Llenar la micropipeta con pegamento requiere una fuerte succión. Si la micropipeta llena rápidamente con succión débil, la punta es demasiado grande. - Coloque el embrión en la cámara de grabación (Figura 3A y 3A'); para las grabaciones de embriones y larvas jóvenes (≤72 HPF), no hay necesidad de quitar el tejido muscular.
- Traerla punta de la micropipeta pegamento cargado cerca de la cabeza del embrión / larva mientras se mantiene una ligera presión positiva a la micropipeta a través del tubo de boca (para evitar la entrada de solución acuosa). Una vez que la punta está cerca de la cabeza del embrión, aplicar suficiente presión positiva para expulsar una pequeña gota de pegamento en la parte inferior de la cámara.
NOTA: El pegamento se endurece una vez en contacto con la solución acuosa, por lo que es importante aplicar y mantener una presión positiva leve ya que se coloca en la solución de disección. - Utilice una herramienta de disección pasador para mover el embrión / larva hacia la gota de pegamento para que la cabeza hace contacto con el pegamento. Oriente el dorsal del lado del embrión y prensa en la cabeza para asegurar un buen contacto con el pegamento.
- A medida que el pegamento se endurece lentamente, utilizar el pasador de disección para volver a la posición del embrión / larva de modo que quede en el lado ventral hacia abajo, del lado dorsal hacia arriba. Sumergir la herramienta pin de disección en la gota de pegamento y dibujar hilos de la cola sobre y a través de la cabezadel embrión para garantizar aún más su posición.
NOTA: Tricaína acelera la velocidad a la que se endurece el pegamento. Para permitir más tiempo para trabajar con el pegamento, utilice la mínima cantidad de tricaína requerida para inmovilizar el embrión / larva. Además, la velocidad de endurecimiento puede variar con diferentes lotes de pegamento. En consecuencia, cuando se utiliza un nuevo lote de pegamento, determinar su velocidad de endurecimiento antes de usarlo para la disección. - Una vez que la cabeza está fijada firmemente a la silicona y el pegamento se haya solidificado, sacrificar el embrión / larva por transección a nivel cerebro posterior con otra micropipeta de vidrio (Figura 3A-A y 4A a).
NOTA: transección Rombencéfalo es el método que se utiliza aquí para el sacrificio humanitario de los animales. Sin embargo, dependiendo de los objetivos experimentales (por ejemplo, el estudio de la natación ficticio), puede ser necesario otro método. - Antes de fijar la cola a la cámara, retirar la piel del tronco.
- Utilizaruna micropipeta de vidrio fresco (Figura 2B, parte inferior) para cortar superficialmente la piel varias veces en una posición caudal a la parte posterior del cerebro (Figura 3A b y 4A-B). Pierce la piel superficialmente moviendo la pipeta perpendicular al eje rostro-caudal en cada lado del tronco para dorsalmente montado (Figura 3A b) muestras o en el lado expuesto del tronco para muestras montadas lateralmente (Figura 4A-B).
- Para crear un colgajo de piel de pinzas para agarrar, raspar la piel varias veces con la micropipeta al nivel de y perpendicularmente al corte inicial en el paso 3.1.10.1 (Figura 3A-C y 4A-C).
- Con unas pinzas, levantar gradualmente el colgajo de piel y tirar de la piel en sentido caudal.
NOTA: Esto a menudo resulta en la eliminación de la totalidad de la piel del tronco. Sin embargo, es sometiMES necesario quitar la piel en varias secciones mediante la realización de reiterado raspado y tirando de la piel. Para algunas aplicaciones, la eliminación parcial de la piel puede permitir un acceso suficiente a los segmentos de la médula espinal de interés (Figuras 3B y 4B). - Entregar una pequeña gota de pegamento cerca de la cola del embrión / larva. Utilice esta pegamento para fijar la cola a la parte inferior de la cámara de disección. Durante este paso, ya que el pegamento se endurece, ajustar la posición del tronco con la herramienta pin de disección para asegurar que el tronco permanece orientada dorsalmente y que está firmemente unida a la cámara.
