DiI זלוף כשיטת ויזואליזציה של כלי הדם Published: June 16, 2017 doi: 10.3791/55740

DOI

Automatic Translation

• English (Original)
• العربية (Arabic)
• 中文 (Chinese)
• dansk (Danish)
• Nederlands (Dutch)
• français (French)
• Deutsch (German)
• עברית (Hebrew)
• हिंदी (Hindi)
• italiano (Italian)
• 日本語 (Japanese)
• 한국어 (Korean)
• norsk (Norwegian)
• português (Portugese)
• русский (Russian)
• español (Spanish)
• svenska (Swedish)
• Türkçe (Turkish)

Anna J. Saltman*^1,2, May Barakat*¹, Donald M. Bryant¹, Anastasia Brodovskaya¹, Jessica L. Whited¹

¹Department of Orthopedic Surgery, Harvard Medical School and Brigham and Women's Hospital, ²Division of Graduate Medical Sciences, Boston University

* These authors contributed equally

Summary

באמצעות lipophilic 1,1-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) מכתים טכניקה, Ambystoma mexicanum יכול לעבור זלוף כלי הדם כדי לאפשר ויזואליזציה קלה של כלי הדם.

Abstract

טכניקות זלוף שימשו במשך מאות שנים כדי להמחיש את זרימת הרקמות. Axolotl (Ambystoma mexicanum) הוא מין של סלמנדרה שהתגלתה כמודל חיוני ללימודי התחדשות. מעט ידוע על איך מתרחשת רה-וסקולריזציה בהקשר של התחדשות אצל בעלי חיים אלו. כאן אנו מדווחים על שיטה פשוטה להדמיה של כלי הדם ב axolotl באמצעות זלוף של 1,1'-Dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI). DiI הוא צבע lbophilic carbocyanine כי מוסיף לתוך קרום פלזמה של תאים האנדותל באופן מיידי. זלוף נעשה באמצעות משאבת peristaltic כך DiI מזין את זרימת הדם דרך אבי העורקים. במהלך זלוף, צבע זורם דרך כלי הדם של axolotl ומשלב לתוך bilayer השומנים של תאים אנדותל כלי הדם על קשר. הליך זלוף לוקח בערך שעה אחת עבור axolotl שמונה אינץ '. מיד לאחר זלוף wiDiI, axolotl ניתן דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי confocal. ה- DiI פולט אור בטווח כתום אדום כאשר מתרגש עם מסנן פלואורסצנטי ירוק. הליך זה זלוף Di ניתן להשתמש כדי לדמיין את המבנה של כלי הדם של axolotls או להדגים דפוסים של רה-וסקולריזציה ברקמות התחדשות.

Introduction

ויזואליזציה של כלי הדם משחק תפקיד חיוני בהבנת המבנה והתפקוד של אורגניזמים על פני מינים רבים. החל מהמאה ^ה -16 עם לאונרדו דה וינצ'י, נחקרו מודלים וייצוגים גרפיים של המחזור. באמצעות שעווה ותבניות גומי, רקמות היו perfused כדי ליצור מודלים תלת מימדיים של כלי הדם, אשר אפשרה את המחקר של אורגנוזה ו פתוגנזה ^{1 , 2} . שרפים ושעווה היו בצבע עם צבעים כגון הודו דיו או אדום carmine כדי לאפשר להדמיה קלה שלהם ^{1 , 2} . עם זאת, טכניקות אלה גרמו לבעיות רבות בגלל צמיגות גבוהה שלהם מנעו זלוף מלא של הרקמה של עניין ¹ . ככל שהשדה נעשה מתוחכם יותר, השימוש במיקרוסקופים קונפוקליים ואלקטרוניים נכנס לפעולה, והעביר את הטכנולוגיות של הזלוף Ues במרחק של תבניות יצוק לעבר נוזלים נוזלי של כלי הדם, שחלקם מותר זלוף הדמיה של כלי הדם מבלי להרוס את הרקמה הראשונית ³ . DiI, צבע קרבוזינין פלואורסצנטי, הוא כתם אחד כזה המאפשר זלוף של בעלי חיים ללא נזק לרקמות כלי הדם.

