Summary
Ved bruk av en lipofil 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyanin-perklorat (DiI) -fargingsteknikk, kan Ambystoma-mexicanske gjennomgå vaskulær perfusjon for å muliggjøre enkel visualisering av vaskulaturen.
Abstract
Perfusjonsteknikker har blitt brukt i århundrer for å visualisere sirkulasjonen av vev. Axolotl (Ambystoma mexicanum) er en art av salamander som har oppstått som en viktig modell for regenereringsstudier. Det er lite kjent om hvordan revaskularisering skjer i sammenheng med regenerering i disse dyrene. Her rapporterer vi en enkel metode for visualisering av vaskulaturen i aksolotl via perfusjon av 1,1'-dioctadecy-3,3,3 ', 3'-tetrametylindokarbocyaninperklorat (DiI). DiI er et lipofilt karbocyaninfargestoff som umiddelbart settes inn i plasmamembranen til endotelceller. Perfusjon gjøres ved bruk av en peristaltisk pumpe slik at DiI går inn i sirkulasjonen gjennom aorta. Under perfusjon flyter fargestoffet gjennom axolotls blodkar og inkorporerer i lipid-bilaget av vaskulære endotelceller ved kontakt. Perfusjonsprosedyren tar omtrent en time for en åtte-tommers aksolotl. Umiddelbart etter perfusjon wiDiI, kan axolotl visualiseres med et konfokal fluorescerende mikroskop. DiI utsender lys i det rød-oransje området når det er opphisset med et grønt fluorescerende filter. Denne DiI perfusjonsprosedyren kan brukes til å visualisere den vaskulære strukturen til aksolotler eller å demonstrere mønstre av revaskularisering i regenererende vev.
Introduction
Visualisering av vaskulatur spiller en viktig rolle i å forstå strukturen og funksjonen av organismer på tvers av mange arter. Fra det 16. århundre med Leonardo da Vinci, har modeller og grafiske representasjoner av sirkulasjonen blitt studert 1 . Ved hjelp av voks og gummiforme ble vev perfusjonert for å skape tredimensjonale modeller av vaskulaturen, som tillot studiet av organogenese og patogenese 1 , 2 . Harpikser og voks ble farget med fargestoffer som India Ink eller carmine rød for å tillate deres enkle visualisering 1 , 2 . Imidlertid forårsaket disse teknikkene mange problemer fordi deres høye viskositeter forhindret full perfusjon av vev av interesse 1 . Da feltet ble mer sofistikert, kom bruk av konfokale og elektronmikroskop inn i spill, og flyttet perfusjonsteknikken Ues vekk fra støpeformer og mot væskeformige perfusjoner av vaskulaturen, hvorav noen tillater perfusjon og avbildning av blodkar uten å ødelegge startvevet 3 . DiI, et fluorescerende karbocyaninfargestoff, er en slik flekk som tillater perfusjon av dyr uten skade på det vaskulære vevet.
Carbocyanin-fargestoffer er lipofile fargestoffer som innarbeider i cellemembraner ved kontakt. Disse fargene tillater enkel og øyeblikkelig farging av vaskulære endotelceller, som deretter kan ses under et fluorescerende konfokalmikroskop. DiI beveger seg via lateral diffusjon i lipidmembranen av celler, som vist i merking og sporing av nevroner 4 . Kjemisk gir de to alkylkjedene av DiI fargestoffet sin høye affinitet for cellemembraner, mens to konjugerte ringer fra en fluorokrom som er ansvarlig for å sende en rød bølgelengde når den blir opphisset av grønne fluorescerende lysfiltre> 4. DiI har blitt brukt i mange kapasiteter, inkludert vellykket merking av plasmamembranen og både anterograd og retrograd merking i nevroner 5 , 6 . DiI har tidligere vært brukt i perfusjonsprotokoller mens du visualiserer muskulaturen 7 .