- Siguiendo esta disección inicial, enjuague la preparación extensamente con solución de Ringer para eliminar tricaína y escombros. Permiten la preparación para descansar durante ~ 5 min.
- Sustituir la solución de disección con una solución de registro extracelular. Si es necesario, añadir un agente de inmovilización a la preparación (por ejemplo., Α-bungarotoxina [conce definitivantration de 1? M]).
NOTA: 1? M α-bungarotoxina inmoviliza 1 a 2 dpf embriones dentro de ~ 30 min. Para larvas mayores, puede ser necesaria una mayor concentración de α-bungarotoxina. a-bungarotoxina se mantiene en la solución del baño durante las grabaciones, que se realizan típicamente dentro de un período de 1 h. soluciones de grabación que contienen cationes divalentes, tales como cobalto, no requieren la adición de un agente de inmovilización. Para los experimentos que requieren períodos de grabación prolongados (más de 1 h), la preparación se perfundió con solución del baño a una velocidad de 0,5-1 ml / min. - Mover la cámara de disección con el embrión montado en la platina de un microscopio compuesto vertical equipado con un 40X de inmersión en agua objetivo-de trabajo de larga distancia.
NOTA: Este microscopio es parte de la plataforma en la que se realizan las grabaciones. La plataforma también debe estar equipado con un cabezal de la platina, un amplificador de patch-clamp, un micromanipulador, y un sistema de adquisición de datos / ordenador (Figura 2C). - Montar una pared gruesa micropipeta de vidrio de borosilicato de vacío en el soporte de electrodo del cabezal de la platina (Figuras 2B, parte inferior y 2C, flecha). Fije el tubo (diámetro interno: 0,16 cm, diámetro exterior: 0,32 cm, y la longitud: ~ 90 cm) en un extremo a la salida de aire del soporte del electrodo (punta de flecha) y en el otro extremo a una llave de paso de tres vías (Figura 2C , punta de flecha negro).
- Coloque una boquilla en un extremo de otra pieza de tubo (~ 60-70 cm de longitud) y adjuntarlo a la llave de tres vías en el otro extremo (Figura 2C, asterisco negro).
NOTA: Este sistema de tubos permite la aplicación de presión positiva y negativa en el interior de la pipeta de grabación durante la formación del sello.
- Coloque una boquilla en un extremo de otra pieza de tubo (~ 60-70 cm de longitud) y adjuntarlo a la llave de tres vías en el otro extremo (Figura 2C, asterisco negro).
- Llevar la punta de la micropipeta para la porción más posterior de la médula espinal y perforar suavemente las meninges. Siga con rapidez, cortos, de lado a los movimientos loosen las meninges (Figura 3C y 3C').
- Después de que la punta de la micropipeta ha atravesado las meninges, avanzar y elevar la micropipeta para tirar de las meninges lejos de la médula espinal (Figura 3D y 3D').
- Mover la micropipeta rostral, avanzando más de 1 a 2 hemisegments para exponer células Rohon-Beard (Figura 3E y 3E').
NOTA: Se diseca la cantidad mínima de meninges requeridos para exponer solamente unas pocas células Rohon-Barba. Después de cada grabación, disección adicional se lleva a cabo para revelar más células Rohon-barba. En ambos embriones y larvas, las neuronas Rohon-Barba ocasionalmente pueden estallar al contacto con la micropipeta parche. Otras neuronas de la médula espinal no se comportan de esta manera, lo que sugiere que esto podría reflejar propiedades únicas de las células Rohon-Barba, tales como su sensibilidad mecánica. En apoyo de esto, varios composiciones en solución (por ejemplo, componentes iónicosy la osmolaridad) se ensayaron, y ninguno ha evitado este comportamiento de las células Rohon-barba.