צבעים Carbocyanine הם צבעים lipophilic המשלבים לתוך קרום התא על המגע. צבעים אלה מאפשרים מכתים קל מיידית של תאים אנדותל כלי דם, אשר לאחר מכן ניתן לצפות תחת מיקרוסקופ confocal ניאון. DiI נע דרך דיפוזיה לרוחב בקרום השומנים של תאים, כפי שמוצג תיוג ואת מעקב של נוירונים ⁴ . מבחינה כימית, שתי שרשראות אלקיל של DiI לתת לצבוע את זיקה גבוהה של קרום התא, בעוד שני טבעות מצומדות מ fluorochrome אשר אחראי על פליטת אור אדום אדום כאשר נרגש על ידי מסנני אור פלואורסצנטי ירוק> 4. DiI כבר מנוצל יכולות רבות, כולל תיוג מוצלח של קרום פלזמה וגם אנטרוגרד ו תיוג מדרדר נוירונים ^{5 , 6} . DiI בעבר נעשה שימוש בפרוטוקולים זלוף תוך הדמיה vasculature של עכברים ⁷ .

Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) הם סלמנדרס שחיים אך ורק אגמים מליחים ליד מקסיקו סיטי, מקסיקו. בעלי חיים אלה הפכו למודל חשוב להבנת תהליכי התחדשות, שכן הם יכולים ליצור מחדש את הגפיים המלאות, הזנב (כולל כבל עצב), חלקים של הלב ואיברים פנימיים אחרים, וחלקים בעין כמבוגרים ^{8 , 9} . בנוסף, עם היישום האחרון של כלים גנטיים ב axolotls, תובנה חסרת תקדים של מולקולות ותאים המניעים תהליכים אלה כעת אפשרי ⁸ . את regen מוצלחהקצבה של איבר שלם דורש תהליך רחב של רה-וסקולריזציה, אשר עשוי לשחק תפקיד משמעותי התחדשות מעבר פשוט את הפונקציות המסורתיות של כלי הדם במתן חמצן וחומרים מזינים. הבנת רה-וסקולריזציה בהקשר של התחדשות רקמות היא הכרחית. כלי הדם Axolotl בעבר דמיינו באמצעות הודו דיו, בעוד התוצאות היו מסקרנות, תהליך זה לא היה revisited בעשורים הבאים ¹⁰ . ביקשנו להתאים פרוטוקול Diusion זלוף שפותחה לשימוש יונקים כדי לאפשר זלוף מלא ויזואליזציה של כלי הדם axolotl ⁷ . פרוטוקול זה מתאר את הצעדים שננקטו בהצלחה perfuse ולאחר מכן לדמיין את זרימת axolotl עם טכניקה מכתים DiI. הליך זה יאפשר הדמיה מדויקת של כלי הדם הפטנט ברקמות הומיאוסטיות, כמו גם ברקמות התחדשות, ומספק שיטה חדשה visualisatioN וניתוח של תהליך רה-וסקולריזציה ב axolotl.

Protocol

כל הניסויים axolotl בוצע בהתאם בית החולים בריגהם של נשים (BWH) מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.