Axolotls ( Ambystoma mexicanum ) er salamanders som bor utelukkende i brakiske innsjøer i nærheten av Mexico City, Mexico. Disse dyrene har blitt en viktig modell for å forstå regenerative prosesser som de kan regenerere hele lemmer, hale (inkludert nerve ledning), hjertepartier og andre indre organer og deler av øyet som voksne 8 , 9 . I tillegg, med den nylig anvendte genetiske verktøyet i aksolotene, er det nå mulig å få enestående innsikt i molekylene og cellene som driver disse prosessene 8 . Den vellykkede regenenRation av en hel lem krever en omfattende revaskulariseringsprosess, som kan spille en betydelig rolle i regenerering utover bare de tradisjonelle funksjonene til blodkar i å gi oksygen og næringsstoffer. Forståelse av revaskularisering i sammenheng med vevregenerering er viktig. Axolotl blodkar har tidligere blitt visualisert ved hjelp av India Ink, og mens resultatene var spennende, har denne prosessen ikke blitt revidert i påfølgende tiår 10 . Vi søkte å tilpasse en DiI perfusjonsprotokoll utviklet for bruk i pattedyr for å muliggjøre en fullstendig perfusjon og visualisering av aksolotlvaskulaturen 7 . Denne protokollen beskriver trinnene som er tatt for å perfeksjonere og senere visualisere aksolotl-sirkulasjonen med en DiI-fargingsteknikk. Denne prosedyren vil tillate nøyaktig visualisering av patent blodkar i hjemostatiske vev, så vel som i regenererende vev, og gir en ny metode for visualizatioN og analyse av revaskulariseringsprosessen i axolotl.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle aksolotl-eksperimenter ble utført i samsvar med Brigham og Women's Hospital's (BWH) Institutional Animal Care and Use Committee.
1. Sett opp Perfusion Experiment
- Plasser en voksen axolotl i en plastbeholder fylt med 0,1% tricaine-oppløsning (MS222) i 15-20 minutter eller til helt bedøvet. Sørg for at beholderen er fylt med nok tricaine løsning slik at axolotl er helt nedsenket.
Merk: Alle prosedyrer må utføres i samsvar med institusjonelle retningslinjer for dyrepleie. På BWH anses en axolotl å være fullstendig bedøvet når den feiler en fotklype test, noe som betyr at det ikke er noen refleksiv bevegelse når foten er forsiktig presset.
Forsiktig: Selv om tricain er et bedøvelsesmiddel som er spesielt brukt for vannlevende organismer, bør direkte hudkontakt med tricinoppløsningen unngås. - Sett opp aksolotl perfusjonsstasjonen.
- PlasserAbsorberende pute på en flat, jevn overflate med den absorberende siden vendt oppover.
- Klipp et hull i polystyrenskumrammen som er riktig størrelse og form for den bedøvede axolotl å ligge i den bakre posisjonen. Legg rammen på absorberingsplaten.
Merk: Noen ekstra papirhåndklær kan plasseres umiddelbart under rammen for ekstra absorpsjon. - Legg peristaltisk pumpe med perfusjonsrøret. Sett pumpen til en strømningshastighet på 0,7 ml / min, som strømmer i retning med urviseren.
- Lag fortynningsoppløsningen med 0,7x PBS og 5% glukose i en 1: 4-blanding.
- Bland 10 ml fortynningsoppløsning med 200 μl av DiI-stamopløsningen i et 50 ml konisk rør. Cap og bland ved inversjon. Dekk dette røret med aluminiumsfoliepapir for å beskytte arbeidsløsningen mot eksponering mot lys.
Merk: Volum bør endres i forhold til aksolotlens størrelse proporsjonalt. Disse verdiene gjelder for en aksolotl på ca 15 cm (snout til hale lengde). ENNimaler av denne størrelsen har kanskje ikke oppnådd full kjønnsmodning, slik at dyrseks ikke kan bestemmes på dette tidspunktet. - Fyll et 50 ml konisk rør med 0,7x PBS.
Merk: PBS vil bli brukt til å priming sløyfen og axolotl exsanguination. - Fest 27-gauge-butterflynålen til utløpsenden av perfusjonsrøret. Vik sommerfuglens vinger på hverandre og sett i klemstativet.
- Plasser den frie enden av perfusjonsrøret i det 50 ml koniske rør fylt med 0,7 x PBS og kjøre perfusjonspumpen til hele slangen er fylt med oppløsning. Pause pumpen når hele slangen er fylt med PBS.
Merk: Pass på at slangen alltid er fri for luftbobler, da disse vil forårsake luftemboli i axolotl og forhindre full perfusjon. - Legg et papirhåndkle i den aksolotformede støpeformen i polystyrenskumrammen. Bruk en overføringspipette, suge håndkleet med tricaine-oppløsning.