- La disección de las larvas para las grabaciones de las células Rohon-Barba
NOTA: En 7 larvas dpf, músculo que rodea la médula espinal dorsal debe ser eliminado. Siga los pasos 3.1.1 a 3.1.15 (con una larva sustituido por un embrión) antes del tratamiento con la enzima.- Para eliminar el músculo, incubar la larva con 0,05% de colagenasa durante 1 min.
- Retire la colagenasa enjuagando los de preparación de ~ 5 veces con solución de Ringer. Siga con ~ 5 enjuagues de solución extracelular para eliminar por completo la colagenasa.
- Llevar a cabo el resto de la disección después de montar la cámara de grabación en la platina del microscopio de la plataforma de grabación. Adjuntar un borosilicato de pared gruesa parche micropipeta (Figura 2B, parte inferior) para el soporte del electrodo y romper la punta de la micropipeta mediante cepillado suavemente contra la parte inferior dela cámara de silicona.
- Utilizar la micropipeta ligeramente fracturadas molestar a los músculos de distancia y exponer la médula espinal dorsal. Para eliminar las fibras musculares de la preparación, aplicar succión a través del tubo unido a la salida soporte del electrodo. Utilice el micromanipulador para mover la micropipeta a lo largo de la longitud de una fibra muscular mientras se aplica succión.
NOTA: El objetivo es utilizar primero la micropipeta para aflojar mecánicamente el músculo y luego a succionar y eliminar las fibras musculares individuales. De vez en cuando, durante la eliminación de músculo, la micropipeta se obstruye con el tejido aspirado.- Para destapar la micropipeta, cepillar la micropipeta contra la parte inferior de la cámara, ligeramente romper la punta, mientras que se sopla aire a través del tubo para expulsar el contenido.
NOTA: Si el tamaño de la punta de la micropipeta se hace excesivamente grande, puede ser necesaria una nueva micropipeta. El tamaño de la punta de la micropipeta es más crítica cuando la eliminación de las capas musculares closest a las membranas que rodean la médula espinal o meninges (pequeñas puntas de micropipeta permiten para un trabajo más controlada).
- Para destapar la micropipeta, cepillar la micropipeta contra la parte inferior de la cámara, ligeramente romper la punta, mientras que se sopla aire a través del tubo para expulsar el contenido.
- Retire las meninges como se describe en los pasos 3.1.18-3.1.20 utilizando una nueva micropipeta (Figura 2B, parte inferior).
Figura 4: Disección lateral de la médula espinal de pez cebra. Montaje de embriones de pez cebra en una orientación lateral facilita el acceso a las neuronas motoras. La eliminación del músculo y la disección de las meninges para exponer las neuronas motoras se realiza bajo un microscopio vertical adaptado con un objetivo de inmersión en agua 40X (ver Figura 2). (A) los cuerpos celulares de la neurona motora se encuentran ventral y lateralmente dentro de la médula espinal. Los embriones se adjuntan a la cámara de modo que su lado dorsal se enfrenta al soporte del electrodo.Tenga en cuenta que el pegamento de sutura aparece blanco una vez que se endurece (asteriscos). Una vez se secciona el cerebro posterior (a), la piel se corta superficialmente varias veces en un sitio (b) caudal al cerebro posterior utilizando una micropipeta de vidrio. Cortes adicionales superficiales (c), perpendiculares al primer conjunto (b), formar una lengüeta de la piel que las pinzas pueden agarrar para la eliminación de la piel. (BG) Una micropipeta de vidrio vacío, se retiró a una corta punta, cónico (Figura 2B, parte inferior), se adjunta al soporte de electrodo. La micropipeta es maniobrado utilizando el micromanipulador para la disección fina posterior y la eliminación de tejido muscular. (B) La punta de la micropipeta de vidrio se rompe primero ligeramente cepillando suavemente contra la parte inferior de la cámara, creando un extremo dentado y un diámetro de la punta más grande. La micropipeta es movida a lo largo de la longitud de las fibras musculares mientras se aplica succión. Las fibras musculares se eliminan una capaa la vez para evitar la interrupción de las meninges subyacentes. En los embriones, las capas musculares más dorsales se eliminan primero, ya que estos tienden a ser más delgada. La piel no se elimina de hemisegments caudales más (flecha). (C) La media dorsal del músculo en una hemisegment se ha eliminado (flecha). (D) Las líneas negras demarcan un hemisegment desprovista de fibras musculares, con meninges intactas que recubren la médula espinal (asterisco). (EE') Usando una micropipeta, se aplica presión a las meninges en una posición ligeramente dorsal a somas de las neuronas motoras. Los movimientos rápidos, cortos y laterales de la micropipeta conducen a la perforación de las meninges. (FF') La micropipeta es avanzado ventralmente, hacia la cara ventral de la hemisegment, y levantó para separar las meninges del tejido neuronal. ( 'GG) Meninges se cortaron transversalmente moviendo la micropipeta rostral a lo largo de la longitud de lahemisegment. Las neuronas surgen inmediatamente de la médula espinal expuesta y ahora son accesibles a los electrodos de parche (flecha). Barras de escala = 500 m de (A); Barras de escala = 100 m de BG (que se muestra en el Panel B).