1. הגדרת ניסוי perfusion

1. מניחים axolotl מבוגר במיכל פלסטיק מלא עם פתרון 0.1% tricaine (MS222) במשך 15-20 דקות או עד הרדים לחלוטין. ודא כי מיכל מלא פתרון tricaine מספיק כך axolotl הוא שקוע לחלוטין.
   הערה: יש לבצע את כל ההליכים בהתאם להנחיות הטיפול בבעלי חיים מוסדיים. ב BWH, axolotl נחשב להרדים לחלוטין כאשר הוא נכשל מבחן רגל קמצוץ, כלומר אין תנועה רפלקסיבית כאשר כף הרגל הוא סחוט בעדינות.
   זהירות: למרות tricaine הוא חומר הרדמה המשמש במיוחד עבור אורגניזמים מימיים, מגע ישיר העור עם פתרון tricaine יש להימנע.
2. הגדרת תחנת זלוף axolotl.
   1. מניחים אתמשטח סופג על משטח שטוח, שטוח עם הצד סופג כלפי מעלה.
   2. חותכים חור במסגרת קצף פוליסטירן כי הוא בגודל המתאים ואת הצורה עבור axolotl הרדים להניח במצב שכיבה. מניחים את המסגרת על משטח סופג.
      הערה: ניתן למקם מגבות נייר נוספות מיד מתחת למסגרת לקבלת ספיגה נוספת.
   3. טען את המשאבה peristaltic עם צינורות זלוף. הגדר את המשאבה בקצב זרימה של 0.7 מ"ל / דקה, זורם בכיוון השעון.
   4. הפוך את הפתרון מדולל עם 0.7x PBS ו 5% גלוקוז בתערובת 1: 4.
   5. מערבבים 10 מ"ל של פתרון diluent עם 200 μL של פתרון המניות DiI בצינור 50 מ"ל חרוטי. כיפה ומערבבים על ידי היפוך. כיסוי זה צינור עם נייר אלומיניום לסכל כדי להגן על פתרון העבודה מחשיפה לאור.
      הערה: כרכים צריך להיות שונה בהתאם לגודל של axolotl באופן יחסי. ערכים אלה הם עבור axolotl כ 15 ס"מ (אורך snout-to-tail). אנימלים בגודל זה אולי לא הגיעו לבגרות מינית מלאה ולכן המין החיה לא ייקבע בשלב זה.
   6. ממלאים צינור חרוטי 50 מ"ל עם 0.7x PBS.
      הערה: PBS ישמש עבור תחול לולאה exxanguination axolotl.
   7. צרף את המחט 27-מד פר כדי סוף היציאה של צינורות זלוף. מקפלים את כנפי פרפר אחד על השני ומניחים בעמדה מהדק.
   8. מניחים את הקצה החופשי של צינורות זלוף בצינור 50 מ"ל חרוטי מלא 0.7x PBS ולהפעיל את משאבת זלוף עד צינורות כולו מלא פתרון. להשהות את המשאבה פעם את כל צינורות מלא PBS.
      הערה: ודא צינורות ללא בועות אוויר בכל עת, כמו אלה יגרום האוויר emboli ב axolotl ולמנוע זלוף מלא.
   9. מניחים מגבת נייר בצורת axolotl בצורת מסגרת קצף פוליסטירן. באמצעות פיפטה העברה, להשרות את המגבת עם פתרון tricaine.
      הערה: חותכים ריבוע קטן באמצע מגירת הנייראל כדי לאפשר ניקוז של נוזלים במהלך הליך זלוף.
   10. מניחים את שסתום axolotl הרדים על מגבת נייר בתוך מסגרת קצף פוליסטירן.

2. פתיחת חזה האקסולוט

1. השתמש במלקחיים כירורגיים כדי לצבוט את העור לאורך הציר המרכזי של החזה של axolotl, ממש מתחת לקו הכתפיים. לַעֲקוֹר.
2. השתמש אזמל לבצע חתך קטן שבו העור כבר משך.
3. הסר פיסת עור מרובעת על החזה כדי לחשוף שתי צלחות סחוס.
   1. הסר את העור כדי לפתוח חלון מעל חלל בית החזה גדול מספיק כדי לראות בבירור את הלב כ 5 מ"מ של אבי העורקים הסתעפות של הלב.
4. בזהירות לקרוע את רקמת החיבור באמצעות מלקחיים או מספריים סגורים על מנת למנוע חיתוך כל כלי הדם העיקריים.
5. הרם כל צלחת הסחוס בנפרד באמצעות מלקחיים ובלו אותם WIth את המספריים כירורגית.
6. בזהירות לצבוט את קרום הלב עם מלקחיים, למשוך למעלה, לנקב אותו באמצעות מספריים כירורגית; חתך זה צריך להיות רק מספיק עמוק כדי לנקב את קרום הלב דק מאוד צריך להיות גדול מספיק כדי לאפשר הסרת קרום הלב. הקפד לא לחתוך את הלב.
7. הסר בעדינות את קרום הלב כדי לחשוף את הלב ואת אבי העורקים.
   הערה: באמצעות פיפטה העברה, מעת לעת לשטוף את חלל החזה ואת הזימים עם פתרון tricaine לשמור על האזור ברור ולשמור על axolotl הרדים.

