Methodenartikel

Umschaltbare akustische und optische Auflösung Photoakustische Mikroskopie für In vivo Kleintier-Blut-Vaskulatur-Bildgebung

DOI:

10.3791/55810

⸱

26. Juni 2017

 ,  , 
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

In diesem Artikel

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hier wird eine umschaltbare akustische Auflösung (AR) und eine optische Auflösung (OR) photoakustische Mikroskopie (AR-OR-PAM) -System gezeigt, die sowohl eine hochauflösende Bildgebung in flacher Tiefe als auch eine niedrige Auflösung der tiefen Gewebeabbildung auf der gleichen Probe in vivo ermöglicht .

Zusammenfassung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Photoakustische Mikroskopie (PAM) ist eine schnell wachsende Invivo- Imaging-Modalität, die sowohl Optik als auch Ultraschall kombiniert und so eine Durchdringung über den optischen Mittelweg (~ 1 mm in der Haut) mit hoher Auflösung ermöglicht. Durch die Kombination von optischem Absorptionskontrast mit der hohen räumlichen Auflösung von Ultraschall in einer einzigen Modalität kann diese Technik tiefes Gewebe durchdringen. Photoakustische Mikroskopie-Systeme können entweder eine niedrige akustische Auflösung und Sonde tief oder eine hohe optische Auflösung und Sonde flach haben. Es ist anspruchsvoll, eine hohe räumliche Auflösung und eine große Tiefendurchdringung mit einem einzigen System zu erreichen. Diese Arbeit stellt ein AR-OR-PAM-System dar, das sowohl hochauflösende Bildgebung in flachen Tiefen als auch in einer niederauflösenden Tiefgewebe-Bildgebung der gleichen Probe in vivo ermöglicht . Eine laterale Auflösung von 4 μm mit 1,4 mm Bildtiefe mittels optischer Fokussierung und einer lateralen Auflösung von 45 μm mit 7,8 mm Bildtiefe mittels akustischer Fokussierung waren erfolgreichMit dem kombinierten System demonstriert. Hier wird in vivo eine kleine Tier-Blutgefäß-Bildgebung durchgeführt, um ihre biologische Abbildungsfähigkeit zu demonstrieren.

Einleitung

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hochauflösende optische Bildgebungsmodalitäten wie optische Kohärenztomographie, konfokale Mikroskopie und Multiphotonenmikroskopie haben zahlreiche Vorteile. Die räumliche Auflösung nimmt jedoch deutlich ab, wenn die Bildgebungstiefe zunimmt. Dies liegt an der diffusen Natur des Lichttransports in Weichgeweben 1 , 2 . Die Integration von optischer Anregung und Ultraschall-Erkennung bietet eine Lösung, um die Herausforderung der hochauflösenden optischen Bildgebung in tiefen Geweben zu überwinden. Photoakustische Mikroskopie (PAM) ist eine solche Modalität, die eine tiefere Bildgebung bieten kann als andere optische Bildgebungsmodalitäten. Es wurde erfolgreich auf in vivo strukturelle, funktionelle, molekulare und zellbildende Bildgebung 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 angewendet , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Studien durch Kombination des starken optischen Absorptionskontrastes mit der hohen räumlichen Auflösung von Ultraschall.