Merk: Klipp et lite firkant midt på papiretEl for å tillate drenering av fluider under perfusjonsprosedyren. - Plasser den bedøvede axolotl på ryggen på papirhåndkleet inne i polystyrenskumrammen.
2. Å åpne Axolotl-brystet
- Bruk kirurgiske tvinge til å klemme huden langs aksens brystkjernes midtakse, like under linjen på skuldrene. Trekk opp.
- Bruk en skalpell for å lage et lite snitt hvor huden er trukket.
- Fjern en firkantet flekk på huden over brystet for å avsløre to bruskplater.
- Fjern huden for å åpne et vindu over thoracic hule som er stort nok til å tydelig se hjertet og ca 5 mm av aorta som forgrener seg fra hjertet.
- Trekk forsiktig opp bindevevet med tanger eller lukkede saks for å unngå å kutte noen store blodkar.
- Løft hver bruskplate enkeltvis ved hjelp av tang og aksepter dem wMed den kirurgiske saks.
- Klem forsiktig av perikardiet med tangen, trekk opp og punkter det med kirurgiske saks; Dette snittet skal bare være dypt nok til å punktere det meget tynne perikardiet og skal være stort nok til å tillate fjerning av perikardiet. Pass på å ikke kutte hjertet.
- Delikat fjern perikardiet for å utsette hjertet og aorta.
Merk: Bruk en overføringspipette til å spyle brysthulen og gjellene med tricaine-oppløsningen for å holde området klart og beholde aksolotlen bedøvet.
3. Perfusjon av Axolotl
- Plasser klemstativet med den innfylte sommerfuglnålen ved siden av polystyrenskumrammen, slik at klemmenes arm lett kan manipuleres for å sette nålen inn i axolotl aorta. Pek nålens spiss mot rostral-aspektet av dyret under innsetting og hold nålen parallelt med aorta for å unngå å punktere den gjennom opPositiv side.
- Slå på peristaltisk pumpe. 0,7x PBS bør fortsette å strømme gjennom rør.
- Sett nålen inn i aorta.
- Skyv pinnene under aortabuen og trekk litt for å muliggjøre enkel tilgang.
- Manøvrere nåleklemmekombinasjonen slik at nålen løper langs lengden av aorta og peker opp mot hodet. Sett inn nålen mens du bruker tangen for støtte bak aorta.
Merk: Nålen skal settes dypt nok inn i aorta for å sikre at den ikke glir ut under perfusjonen. Dette kan være omtrent 5 mm for en 15 cm axolotl. Kontroller at nålen er helt i linje med aorta for å unngå fullstendig punktering av fartøyet. Gjennom-og-gjennom punkteringer kan forårsake massiv blødning og redusere suksessfrekvenser for perfusjon. Vellykket innføring kan bekreftes ved synlig utvidelse av hjertets atria.
- Hurtig lacerate ett atrium med sciSsorer og la blodet tømme.
- Spyl med tricaineoppløsning for å forhindre blodakkumulering og koagulasjonsdannelse i brysthulen.
- Perfuse aksolotl med ca. 20-30 ml PBS. Dyret bør skifte fra lys rosa i farge til hvitt i en vellykket perfusjon.
- Pause peristaltisk pumpe og flytt den frie enden av slangen inn i 15 ml rør av DiI-løsningen. Start pumpen på nytt, pass på å unngå å skape noen luftbobler i slangen.
- Perfuse axolotl med hele arbeidsmaterialet til DiI.
Merk: I en vellykket perfusjon, aksolotl med skift farge til lys lyserøde av DiI. Dette vil bli mest merkbar i gjellene. - Pause pumpen etter perfusjonen med DiI er fullført og plasser den frie enden av slangen i 4% Paraformaldehyd (PFA) løsning for å fikse vevet. Start pumpen på nytt og perfusér minst 10 ml PFA.
Forsiktig: PFA er toksisk og skal håndteres og disponeresSed av hensiktsmessig. Hansker og vernebriller bør brukes, og løsninger må gjøres i en avtrekksdeksel. Perfusjon av axolotl med PFA for å fikse vevet resulterer i dyrets død.
4. Avslutning av perfusjon og visualisering
- Stopp peristaltisk pumpe og fjern nålen fra axolotl aorta.
- Plasser axolotl på en plastplate.