3. זלוף של Axolotl

1. מניחים את עמדת מהדק עם מחט פרפר טעון ליד מסגרת קצף פוליסטירן, כך זרוע של מהדק יכול בקלות להיות מניפולציה כדי להכניס את המחט לתוך אבי העורקים axolotl. הצבע את קצה המחט לכיוון היבט מקורי של החיה במהלך ההכנסה ולשמור על המחט מקבילים אבי העורקים, כדי למנוע ניקוב זה דרך opצד חיובי.
2. הפעל את המשאבה peristaltic. 0.7x PBS צריך להמשיך לזרום דרך צינורות.
3. הכנס את המחט לתוך אבי העורקים.
   1. החלק את מלקחיים מתחת לקשת אבי העורקים ולמשוך מעט כדי לאפשר גישה קלה.
   2. לתמרן את שילוב מחט המחט כך המחט פועל לאורך אורך של אבי העורקים, מצביע לכיוון הראש. הכנס את המחט תוך שימוש במלקחיים עבור תמיכה מאחורי אבי העורקים.
      הערה: המחט צריך להיות מוכנס עמוק מספיק לתוך אבי העורקים כדי להבטיח שזה לא יחליק החוצה במהלך זלוף. זה יכול להיות על 5 מ"מ עבור 15 ס"מ axolotl. ודא כי המחט היא באופן מושלם בקנה אחד עם אבי העורקים, כדי למנוע לנקב מוחלט של כלי השיט. באמצעות ו-נקבים יכול לגרום דימום מסיבי ולהפחית את שיעורי ההצלחה של זלוף. ההכנסה מוצלחת ניתן לאשר על ידי הגדלה גלוי של אטריה של הלב.
4. מהר laterate אטריום אחד עם sciSsors ולאפשר דם להתרוקן.
   1. שטוף עם פתרון tricaine כדי למנוע הצטברות דם היווצרות קריש בחלל החזה.
5. Perfuse את axolotl עם כ 20-30 מ"ל של PBS. הבהמה צריכה להשתנות מ ורוד בהיר בצבע לבן על זלוף מוצלח.
6. להשהות את המשאבה peristaltic ולהזיז את הקצה החופשי של צינורות לתוך צינור 15 מ"ל של פתרון DiI. הפעל מחדש את המשאבה, היזהר כדי למנוע יצירת בועות אוויר בצינור.
7. Perfuse את axolotl עם מלאי העבודה כולו של DiI.
   הערה: ב זלוף מוצלח, axolotl עם שינוי צבע ורוד בהיר של DiI. זה יהיה בולט ביותר הזימים.
8. להשהות את המשאבה לאחר זלוף עם DiI הושלם במקום סוף חינם של צינורות לתוך פתרון Paraformaldehyde 4% (PFA) לתקן את הרקמה. הפעל מחדש את המשאבה ואת perfuse לפחות 10 מ"ל של PFA.
   זהירות: PFA הוא רעיל צריך להיות מטופלים ו dispoSed של כראוי. כפפות וכוסות בטיחות צריך להיות משוחק, ופתרונות צריך להיעשות בתוך מכסה המנוע קטר. זלוף של axolotl עם PFA לתקן את הרקמה תוצאות המוות של החיה.