In PAM bestrahlt ein kurzer Laserpuls das Gewebe / die Probe. Die Absorption von Licht durch Chromophore ( zB Melanin, Hämoglobin, Wasser etc. ) führt zu einer Temperaturerhöhung, was wiederum zur Erzeugung von Druckwellen in Form von akustischen Wellen (photoakustische Wellen) führt. Die erzeugten photoakustischen Wellen können durch einen Breitband-Ultraschallwandler außerhalb der Gewebegrenze detektiert werden. Unter Verwendung einer schwachen optischen und engen akustischen Fokussierung kann eine tiefe Gewebeabbildung in der akustischen Auflösung der photoakustischen Mikroskopie (AR-PAM) 14 , 15 , 16 erreicht werden . In AR-PAM, eine laterale Auflösung von 45 μm und eine Abbildungstiefe bis zu 3 mm wurden gezeigt 15 . Um akustisch einzelne Kapillaren (~ 5 μm) aufzulösen, sind Ultraschallwandler erforderlich, die bei> 400 MHz Zentralfrequenzen arbeiten. Bei solchen hohen Frequenzen beträgt die Eindringtiefe weniger als 100 μm. Das durch enge akustische Fokussierung verursachte Problem kann durch eine enge optische Fokussierung gelöst werden. Die optische Auflösung der photoakustischen Mikroskopie (OR-PAM) ist in der Lage, einzelne Kapillaren oder sogar eine einzelne Zelle 17 aufzulösen und eine laterale Auflösung von 0,5 μm wurde erreicht 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Die Verwendung eines photonischen Nanojet kann dazu beitragen, eine Auflösung über die beugungsbegrenzte Resolutio hinaus zu erreichenN 25 , 26 . Bei OR-PAM ist die Eindringtiefe durch Lichtfokussierung begrenzt und kann bis zu ~ 1,2 mm im Inneren des biologischen Gewebes 23 abbilden. Daher kann AR-PAM tiefer abbilden, aber mit einer niedrigeren Auflösung und OR-PAM kann mit einer sehr hohen Auflösung abbilden, aber mit begrenzter Bildtiefe. Die Abbildungsgeschwindigkeit des AR- und OR-PAM-Systems hängt hauptsächlich von der Pulswiederholrate der Laserquelle 27 ab .

Die Kombination von AR-PAM und OR-PAM wird für Anwendungen, die sowohl eine hohe Auflösung als auch eine tiefere Bildgebung erfordern, von großem Nutzen sein. Es wurde wenig Anstrengung unternommen, um diese Systeme zusammen zu kombinieren. In der Regel werden zwei verschiedene bildgebende Scanner für die Bildgebung verwendet, was erfordert, dass die Probe zwischen beiden Systemen bewegt wird, wodurch es schwierig wird, eine in vivo- Bildgebung durchzuführen. Allerdings ermöglicht die Hybrid-Bildgebung mit AR und OR PAM die Abbildung mit skalierbaren Auflösungen aTiefen. Bei einem Ansatz wird ein optisches Faserbündel verwendet, um Licht sowohl für das AR als auch das ODER-PAM zu liefern. Bei diesem Ansatz werden zwei getrennte Laser (ein hochenergetischer Laser bei 570 nm für den AR und ein niederenergetischer Hochfrequenz-Laser mit 532 nm für das ODER) verwendet, wodurch das System unpraktisch und teuer ist. Die ODER-PAM-Laserwellenlänge ist fixiert, und viele Studien, wie z. B. bei der Sauerstoffsättigung, sind mit diesem kombinierten System nicht möglich. Vergleichende Untersuchungen zwischen AR und OR PAM sind auch wegen der Differenz der Laserwellenlängen zwischen AR und OR nicht möglich. Darüber hinaus verwendet AR-PAM eine helle Feldbeleuchtung; Daher beeinflussen starke photoakustische Signale von der Hautoberfläche die Bildqualität. Aus diesem Grund kann das System nicht für viele Bioimaging-Anwendungen eingesetzt werden. In einem anderen Ansatz, um AR und OR PAM durchzuführen, wird der optische und Ultraschallfokus verschoben, was den Lichtfokus und den Ultraschallfokus unausgelegt macht. Damit ist die Bildqualität nicht optimal 29. Unter Verwendung dieser Technik können das AR-PAM und das OR-PAM nur 139 & mgr; m bzw. 21 & mgr; m Auflösungen erreichen, was es zu einem System mit schlechter Auflösung macht. Ein anderer Ansatz, der das Ändern der optischen Faser und der Kollimationsoptik beinhaltet, wurde berichtet, um zwischen AR und OR PAM umzuschalten, was den Ausrichtungsprozess schwierig macht 30 . In all diesen Fällen verwendete AR-PAM keine Dunkelfeldbeleuchtung. Die Verwendung von Dunkelfeldbeleuchtung kann die Erzeugung von starken photoakustischen Signalen von der Hautoberfläche reduzieren. Daher kann die Tiefgewebe-Bildgebung unter Verwendung einer ringförmigen Beleuchtung durchgeführt werden, da die Erfassungsempfindlichkeit von tiefen photoakustischen Signalen höher ist als bei der Hellfeldbeleuchtung.

