Dette manuskriptet beskriver riktige Vibrio cholerae vedlikeholdsteknikker i tillegg til en rekke biokjemiske analyser, samlet brukt for rask og pålitelig differensiering mellom klinisk og miljøvennlig V. Koleraebiotyper i laboratorieinnstilling.
Den akvatiske gramnegative bakterien Vibrio cholerae er det etiologiske middel av den smittsomme gastrointestinale sykdommen kolera. På grunn av den globale forekomsten og alvorlighetsgraden av denne sykdommen, V. Kolerae har blitt grundig studert i både miljø- og laboratorieinnstillinger, og krever riktig vedlikeholds- og dyrkningsteknikker. Klassisk og El Tor er to hovedbiotyper som komponerer V. Cholerae O1 serogruppe, som hver viser unike genotypiske og fenotypiske egenskaper som gir pålitelige mekanismer for biotype karakterisering, og krever forskjellige virulensinducerende dyrkningsbetingelser. Uavhengig av biotypen av årsaksstammen for en gitt infeksjon eller utbrudd, omfatter standardbehandling for sykdommen rehydreringsterapi supplert med et regime av antibiotika. Imidlertid kan biotypeklassifisering være nødvendig for laboratorieundersøkelser og kan ha bredere virkninger på det biomedisinske feltet.I begynnelsen av 2000 ble kliniske isolater identifisert som utviser genotypiske og fenotypiske egenskaper fra både klassiske og El Tor-biotyper. De nylig identifiserte hybrider, kalt El Tor-varianter, har forårsaket klinisk og miljø-isolerende biotypidentifikasjon for å bli mer komplisert enn tidligere tradisjonelle enkeltanalysidentifikasjonsprotokoller. I tillegg til å beskrive V. Cholerae generelle vedlikeholds- og dyrkningsteknikker beskriver dette manuskriptet en serie genspesifikke ( ctxB og tcpA ) PCR-baserte genetiske skjermbilder og fenotypiske analyser (polymyksin B-resistens, citratmetabolisme, proteolytisk aktivitet, hemolytisk aktivitet, motilitet og glukosemetabolisme via Voges- Proskauer-analyse) kollektivt brukt til å karakterisere og / eller skille mellom klassiske og El Tor-biotyper. Sammen gir disse analysene en effektiv systematisk tilnærming som kan brukes som et alternativ, eller i tillegg til dyre, arbeidskrevende eksperimenter i karakterenV. Kolerae kliniske (og miljømessige) isolater.
Kolera er en sykdom i den distale tynntarmen forårsaket av forbruket av forurenset mat eller vann som inneholder den vandige Gram-negative bakterien Vibrio cholerae . Symptomer på kolera inkluderer oppkast og ukontrollabel vannaktig diaré, noe som fører til alvorlig dehydrering, som hvis den ikke behandles ordentlig, vil resultere i døden. V. Kolerae kan deles inn i over 200 serogrupper basert på strukturen av celleoverflate-lipopolysakkarid-O-antigenet. Imidlertid har bare 2 serogrupper, O1 og O139, vist epidemi- eller pandemisk potensial 1 , 2 . Videre har serogruppe O139 vært primært isolert til Sørøst-Asia 3 , 4 , mens serogruppe O1 distribueres over hele verden. Videre kan O1 serogruppen deles inn i 2 hovedbiotyper: klassisk og El Tor. Den klassiske biotypen var ansvarlig for den første 6 kolera pandemienS mellom 1817 og 1923. Den pågående syvende pandemien er et resultat av El Tor-biotypen, som globalt har fordrevet den klassiske biotypen i miljøet 5 , 6 , 7 . Nylig har stammer oppstått som inneholder kjennetegn ved både klassiske og El Tor biotyper 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 og har siden blitt betegnet El Tor varianter 13 , 17 . Noen El Tor varianter har vist forhøyede virulensegenskaper med raskere og alvorlig sykdomsprogresjon enn tidligere observert, understrekerBehovet for en mer omfattende tilnærming til agentidentifikasjon og forebygging og behandling av sykdommer 8 , 9 , 18 . Mens biotypidentifikasjon ikke umiddelbart diktiserer behandling, kan videre fremskritt i vaksineutvikling og fremtidige terapeutiske midler ha nytte av biotypeforskjell.
Den første serien av protokoller som er oppført her, vil gjøre det mulig for forskerne å opprettholde V på riktig måte. Koleraestammer i en laboratorieinnstilling. Konsistens og etterfølgende analyse krever lagerberedning og vekst av isolater, som ikke er biotypeavhengig. For å optimalisere induksjon av virulensgenekspresjon er det imidlertid nødvendig med uavhengige biotypespesifikke dyrkningsteknikker 19 . I tillegg er forberedelse for ulike genetiske og biokjemiske analyser skissert i dette manuskriptet.