4. סיום זלוף ההכנה ויזואליזציה

1. עצור את המשאבה peristaltic ולהסיר את המחט מן האאורטה axolotl.
2. מניחים את axolotl על צלחת פלסטיק.
   הערה: שימוש של חצי צלחת פטרי גדול עובד היטב ומאפשר לשפוך כמות קטנה של Tricaine או PBS על axolotl כדי לשמור על העור רטוב ולשפר את איכות הדמיה.
3. להשליך את כל החומרים בשימוש בפחים פסולת המתאימים. נקי כלים כירורגיים עם אתנול 70%, לחטא באמצעות מעקר זכוכית חרוז בין בעלי חיים, וכן לעקר ידי מעוקר בעקבות ההליך. צנרת צינורות עם פתרון PBS ולאחר מכן לנקז, יבש לחלוטין, ולאחסן לשימוש נוסף.

5. ויזואליזציה של Axolotl perfused

מניחים את axolotl תחת מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי.

כבה את האורות כמו הדמיה של כלי מוכתם DiI הוא מונע על ידי האור.

השתמש ירוק הקרינה הקרינה פליטה קוביית ( למשל ET-CY3) עם מיקרוסקופ confocal לדמיין את כלי הדם של axolotl. השתמש אור עירור 545 ננומטר.
הערה: כדי להשיג תמונה באיכות גבוהה, ניתן להשתמש בפרמטרים הבאים: חשיפה ל -1.1 s, רווח של 1x, רוויה של 1.0, הגדלה של 2X.

Representative Results

עם מכתים DiI, vasculature של axolotl ניתן דמיינו בקלות. כלי דם של בעלי חיים perfused עם צבע lipophilic נראים מיד תחת מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. איור 1-1-1.5 הוא ייצוג סכמטי של פרוטוקול הזלוף. לאחר זלוף עם צבע ורוד בהיר, axolotl perfused בהצלחה יופיע ורוד. באמצעות מסנן פלואורסצנטי ירוק על מיקרוסקופ confocal אדום פליטה של ​​רשת כלי הדם יופיע. מכתים DiI מתרחשת בכל רקמות הגוף כאשר זלוף מוצלח, כולל הזנב, הגפיים, הזימים, ואת העיניים ( איור 2 א , איור 2 ב , איור 2 ג , איור 2 ד , reactively). מוצלחות perfusions לגרום חוסר של כלי דם מוכתמים אדום או מכתים של כתמים של כלי.

Ntent "עבור: keep-together.within-page =" 1 ">
איור 1: סכמטי של פרוטוקול זלוף. Axolotls בהצלחה perfused עם צבע lipophilic, DiI, להפגין מכתים מלאה של כלי הדם על הדמיה. 1: axolotl שובב מלא לפני ניסוי זלוף. 2: פתיחת החזה של axolotl. 2: Axolotl עם חלל פתוח החזה. 3: הכנסה של 27 G פרפר מחט לתוך אבי העורקים של axolotl. 4: צינורות צריך קודם כל להכיל 0.7x PBS, ואז הפתרון עובד DiI, ולבסוף 4% PFA. 5: axolotls perfused לחלוטין מופיעים ורוד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2: תמונות של Axolo מבושל לחלוטיןTl. תמונות של כלי הדם axolotl נלקחו באמצעות מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי לאחר זלוף מוצלח עם כתם DiI. 2A: זנב. 2 ב: רגל. 2C: Gills. 2D: עין. הדמיה מתבצעת באמצעות מיקרוסקופ confocal עם קוביית פלואורסנט ירוק מסנן פליטה. הגדלה עבור תמונות A, B, C ו- D, הן 1.74X, 2.16X, 1.18X ו- 5.69X, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

ויזואליזציה של כלי הדם של axolotl ניתן להשיג בהצלחה באמצעות זלוף עם צבע lbophilic carbocyanine, DiI. במחקר זה, אנו מתארים פרוטוקול חדש עבור זלוף של axolotl עם DiI באמצעות משאבת peristaltic. כמו כן, אנו מראים את ההדמיה שלאחר מכן של vasculature axolotl באמצעות מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי. פרוטוקול זה היה הסתגלות של המכרסמים DiI זלוף פרוטוקול לראות Li et al. ⁷ , אולם ההבדלים העיקריים בין מכרסם לבין axolotl נדרש עדכון של הפרוטוקול כדי להתאים את המודל axolotl.