Diese Arbeit berichtet über ein umschaltbares AR- und OR-PAM- (AR-OR-PAM) -Bildgebungssystem, das sowohl hochauflösende Bildverarbeitung als auch eine hochauflösende Tiefgewebe-Bildgebung der gleichen Probe mit dem gleichen Laser und Scanner für beide syst möglich istEms Die Leistung des AR-OR-PAM-Systems wurde durch die Bestimmung der räumlichen Auflösung und der Abbildungstiefe durch Phantom-Experimente charakterisiert. In vivo wurde die Blutgefäßbildgebung an einem Mausohr durchgeführt, um seine biologische Abbildungsfähigkeit zu demonstrieren.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Protokoll

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Tierversuche wurden nach den genehmigten Vorschriften und Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Nanyang Technological University, Singapur (Tierprotokoll Nr. ARF-SBS / NIE-A0263) durchgeführt.

1. AR-OR-PAM-System ( Abbildung 1 )

  1. Systemkonfiguration: AR-PAM
    1. Verwenden Sie ein nanosekundenabstimmbares Lasersystem bestehend aus einem diodengepumpten Festkörper-Nd-YAG-Laser (532 nm) und einem Farbstofflaser mit einem Abstimmbereich von 559-576 nm als optische Bestrahlungsquelle. Stellen Sie die Laserwellenlänge auf 570 nm mit einem externen Regler und der Wiederholrate des Lasers auf 1 kHz mit der Lasersoftware ein.
    2. Legen Sie einen Strahlprobennehmer in einen 45 ° -Winkel vor dem Laser, um 5% der Laserleistung auf eine Photodiode durch ein variables Neutral-Dichte-Filter (NDF1; OD = 0-4.0) abzulenken.
    3. Umlenkung des Laserstrahls nach dem Strahlprobennehmer bei 90 ° unter Verwendung vonEin rechtwinkliges Prisma (RAP1).
    4. Verwenden Sie ein anderes rechtwinkliges Prisma (RAP2), um dem Strahl zu ermöglichen, durch ein variables Neutral-Dichte-Filter (NDF2; OD = 0-4.0) und auf eine Multimode-Faser (MMF) zu gelangen, indem es es durch einen Faserkoppler (FC) -a leitet Kombination von Objektiven (numerische Apertur (NA): 0,25) und einem XY-Übersetzer.
    5. Fixieren Sie die Faser mit einem XY-Übersetzer auf die Scan-Stufe. Legen Sie eine plankonvexe Linse (L1) 25 mm vom Faserausgangsende weg, um den Strahl aus der Faser zu kollimieren.
    6. Führen Sie den kollimierten Strahl durch eine konische Linse mit einem Scheitelwinkel von 130 °, um einen ringförmigen Balken zu erzeugen. Der ringförmige Strahl wird mit einem hausgemachten optischen Kondensator (OC) mit Kegelwinkeln von 70 ° und 110 ° und mit einem Loch in der Mitte fokussiert.
    7. Legen Sie einen 50 MHz Ultraschallwandler (UST) mit einer akustischen Linse (AL) in der Mitte des hausgemachten Kondensators.
  2. Systemkonfiguration: OR-PAM
    1. Benutze einenNanosekunden-einstellbares Lasersystem bestehend aus einem diodengepumpten Festkörper-Nd-YAG-Laser (532 nm) und einem Farbstofflaser mit einem Abstimmbereich von 559 - 576 nm als optische Bestrahlungsquelle. Stellen Sie die Laserwellenlänge bei 570 nm mit einem externen Regler und der Wiederholrate des Lasers bei 5 kHz mit der Lasersoftware ein.
    2. Drehen Sie die computergesteuerte Rotationsstufe (Halten des RAP1) um 90 °, um den Laserstrahl auf eine Iris zum Umformen zu lenken.
    3. Dämpfen Sie den Laserstrahl, der einen variablen Neutral-Dichte-Filter (OD: 0-4.0) entlang des Strahls platziert und fokussiert dann den Strahl mit einer Kondensorlinse (CL). Führen Sie es durch ein Pinhole (PH) 75 mm weg von der CL für die räumliche Filterung.
    4. Starten Sie den räumlich gefilterten Strahl auf eine Einmodenfaser (SMF) mit einem Einmoden-Faserkoppler (FC), der aus einem 0,1 NA-Objektiv besteht, um den Lichtstrahl auf die SMF zu fokussieren.
    5. Stellen Sie den Faserkoppler ein, um eine maximale Kopplungseffizienz zu erreichen.
    6. Fixieren Sie die Faser auf tEr scannt mit einer Gleitplatte (SP). Legen Sie eine achromatische Linse (L2) 50 mm von der SM-Faser weg, um den Laserstrahl zu kollimieren.
    7. Umschalten des kollimierten Strahls um 90 ° mit einem kinematisch steuerbaren elliptischen Spiegel (M), um die hintere Blende einer anderen identischen achromatischen Linse (L3) zu füllen. Legen Sie die achromatische Linse für die Fokussierung auf eine Übersetzung mount (TM2) mit einem Objektiv Rohr (LT) verwendet.
    8. Führen Sie den Fokussierstrahl durch einen hausgemachten optoakustischen Strahlkombinierer, der aus einem rechtwinkligen Prisma (RA) und einem Rhomboidprisma (RP) besteht, mit einer Schicht aus Silikonöl (SO) dazwischen.
      HINWEIS: Die Silikonölschicht wirkt als optisch transparente und akustisch reflektierende Folie.
    9. Bringen Sie eine akustische Linse (AL) an, um eine akustische Fokussierung (Fokusdurchmesser: ~ 46 μm) am unteren Ende des Rhomboidprismas vorzusehen.
    10. Stellen Sie den Ultraschallwandler mit einer 50 MHz-Mittenfrequenz auf das Rhomboid-Prisma; Verwenden Sie eine Epoxidschicht für eine effektive Kupplung.