- La disección de embriones para la neurona motora y grabaciones interneuron
- Coloque el embrión en una cámara de disección que contiene la solución de Ringer e inmovilizar el embrión con tricaína, como en el paso 3.1.1.
- Montar el embrión lateralmente, con su lado dorsal orientado hacia el lado de la cámara que es óptimo para el usuario (típicamente depende de lateralidad). Siga los pasos 3.1.2-3.1.17 y asegúrese de que el embrión permanece plana contra la silicona (Figura 4A y 4A').
- Utilice una micropipeta de borosilicato de pared gruesa con una punta que se ha roto a ~ 25 m para raspar y succionar el músculo de distancia y exponer las meninges, como se describe en los pasos 3.2.4-3.2.4.1 (Figura 4B - <strong> 4D).
- Una vez que las capas de músculo se eliminan de la hemisegment (s) de interés (Figura 4D), reemplace la micropipeta de vidrio con una nueva que tiene una punta intacta (Figura 2B, parte inferior). Perforar las meninges en una posición que es dorsal a las neuronas diana. Usando el micromanipulador, empuje la micropipeta hacia abajo sobre las meninges y luego moverla con rapidez de lado a romper y atravesar las meninges (Figura 4E y 4e').
- Tras la ruptura de las meninges, avanzar y elevar la micropipeta para levantar las meninges lejos de la médula espinal (Figura 4F y 4F'). Mover la micropipeta rostral a romper la membrana a lo largo de la longitud de la hemisegment (Figura 4G y 4G').
NOTA: Para grabaciones de células Rohon-barba y neuronas motoras primarias, la disección se limita a la limpieza de las meninges lejos de la immediatregión de destino e. En contraste, para las grabaciones de interneuronas y neuronas motoras secundarias, es necesario para eliminar las neuronas en la médula espinal que impiden el acceso a la célula de interés. En el último caso, debido a la extensa interrupción de la circuitería de la médula espinal, los estudios se limitan al análisis de intrínsecas propiedades de la membrana eléctricos.
4. Registros electrofisiológicos de las neuronas espinales
- Para las grabaciones de las células Rohon-barba y neuronas motoras, utilice borosilicato capilares de vidrio de pared gruesa tirados a una resistencia de ~ 3 mO cuando se llena con la solución de la pipeta (Figura 2B, parte inferior).
- Aplicar presión positiva soplando suavemente a través del tubo unido al soporte del electrodo antes de la inmersión de la micropipeta en el baño.
NOTA: La presión positiva impide que los desechos de la obstrucción de la punta de la micropipeta y se mantiene girando la llave de tres vías a la de pOSICIÓN. Una vez cerca de la neurona diana, la presión positiva se traducirá en una indentación distintivo de la membrana celular, un indicador útil que la micropipeta es lo suficientemente cerca para iniciar la formación del sello. - Liberar la presión positiva girando la válvula de llave de paso a la posición abierta mientras se aplica succión luz adicional a través de la boquilla.