Kollatoksin (CT) og toksin-ko-reGulert pilus (TCP) er to hovedvirulensfaktorer styrt av master regulator ToxT i begge biotyper av V. Cholerae O1 serogruppe 20 . CT er et todelt toksin bestående av fem CtxB Underenheter rundt en enkelt CtxA underenhet, og er ansvarlig for det hurtige elektrolyttabet forbundet med kolera. TCP er en type IV pilus kodet av tcp operon ( tcpABQCRDSTEF ), og er involvert i vedlegg og kolonisering av den distale tynntarmen. TcpA er det første genet av tcp operonen som koder for de enkelte pilinunderenheter som er essensielle for bygging av pilus 8 . Gensekvensen for ctxA er helt bevart mellom klassiske og El Tor-biotyper, mens ctxB og tcpA er forskjellig over de to biotyper, men konserveres innenfor hver biotype 8 . CtxB er helt bevart mellom biotyper unntatt ved to basisposiSatser (115 og 203). I El Tor-biotypen ligger thymin ved basestillinger 115 og 203, mens den klassiske biotypen inneholder cytosin ved disse basene. TcpA er helt konservert innen hver biotype, men varierer ved flere baser mellom biotyper. Disse genetiske skillene tjener som primære biotypeidentifikasjonsmarkører, og etter sekvensering av polymerasekjedereaksjons-PCR-amplifikasjonsproduktet, inkludert disse stedene, kan isolerte sekvenser sammenlignes med villtype (WT) klassisk O395 eller WT El Tor N16961 for å bestemme biotype-bakgrunnen Av henholdsvis CT og TCP i et gitt V. cholerae- isolat.
Tallrike protokoller er utviklet for å karakterisere fenotypiske forskjeller mellom de klassiske og El Tor biotyper 21 , 22 , 23 . Polymyxin B er et peptidantibiotikum som kompromitterer integriteten til den ytre cellemembranen i gramnegativ bacTeria og polymyxin B-resistens kan visualiseres gjennom polymyksin B-resistensanalysen 21 . Citrat er et primært substrat av Krebs syklus, og evnen til å metabolisere sitrat som en eneste karbonkilde kan bestemmes ved bruk av citratmetabolisme-analysen 22 . HapR koder for en global regulator og master quorum-sensing regulator i V. cholerae, HapR, som binder til ulike promotorregioner og regulerer gen- og operonuttrykk 24 . Noen patogene stammer av V. cholerae har en naturlig forekommende rammeskiftmutasjon i hapR- genet som har forårsaket denne tetthetsavhengig regulering av virulensgenuttrykk for å gå tapt 24 , 25 . Måling av HapR-regulert proteaseaktivitet ved bruk av melkeagarmedia gjør at forskeren kan identifisere hvorvidt en bestemt isolat inneholder en funksjonell HapR 23 . DeHemolyse assay tester for en stamme evne til å utskille hemolytiske enzymer som lyser røde blodceller; Graden av hemolyse kan visualiseres på blodagarplater 23 . Motilitet er ofte forbundet med virulens i V. cholerae og kan analyseres ved bruk av motilitetsagarplater 23 . Voges-Proskauer-analysen tester for en belastnings evne til å gjære glukose som en eneste karbonkilde og produsere biproduktet acetoin 21 . Med fremkomsten av El Tor-varianter er det vanskelig å forutsi resultatene av en gitt fenotypisk analyse uten omfattende genotypisk screening, og før avledningen av biotype-bakgrunnen av V. Kolerae- isolater, anbefales det å utføre denne sammenstillingen av analysene 23 og sammenligne resultatene med referanse stammer som i tabell 2 .
Her har vi avansert en rekke protokoller, som kollektivt bruker avoremetNtioned genotypiske og fenotypiske analyser for en mer omfattende tilnærming til karakterisering av V. Koleraebiotyper. Videre har vi beskrevet de genotype og fenotypiske forskjeller av kjent V. Cholerae El Tor-varianter (MQ1795 og BAA-2163), sammenlignet med vanlige biotype referansestammer (WT klassisk O395, WT El Tor C6706 og WT El Tor N16961; Tabell 1 ). Fremveksten av El Tor-varianter har presentert utfordringer for påliteligheten av tidligere anvendte enkeltassaybiotype karakteriseringsprotokoller; Imidlertid vil dette multiple assay identifikasjonssystemet tillate mer pålitelig karakterisering av klinisk og miljøvennlig V. Kolerae isolater.
Av de over 200 identifiserte V. Kolerae serogrupper, har kun O1 og O139 epidemisk potensial. O1 serogruppen kan deles inn i to biotyper: klassisk og El Tor. Imidlertid har hybridstammer, betegnet El Tor-varianter 13 , 17 , oppstått som besitter El Tor-biotypebakgrunnen, og har klassiske karakteristika 8 , 9 , 10 , 11 ,</…
The authors have nothing to disclose.