2. Systemumschaltung und Ausrichtung

  1. Befestigen Sie die hausgemachte schaltbare Platte auf eine 3-Achsen-Motorstufe, die durch einen an den Computer angeschlossenen 3-Achsen-Regler gesteuert wird.
  2. Befestigen Sie das AR- und ODER-Käfig-System an der hausgemachten Platte mit Käfig-Montagebügeln, um ein einfaches Umschalten zwischen den AR- und ODER-Scan-Köpfen zu ermöglichen. Schieben Sie den Scan-Kopf auf den Bildbereich.
  3. Verwenden Sie die Z-Stufe, um den unteren Teil des AR-OR-PAM-Scannerkopfes in einen wassergefüllten Acrylbehälter (13 cm x 30 cm x 3 cm) für die akustische Kopplung zu tauchen.
  4. Öffnen Sie ein Abbildungsfenster mit einem Durchmesser von 7 cm auf der Bodenplatte des Tanks und versiegeln Sie es mit einer Polyethylenmembran für optische und akustische Übertragung.
  5. Verwenden Sie einen Puls-Echo-Verstärker und ein Oszilloskop, um den Ultraschall-Messumformer im Fokus auszurichten.
    1. Stellen Sie die Verstärkung des Puls-Echo-Verstärkers auf 24 db im Sende- / Empfangsmodus ein.
    2. Verwenden Sie das Sync-Out-Signal frOm der Puls-Echo-Verstärker als Trigger und detektieren das rückgestreute Signal von einem Glasschieber (eingefügt aus dem Boden des Wassertanks) mit einem Oszilloskop.
      HINWEIS: Die Folie sollte ein schwarzes Tape haben.
    3. Bewegen Sie die Z-Achse, um die Amplitude des Puls-Echosignals zu maximieren (auf dem Oszilloskop gesehen).
      HINWEIS: Wenn die Glasplatte im Fokus ist, hat das Echo seine maximale Amplitude.
  6. Schalten Sie den Laser ein und verbinden Sie den UST mit zwei Verstärkern, jeweils mit 24 dB fester Verstärkung, mit BNC-Kabeln.
    HINWEIS: Die Ausgänge der Verstärker sind mit der Datenerfassungskarte (DAQ) verbunden.
  7. Verwenden Sie das Signal aus der Photodiode (PD), das vor dem Laser als Auslöser für das Datenerfassungssystem angeordnet ist.
  8. Im AR-PAM variieren Sie den Abstand zwischen der konischen Linse (con.L) und dem optischen Kondensator (OC), um die Amplitude des aus dem Testobjekt erzeugten photoakustischen Signals zu maximieren (schwarzes Band, das auf einem Glasschieber geklebt ist).Stellen Sie sicher, dass die optischen und akustischen Fokus konfokal sind, indem Sie die maximale photoakustische (PA) Signalamplitude bestimmen.
    1. Beachten Sie die Verzögerung der maximalen PA-Signale; Verwenden Sie diese später, um den Fokus in der Datenerfassungssoftware zu überprüfen.
  9. Lösen Sie die Schraube des Abtastkopfes und schalten Sie den Abtastkopf manuell von AR-PAM auf OR-PAM. Dann die Schrauben festziehen.
  10. In OR-PAM variieren Sie den Abstand zwischen dem fokussierenden achromatischen Dublett (innerhalb der Linsenröhre (LT)) und dem optoakustischen Kombinator, um die auf dem Oszilloskop angezeigte PA-Signalamplitude zu maximieren.
    1. Beachten Sie die Verzögerung der maximalen PA-Signale.
      HINWEIS: Für die Bestimmung der konfokalen Anordnung ist eine Feinabstimmung erforderlich.