Merk: Bruk halvparten av en stor petriskål fungerer godt og gir mulighet for å hente en liten mengde Tricaine eller PBS på axolotl for å holde huden våt og forbedre visualiseringskvaliteten. - Kast alt brukt materiale i de tilhørende avfallsholderne. Rengjør kirurgiske verktøy med 70% etanol, desinfiser ved hjelp av en glassperle sterilisator mellom dyr, og steriliser ved autoklavering etter prosedyren. Spyl rør med PBS-løsningen og drenk, tørk helt og lagre for videre bruk.
5. Visualisering Perfused Axolotl
Merk: For å få et bilde av høy kvalitet, kan følgende parametere brukes: eksponering for 1,1 s, gevinst på 1x, metning på 1,0, forstørrelse på 2X.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Med DiI-farging kan sylinderens vaskulator lett visualiseres. Blodkar av dyr perfusert med det lipofile fargestoffet er umiddelbart synlige under et fluorescerende konfokalmikroskop. Figur 1 .1-1.5 er en skjematisk fremstilling av perfusjonsprotokollen. Etter perfusjon med det lyserøde fargestoffet, vil en vellykket perfused axolotl vises rosa. Ved å bruke et grønt fluorescerende filter på et konfokalt mikroskop vil det oppstå en rød utslipp av det vaskulære nettverket. DiI-fargingen skjer i alle kroppsvev når perfusjon er vellykket, inkludert halen, lemmer, gjenger og øyne ( figur 2A , figur 2B , figur 2C , figur 2D , repektivt). Unsuccessful perfusions resulterer i mangel på rødfarget vaskulatur eller i ujevn farging av karene.
Ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1: Skjematisk av perfusjonsprotokollen. Axolotls perfusjonert med det lipofile fargestoffet DiI, demonstrerer full farging av vaskulaturen ved avbildning. 1: Fulltliggende axolotl før perfusjonsforsøk. 2: Å åpne brystet på axolotl. 2: Axolotl med åpent brysthulrom. 3: Innsetting av 27 G-butterflynålen i aorta på axolotl. 4: Tubing bør først inneholde 0,7x PBS, deretter DiI-arbeidsløsningen, og til slutt 4% PFA. 5: Fullt perfuserte axolotter ser rosa ut. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bilder av en fullt perfused Axolotl. Bilder av aksolotl-vaskulaturen ble tatt ved bruk av et fluorescerende konfokalt mikroskop etter vellykket perfusjon med DiI-flekken. 2A: Hale. 2B: Fot. 2C: Gills. 2D: Øye. Imaging er gjort ved hjelp av et konfokalmikroskop med en grønt lysrørstrålefilterkube. Forstørrelse for bilder A, B, C og D er henholdsvis 1,74X, 2,16X, 1,18X og 5,69X. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Visualisering av aksolotlens vaskulat kan vellykkes gjennom perfusjon med det lipofile karbocyaninfargestoffet, DiI. I denne studien beskriver vi en romanprotokoll for perfusjon av axolotl med DiI ved hjelp av en peristaltisk pumpe. Vi viser også den påfølgende visualiseringen av aksolotlvaskulaturen ved hjelp av et fluorescerende konfokalmikroskop. Denne protokollen var en tilpasning av gnagere DiI perfusjonsprotokollen sett i Li et al. 7 , men store forskjeller mellom gnageren og axolotl krevde en revisjon av protokollen for å passe til aksolotl-modellen.