- Después de la formación de un GΩ-sello entre la membrana celular y la punta de la micropipeta, se aplican breves pulsos de aspiración para romper la membrana y lograr una configuración de célula completa.
- Después de establecer una configuración de célula completa estable, con una resistencia de entrada 500 mO y una resistencia de acceso 10 mO, obtener grabaciones en cualquiera de los modos de voltaje o corriente-clamp.
- Aplicar presión positiva soplando suavemente a través del tubo unido al soporte del electrodo antes de la inmersión de la micropipeta en el baño.
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Representative Results
Hemos registrado con éxito de las neuronas Rohon-barba en 17 hpf embriones a través de 7 dpf larvas (Figura 5A y 5B). Cuando se registraron células Rohon-barba, la preparación se monta en el lado dorsal hacia arriba. Dicho montaje permite la identificación inequívoca de células Rohon-Barba sobre la base de sus posiciones dorsal superficial y grandes tamaños soma. La identificación se confirmó adicionalmente por el potencial de membrana en reposo hiperpolarizado estereotipada de estas neuronas (Figura 5, mesa recuadro) 6, 54. Además, como las neuronas sensoriales primarias, las neuronas Rohon-Barba carecen de entrada sináptica. Por lo tanto, en ausencia de estimulación eléctrica, no hay cambios en el potencial de membrana deben ocurrir durante la grabación en el modo actual-clamp (Figura 5B'). Dado que las grabaciones iniciales de células Rohon-Barba en el pez cebra se realizaron <sup class = "xref"> 6, diversas líneas transgénicas (por ejemplo, Tg (islet2b: gfp), Tg (NGN: GFP), y Tg (isletss: gfp)) se han generado que expresan reporteros fluorescentes en estas neuronas, facilitando aún su identificación 55, 56, 57.
Figura 5: voltaje de células completas y corriente-clamp grabaciones de las neuronas Rohon-barba en 1 y 2 dpf embriones y 7 dpf larvas. (A) grabaciones de fijación de voltaje de hacia el exterior y corrientes hacia el interior se obtuvieron de neuronas Rohon-barba en 1- (línea de color negro delgada), 2- (línea gruesa negro), y 7-dpf (línea gris), los embriones / larvas. El potencial de mantenimiento fue -80 mV y las corrientes se provocaron por un paso de despolarización a +20 mV. (B) los potenciales de acción individuales son provocados por breve (1 ms) actualinyecciones (~ 0,35 nA) a las neuronas Rohon-Barba de 1- (línea de color negro delgada), 2- (línea gruesa negro), y 7-dpf (línea gris) embriones / larvas. (B') En ausencia de estimulación eléctrica, no hay cambios en el potencial de membrana, tales como las despolarizaciones postsinápticos espontáneos, se producen en las neuronas Rohon-barba. La tabla de inserción resume los valores de los potenciales de membrana en reposo registrados a partir de neuronas Rohon-Barba de 1- (n = 21) y 2- (n = 9) dpf embriones y 7- (n = 7) dpf larvas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Las líneas transgénicas que permiten la identificación inequívoca de otros subtipos de neuronas espinales están también disponibles. Entre estos, la línea mnx1 transgénico Tg (mnx1: gfp) expresa la proteína fluorescente verde (GFP) en un subconjunto de neuronas motoras espinales poco después de su especificación (~ 14-16 hpf) <sup class = "xref"> 58, 59. Debido a la posición estereotipada de las neuronas motoras primarias dentro de cada hemisegment (Figura 6A), junto con la expresión de GFP en el transgénico mnx1, es posible identificar los diversos subtipos de neuronas motoras primaria (Figura 6B y 6C). La inclusión de un colorante fluorescente en la solución de electrodo de registro permite la visualización de las trayectorias axonales, proporcionando una confirmación adicional de la identidad de las neuronas motoras, ya que algunas interneuronas también expresan GFP en la Tg (mnx1: gfp) línea. Alternativamente, otra línea transgénica que permite la identificación de las neuronas motoras es la línea ET2 60.