3. Versuchsschritte

  1. Seitliche Auflösung und Bildgebungstiefe Quantifizierung
    1. Verwenden Sie Gold-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 100 nm, um die laterale Auflösung des AR an zu bestimmenD OR-System.
    2. Verdünnen Sie 0,1 ml Nanopartikellösung mit einer gleichen Menge Wasser. 0,1 ml verdünnte Lösung auf einen Deckel verteilen und mit der Polyethylenmembran unter dem Tank in Kontakt bringen.
    3. Vergewissern Sie sich, dass der AR-PAM und der OR-PAM vor dem Scannen in der Datenerfassungssoftware (siehe Tabelle der Materialien) fokussiert sind (Schritte 2.8 und 2.10).
      HINWEIS: Durch Kenntnis der Mikrosekundenverzögerung der maximalen PA-Signale aus den Schritten 2.9 und 2.10, multipliziert mit der Abtastrate (250 MS / s), wird das Bild in der Datenerfassungssoftware fokussiert. Die Verzögerung, die bei der Datenerfassung ausgelassen werden muss, kann in der Software ermittelt werden, um nur die notwendigen Datenpunkte für die Nachbearbeitung zu speichern.
    4. Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM und drücken Sie die "Scan" -Taste, um das Raster-Scannen zu starten.
      1. Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM in der Datenerfassungssoftware auf "4" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der "Geschwindigkeit"; Tab "1" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "0,5" mm im Register "Y-Scanbereich" und "0,5" mm im Register "X-Scanbereich". Setzen Sie die Schrittgröße in x-Richtung auf "4" μm in der Registerkarte "dx".
        HINWEIS: Die Schrittweite in y-Richtung wird automatisch aus der Abtastgeschwindigkeitsgeschwindigkeit der Bühne und der Pulswiederholrate (in diesem Fall 4.000 μm / 1.000 Hz = 4 μm) ermittelt,
    5. Setzen Sie die Scan-Parameter für den OR-PAM und drücken Sie die "Scan" -Taste, um die Raster-Scanning zu starten.
      1. Setzen Sie die Scan-Parameter in der Datenerfassungssoftware auf "2,5" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der Registerkarte "Geschwindigkeit", "5" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "0,5" mm im "Y-Scanbereich" Tab und "0,5" mm im Register "X-Scanbereich". Setzen Sie die Schrittgröße in der x-Richtung ein "0,5" μm in der Registerkarte "dx".
        HINWEIS: Die sDie Tep-Größe in y-Richtung wird automatisch aus der Abtastgeschwindigkeitsgeschwindigkeit der Stufe und der Pulswiederholrate (in diesem Fall 2.500 μm / 5.000 Hz = 0,5 μm) bestimmt.
    6. Stellen Sie sicher, dass während des Scanvorgangs die Daten kontinuierlich erfasst und auf dem Computer gespeichert werden
      HINWEIS: Die Daten werden nur in einer Bewegungsrichtung der Y-Stufe erfasst.
    7. Verwenden Sie die im Computer gespeicherten B-Scan-Daten, um die MAP-Bilder (Maximum Amplitude Projection) mit Hilfe der Bildverarbeitungssoftware abzurufen (siehe Tabelle der Materialien ).
    8. Verwenden Sie ein einzelnes Nanopartikelbild (aus mehreren Bildern) aus dem Scan, um die laterale Auflösung zu bestimmen, indem Sie eine Linie durch die zentrale Region des Nanopartikelbildes manuell plotten, um eine Punktspreizfunktion zu erhalten, die wie eine Gaußsche Kurve aussieht. Siehe Abbildung 2 .
    9. Passen Sie die Punkt-Spread-Funktion aus einem einzigen Nanopartikel Bild mit einem GauSsian passende Funktion und messen die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) mit Bildverarbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien ). Verwenden Sie diese als seitliche Auflösung. Siehe Abbildung 2 .
    10. Legen Sie ein Stück schwarzes Band schräg auf ein Stück geschnittenes Hühnergewebe als Zielobjekt für die Tiefenabbildung ein. Legen Sie das Gewebe mit dem Band in den Wassertank.
      HINWEIS: Das schwarze Band ist mit einer scharfen Spitze an einer Metallplatte befestigt, was hilft, das Band an das Gewebe zu befestigen.
    11. Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM in die Datenerfassungssoftware und drücken Sie dann die "Scan" -Taste, um ein einzelnes B-Scan-Bild zu erfassen, um die maximale Bildtiefe zu bestimmen.