מחקר זה דן בשיטה של ​​זלוף DiI של axolotl כדי להצליח לדמיין את כלי הדם. הבדלים באנטומיה ובפיזיולוגיה בין הסלמנדרה לבין שינויים בביקוש מכרסם בהיבטים העיקריים של זלוף, כולל מיקום של הכנסת מחט, שיטת זלוף, ואת ריאגנטים בשימוש. כדי כאביםIve זלוף מוצלח, הגבלנו את הנזק שנגרם vasculature של axolotl. בעת פתיחת חלל החזה, נלקח טיפול לחשוף באופן מלא את הלב ואת אבי העורקים, תוך הימנעות כל נזק או lacerations לכלי הדם הגדולים. הגבלת השימוש במספריים הכירורגיים מנעה קליטה מקרית של כלי שיט גדולים, ואילו חתכים קטנים שמרו על החשיפה של הלב ואבי העורקים. שיעורי ההצלחה של perfusions גם גדל כאשר מחט DiI הוכנס דרך אבי העורקים, ולא ישירות לתוך תאי הלב. Axolotl, שלא כמו העכבר, יש לב שלושה חדרים, המכיל רק חדר אחד עם שרירים פחות משמעותית מזו של העכבר. בגלל הבדלים אלה, המיקום של הכנסת המחט היה צריך להיות מועבר אבי העורקים יציבה יותר. אבי העורקים היה נחוש להיות המיקום האופטימלי עבור החדרת מחט זלוף כפי שהוא גדול מספיק עבור לנקב על ידי מחט 27 G יש תנועה מוגבלת. התנועה היתה מינימליתIzed על מנת למנוע הסרת מקרית או החלקה של מחט זלוף או לנקב דרך ו-דרך של אבי העורקים. כאבי לב באמצעות החדר כמו נקודת הכניסה הוכיח שיש שיעור נמוך בהרבה של הצלחה מאשר אלה עם נקודת הכניסה אבי העורקים. ניקוב מזויף של כלי הדם גרם לעתים קרובות להיווצרות של אמבולי או מנע זלוף, וכתוצאה מכך שיעורי נמוך מאוד של תיוג כלי הדם מוצלח. באמצעות דוכן מהדק להחזיק את מחט פרפר במהלך זלוף, יש לנו ירידה התנועה שלה, ולכן להגדיל את שיעור מוצלח של perfusions. בנוסף, בשל עדינות הרקמה axolotl, בהשוואה לעכבר, משאבת זלוף peristaltic היה הכרחי, בניגוד זלוף ידני בעבר. השימוש במשאבה זו איפשר גישה של הידיים ללא זלוף axolotl כדי למזער ניקוב מוטעה של רקמות דקות. זיכיונות נכשלו מסיבות רבות נוספות, כולל סימני פיסוקUre, קרישה, ותסחיף. במקרה המחט הוכנס לתוך אבי העורקים ונקב השני נוצרה דרך הקיר האחורי, הפתרון DiI יזרמו ישירות לתוך חלל החזה ולא לעבור דרך מחזורית מערכתית. בנוסף, פעם אחת הדם יצא מן כלי הדם, הוא במהירות נוצר קריש דם אשר יכול לעכב זלוף. קרישי בועות אוויר יכול גם בצורת כלי הדם, גרימת embole אשר מונע זלוף מוצלח. לבסוף, פרוטוקול זה כלל ריאגנטים מותאמים כדי להתאים את osmolality axolotl, אשר שונה באופן משמעותי מזה של היונק. הסתגלות של פרוטוקול זה ואת השינויים המשמעותיים שנעשו כדי להתאים את המודל axolotl יסייע במרדף להבנת תהליך של רה-וסקולריזציה של רקמות במהלך התחדשות.