Denne studien diskuterer en metode for DiI perfusjon av axolotl for å kunne visualisere karet. Forskjeller i anatomien og fysiologien mellom salamander og gnager krever endringer i hovedaspekter av perfusjonen, inkludert plassering av nålinnsetting, perfusjonsmetode og de anvendte reagensene. For å achEn vellykket perfusjon, begrenset vi skaden som ble gjort på karossen på axolotl. Mens du åpnet brysthulen, ble det tatt forsiktighet for å fullt ut utsette hjertet og aorta mens du unngår skader eller skader på store blodårer. Begrensning av bruken av kirurgisk saks forhindret utilsiktet kutting av større fartøy mens små snitt opprettholdt kontroll over eksponeringen av hjerte og aorta. Suksesshastigheter for perfusjoner økte også når DiI-nålen ble satt inn via aorta, snarere enn direkte inn i hjertets kamre. Axolotl, i motsetning til musen, har et trekammerat hjerte, som bare inneholder en ventrikel med betydelig mindre muskulatur enn musens. På grunn av disse forskjellene måtte plasseringen av nålinnsatsen flyttes til den mer stabile aorta. Aorta var fast bestemt på å være den optimale plasseringen for innføring av perfusjonsnålen, da den er stor nok til punktering med en 27 G nål og har begrenset bevegelse. Bevegelsen var minimalFor å unngå utilsiktet fjerning eller glidning av perfusjonsnålen eller gjennom-gjennom-punktering av aorta. Kardiale perfusjoner ved bruk av ventrikkelen som et innsatspunkt viste seg å ha en mye lavere suksessrate enn de med et aortisk innføringspunkt. Feil punktering av vaskulaturen resulterte ofte i dannelse av emboli eller forhindret perfusjon, noe som resulterte i svært lave mengder vellykket vaskulær merking. Ved å bruke en klemmeholder for å holde sommerfuglnålen under perfusjon, har vi redusert bevegelsen, og dermed økt hastigheten på vellykkede perfusjoner. I tillegg, på grunn av delikatessen til axolotl-vevet, ble det i sammenligning med musen nødvendig en peristaltisk perfusjonspumpe, i motsetning til den manuelle perfusjon som tidligere ble brukt. Bruken av denne pumpen tillot en håndfri tilgang til aksolotl perfusjonen for å minimere feilaktig punktering av tynne vev. Perfusjoner var mislykket av mange flere grunner, inkludert gjennom-og-gjennom punktUre, koagulering og emboli. I tilfelle nålen ble satt inn i aorta og en annen punktering ble opprettet gjennom bakre veggen, ville DiI-løsningen strømme direkte inn i brysthulen i stedet for å passere gjennom den systemiske sirkulasjonen. I tillegg dannet blodet en blodpropp som kan hindre perfusjon når blodet forlot karet. Klumper og luftbobler kan også danne seg i vaskulaturen, forårsaker emboli som utelukker vellykket perfusjon. Til slutt, er denne protokollen inkorporert reagenser justert for å passe til aksolotl-osmolaliteten, som avviker vesentlig fra den for pattedyret. Tilpasning av denne protokollen og de betydelige endringene som er gjort for å passe aksolotl-modellen, vil hjelpe til med å forstå prosessen med revaskularisering av vev under regenerering.
DiI, som er rosa i farge, vil perfuse dyret og gi det en lys rosa fargetone. Vellykket perfused axolotl ble sterkt rosa til det blotte øye, med høytVaskulære områder som virker mer intensivt farget. Perfused dyr sett med et fluorescerende konfokalt mikroskop ved hjelp av et grønt filter kan visualiseres i det rød-oransje utslippspekteret. Vaskulatur ble best visualisert i tynnere vev som minimerte utilsiktet DiI-farging av ikke-vaskulært vev. Perfusjon av vevet med 4% Paraformaldehyd (PFA) umiddelbart etter DiI perfusjon bør gjøres for å fikse vevet.
DiI-perfusjoner er endepunktsforsøk for axolotl. Under prosedyren blir alt dyrets blod drenert og erstattet med 0,7x PBS, umiddelbart etterfulgt av DiI-løsning, og til slutt 4% PFA. Dette forstyrrer aksolotlens evne til å engasjere seg i vitale handlingen med gassutveksling og det mister evnen til å oksygenere kroppsvevet. På grunn av denne endpoint-karakteren fanger hver perfusjon bare et enkelt tidspunkt for vaskulær vekst, og dyret kan ikke perfusjoneres ytterligere på et senere tidspunkt. På grunn av denne tidsbegrensningenTing faktor, må flere dyr brukes for å beskrive et tidsforløp av vaskulær utvikling.