      1. Setzen Sie die Scan-Parameter auf "15" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der Registerkarte "Velocity", "1" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "5" cm im Register "Y-Scan Bereich" und "0,1 "Mm im Register" X-Scanbereich ". Set tEr schritt in der x-Richtung bei "0,1" mm in der Registerkarte "dx".
    12. Setzen Sie die Scan-Parameter für den OR-PAM und drücken Sie die "Scan" -Taste, um ein einzelnes B-Scan-Bild zu erfassen, um die maximale Bildaufnahme zu bestimmen.
      1. Setzen Sie die Scan-Parameter in der Datenerfassungssoftware als "15" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der Registerkarte "Geschwindigkeit", "5" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "2" cm im "Y-Scanbereich" Tab und "0,1" mm im Register "X-Scanbereich". Setzen Sie die Schrittgröße in x-Richtung auf "0,1" mm in der Registerkarte "dx".
        HINWEIS: Da der X-Scanbereich und dx gleich sind, wird nur ein B-Scan erfasst. Die zeitaufgelösten PA-Signale multipliziert mit der Schallgeschwindigkeit in Weichgewebe (1.540 m / s) ergeben ein A-Linienbild. Mehrere A-Linien werden während der kontinuierlichen Bewegung der Y-Stufe erfasst, um einen B-Scan zu erzeugen.
  2. In vivo </ Em> Bildgebung der Maus Ohr Blutgefäße
    1. Verwenden Sie eine weibliche Maus mit einem Körpergewicht von 25 g und einem Alter von 4 Wochen.
    2. Das Tier mit einem Cocktail aus Ketamin (120 mg / kg) und Xylazin (16 mg / kg) intraperitoneal injiziert (Dosierung von 0,1 ml / 10 g) anästhesieren.
    3. Entfernen Sie die Haare aus dem Tier Ohr mit Haarentfernung Creme. Wischen Sie den Bereich sauber. Decken Sie das Auge des Tieres mit einer sterilen Augensalbe ab, um zu vermeiden, dass jeder gestreute Laserstrahl auf die Augen fällt.
    4. Positioniere das Tier auf eine Bühne, die auch eine Miniaturplatte hat, um das Ohr zu positionieren.
    5. Die Anästhesie mit inhaliertem Isofluran (0,75% in 1 l / min Sauerstoff) während der Bildgebung beibehalten.
    6. Klemmen Sie ein Pulsoximeter an die Maus Bein oder Schwanz und überwachen den physiologischen Status. Lassen Sie den Bildgebungsbereich mit Ultraschallgel in Kontakt mit der Polyethylenmembran gelangen.
    7. Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM und drücken Sie die "Scan" -Taste, um den Raster-Scanner zu startenIng.
      1. Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM in der Datenerfassungssoftware auf "15" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der Registerkarte "Geschwindigkeit", "1" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "10 mm" im " Y-Scan-Bereich "und" 6 "mm im Register" X-Scan-Bereich ". Setzen Sie die Schrittgröße in x-Richtung als "30" μm in der Registerkarte "dx".
        HINWEIS: Die Schrittgröße in y-Richtung wird automatisch aus der Abtastgeschwindigkeitsgeschwindigkeit der Bühne und der Pulswiederholrate (in diesem Fall 15.000 μm / 1.000 Hz = 15 μm) ermittelt.
    8. Nach Beendigung des AR-PAM-Scans schalten Sie die Bildkopfposition von AR-PAM auf OR-PAM (wie in Abschnitt 2 beschrieben).
    9. Setzen Sie die Scan-Parameter für den OR-PAM und drücken Sie die "Scan" -Taste, um die Raster-Scanning zu starten.
      1. Setzen Sie die Scan-Parameter für den OR-PAM in der Datenerfassungssoftware auf "15" mm / s Scan-Geschwindigkeit im "Velocit"Y "," 5 "kHz in der Registerkarte" Pulswiederholrate "," 10 "mm im Register" Y-Scanbereich "und" 6 "mm im Register" X-Scanbereich " In x-Richtung als "6" μm in der Registerkarte "dx"
        HINWEIS: Die Schrittweite in y-Richtung wird automatisch aus der Abtastgeschwindigkeitsgeschwindigkeit der Bühne und der Pulswiederholrate (in diesem Fall 15.000 μm / 5.000 Hz = 2 μm) ermittelt.
    10. Verwenden Sie die im Computer gespeicherten B-Scan-Daten, um die MAP-Bilder mit der Bildverarbeitungssoftware abzurufen.
    11. Beobachten Sie das Tier während der gesamten Bildgebung.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Ergebnisse