DiI, שהוא בצבע ורוד, יהיה perfuse החיה ולתת לו גוון ורוד בוהק. בהצלחה axolotls perfused הפך ורוד בהיר לעין בלתי מזוינת, עם מאודאזורים וסקולריים המופיעים בכתמים חזקים יותר. בעלי חיים perfused שנצפו עם מיקרוסקופ confocal פלואורסצנטי באמצעות מסנן ירוק ניתן דמיינו בספקטרום פליטה אדום כתום. Vasculature היה דמיינו הטובה ביותר ברקמות דקיק כי למזער מכתים DiI בשוגג של רקמות לא כלי הדם. זלוף של הרקמה עם Paraformaldehyde 4% (PFA) מיד לאחר זלוף DiI צריך להיעשות כדי לתקן את הרקמה.

DiI הם perfusions end-point ניסויים axolotl. במהלך ההליך, כל הדם של החיה הוא למעשה מרוקן מוחלף עם 0.7x PBS, ואחריו מיד על ידי פתרון DiI, ולבסוף 4% PFA. זה משבש את היכולת של axolotl לעסוק בפעולה חיונית של חילופי גז והוא מאבד את היכולת חמצן רקמות הגוף שלה. בשל אופי זה נקודת קצה, כל זלוף לוכדת רק נקודת זמן אחת של צמיחה כלי הדם, ואת החיה לא יכול להיות perfused נוספת במועד מאוחר יותר. בגלל הזמן הזה-לימיTing גורם, בעלי חיים מרובים יש להשתמש כדי לתאר את מהלך הזמן של התפתחות כלי הדם.

פרוטוקול DiI זה, ושינויים החלים כדי לשפר את זה, יכול לשמש בהצלחה תווית לדמיין את כלי הדם של axolotl. מאז axolotl הוא אורגניזם מודל חיוני לחקר התחדשות, מוצלחת perfusions לפתוח הזדמנויות לחקור את תהליך angiogenesis במהלך התחדשות. Axolotl הוא אורגניזם מודל לחקר התחדשות כי הוא בעל חיים ניאוטני ולכן שומרת על יכולת יוצאת דופן להתחדש לאורך הבגרות ⁸ . תהליך ההחלמה מחדש של רקמות התחדשות, לעומת זאת, אינו מובן היטב, ולכן הסתגלות של זלוף DiI למערכת axolotl מציג הזדמנויות להבין התחדשות שלא היו זמינים עם המודל יונקים. זלוף של axolotl באמצעות DiI היא טכניקה חדשה לחקר revasCularization של רקמות התחדשות במודל זה חיה, ולכן, פרוטוקול זה ניתן להשתמש עוד יותר כדי להבין אורגנוגנזה במהלך התפתחות אנגיוגנזה במהלך המחלה, כמו גם להיות מנוצל ככלי חשוב במהלך המחקר של התחדשות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Peristaltic Pump	Marshall Scientific	RD-RP1
Perfusion tubing	Excelon Lab & Vacuum Tubing	436901705	size S1A
27g butterfly needle	EXELint Medical Products	26709
NaCl	AmericanBio	7647-14-5
KCl	AmericanBio	7747-40-7
Na2HPO4	AmericanBio	7558-79-4
NaH2PO4	AmericanBio	10049-21-5
Distilled water
HCl	AmericanBio	7647-01-0
Glucose	ThermoFischer	A2494001
1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate	Sigma Aldrich	468495
Ethanol (100% vol/vol)	Sigma Aldrich	64-17-5
Surgical foreceps	Medline	MDG0748741
Polystyrene foam frame			any polystyrene foam square with an axolotl-shaped  cut out
Surgical scissors	Medline	DYND04025
Scalpel	Medline	MDS15210
Absorbent underpad	Avacare Medical	PKUFSx
Paper towels
Standard disposable transfer pipette	Fisherbrand	50216954
Clamp stand	Adafruit	291
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate	Sigma Aldrich	E10521	Tricaine powder
Adult axolotl
MgSO4	AmericanBio	10034-99-8
CaCl2	Sigma Aldrich	C1016-100G
NaHCO3	Sigma Aldrich	S5761-500G
Plastic tanks			Varying size appropriate for the axolotl
Paraformaldehyde	Sigma Aldrich	30525-89-4
Axolotl
Leica Microscope	Leica	M165 FC
ET-CY3 Fluorescent Filter	Leica	M205FA/M165FC
MS-222