Figura 6: voltaje de células completas y corriente-clamp grabaciones de las neuronas motoras de 1 dpf embry pez cebraOS. (A) Una historieta representa las características morfológicas específicas de los subtipos de neuronas motoras primarias presentes en la médula espinal de pez cebra. Neuronas motoras primarias se identifican por la posición de su soma dentro de un segmento (es decir, rostral [Reg], medial [MiP], o caudal [PAC]) 45. Además, cada subtipo se extiende un axón a la periferia a través de un camino distinto. El uso combinado de la Tg (mnx1: gfp) de la línea y el tinte etiquetado revela la cenador axonal estereotipado y la identidad del subtipo de la neurona motora durante una grabación. Utilizando los métodos que aquí se presenta, es posible secuencialmente registro a partir de tres diferentes subtipos de la neurona motora primaria dentro de la misma hemisegment. (B) grabaciones de fijación de voltaje se muestran que se obtuvieron de RoP, MIP, y CaP, todo en un solo hemisegment. Un paso de voltaje a +20 mV se utilizó para provocar corrientes de un potencial de mantenimiento de -80 mV. (C) Durante actual-clamp recordings de RoP, MIP, y CaP, breves (de 1 ms, ~ 0,4 nA) inyecciones actuales se aplicaron a desencadenar un potencial de acción. El potencial de membrana se mantuvo a ~ -65 mV. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Una diferencia principal entre las neuronas motoras primarias y secundarias es la somata mayor de las neuronas nacidos antes. Sin embargo, los subtipos de neuronas motoras secundarias no son identificables por el tamaño o posición soma. Para las grabaciones de las neuronas motoras secundarias específicas, dos líneas transgénicas, Tg (GATA2: gfp) y Tg (Islet1: GFP), se han utilizado para la identificación de las neuronas motoras secundarias con los axones se proyectan ventral y dorsal, respectivamente 55, 61. Sin embargo, un tercer subtipo de la neurona motora secundario está presente en la médula espinal pez cebra, con axons que dorsal y ventralmente proyecto 62. De acuerdo con ello, el tinte se puede utilizar para llenar las neuronas motoras secundarias durante las grabaciones para identificar subtipos sobre la base de la morfología (Figura 7A) 8, 9. A menudo, durante de fijación de voltaje (Figura 7B, asteriscos) o grabaciones de corriente-clamp (Figura 7C y 7C', puntas de flecha) de las neuronas motoras secundarias, se registran eventos espontáneos o sinápticas.
Figura 7: voltaje de células completas y corriente-clamp grabaciones de las neuronas motoras secundarias de 2 dpf embriones. (A) En la Tg (GATA2: GFP) de fondo, dos subtipos de neuronas motoras secundaria diferentes expresan GFP 62. En el hemisegment izquierda, una ventral de la neurona motora secundaria(Asterisco y la flecha indican soma y axón, respectivamente). En el hemisegment vecino, a la derecha (caudal), hay una ventral / dorsal neurona motor secundario (asterisco indica soma; flechas indican los dos axones, una que se proyecta ventralmente [flecha inferior] y la otra dorsalmente [flecha superior]). Estas neuronas se marcaron con un colorante fluorescente de color rojo durante las grabaciones. Para identificar ventral / dorsal neuronas motoras secundarias, es crítico para asegurar que la disección no elimina músculo en el hemisegment caudal adyacente, de ese modo dañando o eliminando el axón dorsal. Después de la grabación, el soma de las neuronas permanece unido a la micropipeta, ya que se separó de la preparación (asterisco superior derecha). Cuando el uso de tintes para llenar las neuronas durante las grabaciones, el colorante a menudo se fuga mientras que el electrodo está en el baño, lo que resulta en un fondo fluorescente de color rojo visible en la médula espinal y la notocorda (asterisco inferior en rostral [left] hemisegment < / Em>). (B) grabaciones de fijación