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Der Schaltplan des AR-OR-PAM-Systems ist in Abbildung 1 dargestellt . In diesem Setup wurden alle Komponenten integriert und in einem optischen Käfigaufbau zusammengebaut. Durch die Verwendung eines Käfigsystems wird der AR-OR-PAM-Abtastkopf kompakt und einfach zusammengebaut, ausgerichtet und auf eine einzige Scan-Stufe integriert.

Eine zweidimensionale kontinuierliche Rasterabtastung des Bildkop...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Diskussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Abschließend wurde ein umschaltbares AR- und OR-PAM-System entwickelt, das sowohl eine hochauflösende Bildgebung bei niedrigeren Bildtiefen als auch eine niedrigere Auflösung bei höheren Bildtiefen erreichen kann. Die laterale Auflösung und die Bildgebungstiefe des schaltbaren Systems wurde bestimmt. Die Vorteile dieses schaltbaren PAM-Systems sind: (1) die hochauflösende Bildgebung mit enger optischer Fokussierung; (2) die Tiefgewebe-Bildgebung mittels akustischer Fokussierung; 3) die Dunkelfeldbeleuchtung für AR-PAM, ...

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Offenlegungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Alle Tierversuche wurden nach den genehmigten Richtlinien und Vorschriften des Institutional Animal Care and Use Committee der Nanyang Technological University, Singapur (Tierprotokoll Nr. ARF-SBS / NIE-A0263) durchgeführt. Die Autoren haben keine relevanten finanziellen Interessen im Manuskript und keine anderen potenziellen Interessenkonflikte zu offenbaren.

Danksagungen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Die Autoren möchten die finanzielle Unterstützung aus einem von dem Bildungsministerium in Singapur geförderten Tier 2-Stipendium anerkennen (ARC2 / 15: M4020238). Die Autoren danken auch Herrn Chow Wai Hoong Bobby für den Maschinenladen helfen.