Denne DiI-protokollen, og modifikasjonene som brukes for å forbedre den, kan brukes til å markere og visualisere aksolotlens vaskulator. Siden axolotl er en viktig modellorganisme for studiet av regenerering, gir vellykkede perfusjoner muligheter til å forhøre angiogeneseprosessen under regenerering. Axolotl er en modell organisme for studiet av regenerering fordi det er et neotet dyr og derfor beholder en bemerkelsesverdig evne til å regenerere gjennom voksen alder 8 . Revaskulariseringsprosessen med regenererende vev er imidlertid ikke godt forstått, derfor gir tilpasningen av DiI perfusjonen til axolotl systemet muligheter til å forstå regenerering som ikke var tilgjengelig med pattedyrsmodellen. Perfusjonen av axolotl ved hjelp av DiI er en ny teknikk for studier av revasCularisering av regenererende vev i denne dyremodellen, derfor kan denne protokollen videre brukes til å forstå organogenese under utvikling og angiogenese under sykdom, så vel som bli brukt som et viktig verktøy under studien av regenerering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne undersøkelsen ble støttet av Brigham & Women's Hospital og March of Dimes. Forfatterne vil gjerne takke alle medlemmene av Whited Lab for deres støtte og råd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Peristaltic Pump | Marshall Scientific | RD-RP1 | |
| Perfusion tubing | Excelon Lab & Vacuum Tubing | 436901705 | size S1A |
| 27g butterfly needle | EXELint Medical Products | 26709 | |
| NaCl | AmericanBio | 7647-14-5 | |
| KCl | AmericanBio | 7747-40-7 | |
| Na2HPO4 | AmericanBio | 7558-79-4 | |
| NaH2PO4 | AmericanBio | 10049-21-5 | |
| Distilled water | |||
| HCl | AmericanBio | 7647-01-0 | |
| Glucose | ThermoFischer | A2494001 | |
| 1,1′-Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate | Sigma Aldrich | 468495 | |
| Ethanol (100% vol/vol) | Sigma Aldrich | 64-17-5 | |
| Surgical foreceps | Medline | MDG0748741 | |
| Polystyrene foam frame | any polystyrene foam square with an axolotl-shaped cut out | ||
| Surgical scissors | Medline | DYND04025 | |
| Scalpel | Medline | MDS15210 | |
| Absorbent underpad | Avacare Medical | PKUFSx | |
| Paper towels | |||
| Standard disposable transfer pipette | Fisherbrand | 50216954 | |
| Clamp stand | Adafruit | 291 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate | Sigma Aldrich | E10521 | Tricaine powder |
| Adult axolotl | |||
| MgSO4 | AmericanBio | 10034-99-8 | |
| CaCl2 | Sigma Aldrich | C1016-100G | |
| NaHCO3 | Sigma Aldrich | S5761-500G | |
| Plastic tanks | Varying size appropriate for the axolotl | ||
| Paraformaldehyde | Sigma Aldrich | 30525-89-4 | |
| Axolotl | |||
| Leica Microscope | Leica | M165 FC | |
| ET-CY3 Fluorescent Filter | Leica | M205FA/M165FC | |
| MS-222 |
References
- Giuvarasteanu, I. Scanning electron microscopy of vascular corrosion casts - standard method for studying microvessels. Rom J Morphol Embryo. 48 (3), 257-261 (2007).
- Hasan, M. R., Herz, J., Hermann, D. M., Doeppner, T. R. Intravascular perfusion of carbon black ink allows reliable visualization of cerebral vessels. J Vis Exp. (71), e4374 (2013).
- Minnich, B., Lametschwandtner, A. Scanning electron microscopy and vascular corrosion casting for the characterization of microvascular networks in human and animal tissues. Microscopy: Science, Technology, Applications, and Education. 1, 29-39 (2010).
- Honig, M., Hume, R. I. DiI and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 13, 333-335 (1989).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures. J Cell Biol. 103 (1), 171-187 (1986).
- Schwartz, M., Agranoff, B. W. Outgrowth and maintenance of neurites from cultured goldfish retinal ganglion cells. Brain Res. 206 (2), 331-343 (1981).
- Li, Y., Song, Y., Zhao, L., Gaidosh, G., Laties, A. M., Wen, R. Direct labeling and visualization of blood vessels with lipophilic carbocyanine dye DiI. Nat Protoc. 3 (11), 1703-1708 (2008).
- Kuo, T. H., Kowalko, J. E., DiTommaso, T., Nyambi, M., Montoro, D. T., Essner, J. J., Whited, J. L. Evidence of TALEN-mediated gene editing of an endogenous locus in axolotl. Regeneration. 2 (1), 37-43 (2015).
- Brockes, J. P., Kumar, A. Appendage Regeneration in Adult Vertebrates and Implications for Regenerative Medicine. Science. 310 (5756), 1919-1923 (2005).
- Smith, A. R., Wolpert, L. Nerves and angiogenesis in amphibian limb regeneration. Nature. 257 (5523), 224-225 (1975).