Forskning støttet av New Hampshire-INBRE gjennom en institusjonell utviklingspris (IDeA), P20GM103506, fra National Institute of General Medical Sciences of the NIH.
1 kb DNA Ladder | New England Biolabs | N3232S | https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder |
60% Glycerol | Calbiochem | 356352 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade—CAS-56-81-5—Calbiochem,EMD_BIO-356352 |
Agar | Becto, Dickinson and Co. | 214030 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch |
Agar with brain-heart infusion | Becto, Dickinson and Co. | 237500 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch |
Agarose | Peqlab | 732-2789 | https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&_dynSessConf=1766917479792147141&targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&lastLanguage=en&/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&_D%3AcurrentLanguage=+¤tLanguage=en&_D%3AlastLanguage=+&_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+ |
Anhydrous K2HPO4 | Fisher Scientific | P288-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&searchTerm=P288500&searchType=RAPID |
Blood Agar Plates | Remel | R01200 | Store at 4 °C; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar |
Boric Acid | Fisher Scientific | A73-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&searchTerm=A73500&searchType=RAPID |
Bromothymol Blue | Fisher Scientific | B388-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&searchTerm=B38810&searchType=RAPID |
Cirtric acid ·H2O | Fisher Scientific | S72836-3 | https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363 |
Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit | New England Biolabs | N0446S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset |
Disodium EDTA | Fisher Scientific | S311-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&searchTerm=S311500&searchType=RAPID |
DNA Clean & Concentrator™ -25 Kit | Zymo Research | D4007 | http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit |
GelGreen Nucleic Acid Stain | Biotium | 41005 | https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10000x-in-water/ |
Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer | Thermo Scientific | 840-208100 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100 |
Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit | Qiagen | 158567 | https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation |
HCl | Fisher Scientific | A144-212 | Corrosive; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&searchTerm=A144212&searchType=RAPID |
KCl | Fisher Scientific | P217-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&searchTerm=P217500&searchType=RAPID |
KH2PO4 | Fisher Scientific | P285-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&searchTerm=P285500&searchType=RAPID |
KOH | Fisher Scientific | P250-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&searchTerm=P250500&searchType=RAPID |
Le Loop | Decon Labs Inc. | MP190-25 | http://deconlabs.com/products/leloop/ |
Le Stab | Decon Labs Inc. | MP186-5 | http://deconlabs.com/products/lestab/ |
MgSO4·7H2O | Fisher Scientific | M63-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&searchTerm=M63500&searchType=RAPID |
Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System | Bio Rad Labs | 1704406 | http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373 |
MR-VP Broth | Difco | 216300 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | S374-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&searchTerm=S374500&searchType=RAPID |
NaCl | Fisher Scientific | S271-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&searchTerm=S27110&searchType=RAPID |
NaHCO3 | Fisher Scientific | S233-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&searchTerm=S233500&searchType=RAPID |
NaNH4HPO4·4H2O | Fisher Scientific | S218-500 | https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&searchTerm=S218500&searchType=RAPID |
NanoDrop Lite Spectrophtometer | Thermo Scientific | ND-LITE-PR | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR |
Nonfat dry milk | Nestle Carnation | N/A | N/A |
Peptone | Becto, Dickinson and Co. | 211677 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch |
Petri Dishes (100 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875712 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712 |
Petri Dishes (150 mm x 15 mm) | Fisher Scientific | FB0875714 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&searchTerm=FB0875714&searchType=RAPID |
Polymyxin B sulfate salt | Sigma-Aldrich | P1004-10MU | Store at 2-4 °C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en®ion=US |
Taq DNA Polymerase | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
Taq Reaction Buffer | New England Biolabs | M0273S | Store at -20 °C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer |
Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch™ | Bio Rad Labs | 1840148 | http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&_pageLabel=search_page&sfMode=search&sfStartNumber=1&clearQR=true&js=1&searchString=1840148&database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&tabName=DIVISIONNAME |
Triphenyltetrazolium chloride | Alfa Aesar | A10870 | https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/ |
Tris Base | Fisher Scientific | BP152-1 | https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&searchTerm=BP1521&searchType=RAPID |
Tris∙HCl | Calbiochem | 9310 | http://www.emdmillipore.com/US/en/product/OmniPur-TRIS-Hydrochloride—CAS-1185-53-1—Calbiochem,EMD_BIO-9310-OP |
Tryptone | Becto, Dickinson and Co. | 211705 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch |
Yeast Extract | Becto, Dickinson and Co. | 212750 | http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&parentCategory=&parentCategoryName=&categoryId=&categoryName=&searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch |
α-napthol | MP Biomedicals | 204189 | http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189 |