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
gütegeschalteter Nd:YAG-LaserEdgewaveBX80-2-LPumplaser
Credo-High Repetition Rate Dye LaserSpectra physicsCREDO-DYE-NDye Laser
Precision Linear StagePhysik InstrumentePLS 85 XY-Raster-Scantisch
ÜbersetzungsstufePhysik InstrumenteVT 80 Konfokale Bestimmung
Montierte Silizium-FotodiodeThorlabsSM05PD1ATriggerung/Impulsvariation
Motorisierter kontinuierlicher Rotationstisch ThorlabsCR1/M-Z7Umlenk-Laserstrahl
montiert Stufenlos verstellbarer ND-FilterThorlabsNDC-50C-4MIntensität variables
Faser-PatchkabelThorlabsM29L01Multimode-Fasermikroskop
ObjektivNewportM-10XObjektiv
XY-Konverter-FassungThorlabsCXY1Übersetzende Fassung
Plankonvexe LinseThorlabsLA1951Kollimationslinse
Konische Linse AltechnaAPX-2-B254Ringförmiger Strahl
TranslationstischThorlabsCT1Übersetzungstisch
Optischer KondensorHausgemachter
UltraschallwandlerOlympus-NDTV214-BB-RM50MHz Wandler
Plankonkave LinseThorlabsLC4573Akustische Linse
Impulsgeber/EmpfängerOlympus-NDT5073PRImpuls-Echo-Verstärker
Gefasste Standard-BlendeThorlabsID12/MStrahlformung
Plankonvexe LinseThorlabsLA4327Kondensorlinse
Gefasste Präzisions-LochblendeThorlabsP50SRäumliche Filterung
Singlemode-Glasfaser-PatchkabelThorlabsP1-460B-FC-1Singlemode-Faserkoppler
FaserkopplerNewportF-91-C1Singlemode Kopplung
Achromatisches Dublett-ObjektivEdmund Optics32-317Achromatisches Dublett
Geschützter silberner EllipsenspiegelThorlabsPFE10-P01Spiegel
Rechtwinklige kinematische SpiegelhalterungThorlabsKCB1Spiegelhalterung
Z-Achse TranslationshalterungThorlabsSM1Zz translator
LinsentubusThorlabs
UV-Quarzglas Rechtwinkliges PrismaThorlabsPS615Rechtwinkliges Prisma
RhomboidprismaEdmund Optics47-214Scherwelle
DimethylpolysiloxanSigma AldrichDMPS1MSilikonöl
VerstärkerMini-SchaltungenZFL-500LNVerstärker
16 Bit Hochgeschwindigkeits-DigitizerSpektrumM4i.4420Datenerfassungskarte
OszilloskopAgilent TechnologiesDS06014A
Mäuse InVivos Pte.LtdICRTiermodell
Ultraschallgel  Progress/Parker Acquasonic GelPA-GEL-CLEA-5000Akustische Kopplung
WassertankHausgemacht
ÜbersetzungsstufeHausgemachtSchalten AR-OR
Gold NanopartikelSigma Aldrich742031Laterale Auflösung
Sterile AugensalbeAlconDuratearsTierbildgebung
1951 USAF Auflösungstest-TargetEdmund Optics38257Konfokale Ausrichtung
DatenerfassungssoftwareNational InstrumentLabviewEigenentwicklung mit Labview
BildverarbeitungssoftwareMathworksMatlabEigenentwicklung mit Matlab
SM05L10

Referenzen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).
  2. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
  3. Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nat Methods. 13, 627-638 (2016).
  4. Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V. Tutorial on photoacoustic tomography. J Biomed Opt. 21 (6), 061007(2016).
  5. Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. BioMed Res Intl. 2015, (2015).
  6. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).
  7. Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
  8. Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. 1 (4), 602-631 (2011).
  9. Pan, D. Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons. FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).
  10. Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue. J Biomed Opt. 16 (4), 046017(2011).
  11. Pan, D. Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons. Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).
  12. Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).
  13. Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy. Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).
  14. Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. Acoustic resolution photoacoustic microscopy. Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).
  15. Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
  16. Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy. Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).
  17. Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215(2016).
  18. Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner. Sci Rep. 5, 07932(2015).
  19. Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves. J Biomed Opt. 19 (1), 016004(2014).
  20. Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V. Near-infrared optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt Lett. 39 (17), 5192-5195 (2014).
  21. Danielli, A. Label-free photoacoustic nanoscopy. J Biomed Opt. 19 (8), 086006(2014).
  22. Zhang, C. Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 17 (2), 020501(2012).
  23. Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).
  24. Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
  25. Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study. J Biomed Opt. 22, 045001(2017).
  26. Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003(2014).
  27. Allen, T. J. Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al. Proc SPIE. , 97080W(2016).
  28. Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle. Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).
  29. Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution. Laser Phys Lett. 11 (4), 045601(2014).
  30. Jeon, S., Kim, J., Kim, C. In vivo switchable optica- and acoustic - resolution photoacoustic microscopy. Proc SPIE. , 970845(2016).
  31. Song, W. Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo. Sci Rep. 6, 32240(2016).
  32. Park, J., et al. Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10(2016).
  33. ANSI Standard Z136.1-2000. American National Standard for Safe Use of Lasers. , NY. (2000).
  34. Moothanchery, M., Pramanik, M. Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System. Sensors. 17 (2), 357(2017).

Zugriff eingeschränkt. Bitte melden Sie sich an oder starten Sie eine Testversion, um diesen Inhalt anzuzeigen.

Nachdrucke und Genehmigungen

Genehmigung beantragen, um den Text oder die Abbildungen dieses JoVE-Artikels zu verwenden

Genehmigung beantragen

Schlagwörter

Schaltbare AR OR PAMIn vivo Bildgebungakustische Aufl sunglaterale Aufl sungBildgebungstiefeOhr von KleintierenNanosekundenlaser

Verwandte Artikel