de voltaje se obtuvieron de ventral y ventral / dorsal neuronas motoras secundarias. pasos de voltaje (hasta -30, -10, +10, +30, +50, +70, +90 y +110 mV) provocaron hacia el exterior y corrientes hacia el interior. Los potenciales de acción Desblocado / despolarizaciones pueden estar presentes en las grabaciones (asteriscos). (C) durante las grabaciones de corriente-clamp de neuronas motoras secundarias, breves (1 ms) inyecciones actuales de aumento de la amplitud se aplicaron a las neuronas para desencadenar un potencial de acción (asteriscos). (C') Ejemplos de potenciales de acción individuales desencadenados en las neuronas motoras secundarias por ~ 0,4-na inyecciones actual se muestran. En esta etapa, los potenciales de acción espontáneos también se observan (C y C', puntas de flecha). (D) prolongado (100 ms) inyecciones de corriente (~ 0,35 nA) a desencadenar la descarga repetitiva de potenciales de acción. El potencial de membrana se mantuvo a ~ -65 mV.carga / 55507 / 55507fig7large.jpg" target = '_ blank'> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los métodos descritos aquí permiten la caracterización eléctrica y morfológica de las neuronas sensoriales y motoras de embriones de pez cebra después de la disección mínima de la médula espinal. Las neuronas permanecen sanos durante al menos 1 h, el límite de tiempo impuesto en estas grabaciones. Las neuronas han sido registrados utilizando la configuración de célula completa estándar, así como de parches nucleadas; el último método minimiza los problemas de espacio-clamp que se opone a que un estudio biofísico detallada de las corrientes de iones 9.
Un reto importante es conseguir la firme adhesión del embrión o larva a la cámara con el fin de quitar la piel y para llevar a cabo la disección limitada requerida para proporcionar acceso a las neuronas de interés. La preparación también necesita ser asegurado correctamente a la cámara de registro para los métodos de patch-clamp de células completas. Un método que cumpla este reto mediante el uso de pegamento veterinario de sutura para fijar el embrión o larva ala cámara de disección / grabación se describe aquí, un enfoque que se ha utilizado para la disección de otros organismos modelo (por ejemplo, Drosophila) 63. Desde nuestra experiencia entrenando a otros, nos encontramos con que el paso más crítico de dominar es la entrega controlada y precisa de pequeñas cantidades de pegamento. Aquí, se discute un dispositivo dispensador de pegamento que permite a un usuario aplicar presión negativa y positiva para cargar pegamento en o para expulsarlo desde la punta de una micropipeta. Usando el pegamento de sutura, los embriones y larvas pueden estar firmemente unidos a la cámara y orientados ya sea del lado dorsal hacia arriba o lateralmente. De esta manera, diferentes opciones de acceso para una variedad de neuronas están disponibles. También, la capa de elastómero de silicona en el fondo de la cámara puede ser incluso más delgado que los 1 mm especificados aquí, proporcionando ventajas potenciales ópticas. Otro método, más comúnmente utilizado para fijar la preparación a una cámara de registro, implica el uso de pasadores de tungsteno finas 1 <sup>, 2, 3, 4, 5. Mientras que los métodos son diferentes, ambos permiten el acceso a las neuronas espinales electrofisiológico de pez cebra, proporcionando a los investigadores las opciones que se pueden seleccionar en base a los objetivos y retos del experimento.
La preparación de pez cebra se describe aquí permite el estudio eléctrica y morfológica de las neuronas espinales in situ durante sus etapas más tempranas de la diferenciación. Mediante el registro de neuronas de la médula uso de estos métodos, hemos ganado penetración en los efectos celulares de varias mutaciones, incluso antes de la identificación del gen lesionada 6, 64, 65.
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Disclosures
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del NIH (F32 NS059120 a RLM y R01NS25217 y P30NS048154 a ABR).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vacuum filter/Storage bottle, 0.22 mm pore | Corning | 431096 | |
| Syringe filter 0.2 mm | Whatman | 6780-2502 | |
| Tricaine | Sigma | A-5040 | Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt |
| α-bugarotoxin | Tocris | 11032-79-4 | |
| Tetrodotoxin | Tocris | 4368-28-9 | |
| Alexa-549 hydrazine salt | Molecular Probes | A-10438 | fluorescent dye |
| Spin-X centrifuge tube filter | Corning | 8161 | |
| Glass microscope slide | Fisher | 12-550C | |
| Sylgard silicone elastomer kit | Dow Corning | 184 | silicone elastomer |
| Petri dishes | Falcon | 351029 | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0038 | inner and outer diameters of 0.78 and 1.0 mm (thin walled glass capillaries) |
| Borosilicate glass capillaries | Drummond Scientific | 1-000-1000-100 | inner and outer diameters of 1.13 and 1.55 mm (thick walled glass capillaries) |
| Miniature barbed polypropylene fitting | Cole-Palmer | 6365-90 | |
| Vetbond tissue adhesive | 3M | 1469SB | |
| Collagenase XI | Sigma | C7657 | |
| Microelectrode puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200B | |
| Head stage | Molecular Devices | CV203BU | |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Tygon tubing | Fisher | 14-169-1B | ID 1/16 IN, OD 1/8 IN and WALL 1/32 IN (flexible laboratory tubing) |
| Electrode holder | Molecular Devices | 1-HC-U | |
| Pharmaseal Three-Way Stopcocks | Baxter | K75 | |
| Digitizer | Axon Instruments | Digidata 1440A | |
| Inverted microscope | Zeiss | Axioskop2 FS plus | |
| 40X/0.80W Achroplan objective | Zeiss | ||
| Data acquisition and analysis software | Axon Instruments | PClamp 10 - Clampex and Clampfit | |
| Micropipette puller | Sutter Instruments | Model P-97 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dissection and Recording Solutions (in mM) | |||
| All solutions, except the intracellular, are stable for ~2-3 months when filtered (0.22 mm filter cups) and stored at room temperature (RT). | |||
| The intracellular solution is filtered (0.2 mm syringe filters) and stored frozen (-20 °C) in small aliquots that are individually thawed on the day of use. | |||
| Dissection/Ringer’s solution | 145 NaCl, 3 KCl, 1.8 CaCl2.2H2O, 10 HEPES; pH 7.4 (with NaOH) | ||
| Pipette (intracellular) recording solution | 135 KCl, 10 EGTA-acid, 10 HEPES; pH 7.4 (with KOH). | ||
| Bath (extracellular) recording solution/voltage and current-clamp | 125 NaCl, 2 KCl, 10 CaCl2.2H2O, 5 HEPES; pH 7.4 (with NaOH). | ||
| Alexa-594 hydrazine salt stock solution. | Prepare a 13.2 mM stock in ddH2O, aliquot (~100 µl) and store at -20 °C. For use, dilute the stock solutiond 132 fold with pipette solution to a final concentration of 100 mM. After dilution, filter the Alexa-594 containing pipette solution with a centrifuge tube filter. | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immobilizing agents | |||
| 0.4% ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine) | Prepare a 0.4% stock solution in 0.2 M Tris, pH 9 (0.4 g Tricaine/100 mL 0.2 M Tris | ||
| Adjust pH to 7 with NaOH and store at -20 °C. | |||
| For use, dilute the stock solution ~25 fold in embryo media | |||
| 250 mM α-bungarotoxin | Prepare a 250 mM stock in ddH2O (1 mg/500 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,500-fold with extracellular solution to a final concentration of 100 nM. | |||
| 1 mM Tetrodotoxin | Prepare a 1 mM stock in ddH2O (1 mg/3 mL), prepare 100 µL aliquots, and sotre at -20 °C. | ||
| For use, dilute 2,000-fold with extracellular solution to a final concentration of 500 nM. | |||
References
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