Summary
Hier wird eine umschaltbare akustische Auflösung (AR) und eine optische Auflösung (OR) photoakustische Mikroskopie (AR-OR-PAM) -System gezeigt, die sowohl eine hochauflösende Bildgebung in flacher Tiefe als auch eine niedrige Auflösung der tiefen Gewebeabbildung auf der gleichen Probe in vivo ermöglicht .
Abstract
Photoakustische Mikroskopie (PAM) ist eine schnell wachsende Invivo- Imaging-Modalität, die sowohl Optik als auch Ultraschall kombiniert und so eine Durchdringung über den optischen Mittelweg (~ 1 mm in der Haut) mit hoher Auflösung ermöglicht. Durch die Kombination von optischem Absorptionskontrast mit der hohen räumlichen Auflösung von Ultraschall in einer einzigen Modalität kann diese Technik tiefes Gewebe durchdringen. Photoakustische Mikroskopie-Systeme können entweder eine niedrige akustische Auflösung und Sonde tief oder eine hohe optische Auflösung und Sonde flach haben. Es ist anspruchsvoll, eine hohe räumliche Auflösung und eine große Tiefendurchdringung mit einem einzigen System zu erreichen. Diese Arbeit stellt ein AR-OR-PAM-System dar, das sowohl hochauflösende Bildgebung in flachen Tiefen als auch in einer niederauflösenden Tiefgewebe-Bildgebung der gleichen Probe in vivo ermöglicht . Eine laterale Auflösung von 4 μm mit 1,4 mm Bildtiefe mittels optischer Fokussierung und einer lateralen Auflösung von 45 μm mit 7,8 mm Bildtiefe mittels akustischer Fokussierung waren erfolgreichMit dem kombinierten System demonstriert. Hier wird in vivo eine kleine Tier-Blutgefäß-Bildgebung durchgeführt, um ihre biologische Abbildungsfähigkeit zu demonstrieren.
Introduction
Hochauflösende optische Bildgebungsmodalitäten wie optische Kohärenztomographie, konfokale Mikroskopie und Multiphotonenmikroskopie haben zahlreiche Vorteile. Die räumliche Auflösung nimmt jedoch deutlich ab, wenn die Bildgebungstiefe zunimmt. Dies liegt an der diffusen Natur des Lichttransports in Weichgeweben 1 , 2 . Die Integration von optischer Anregung und Ultraschall-Erkennung bietet eine Lösung, um die Herausforderung der hochauflösenden optischen Bildgebung in tiefen Geweben zu überwinden. Photoakustische Mikroskopie (PAM) ist eine solche Modalität, die eine tiefere Bildgebung bieten kann als andere optische Bildgebungsmodalitäten. Es wurde erfolgreich auf in vivo strukturelle, funktionelle, molekulare und zellbildende Bildgebung 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 angewendet , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 Studien durch Kombination des starken optischen Absorptionskontrastes mit der hohen räumlichen Auflösung von Ultraschall.
In PAM bestrahlt ein kurzer Laserpuls das Gewebe / die Probe. Die Absorption von Licht durch Chromophore ( zB Melanin, Hämoglobin, Wasser etc. ) führt zu einer Temperaturerhöhung, was wiederum zur Erzeugung von Druckwellen in Form von akustischen Wellen (photoakustische Wellen) führt. Die erzeugten photoakustischen Wellen können durch einen Breitband-Ultraschallwandler außerhalb der Gewebegrenze detektiert werden. Unter Verwendung einer schwachen optischen und engen akustischen Fokussierung kann eine tiefe Gewebeabbildung in der akustischen Auflösung der photoakustischen Mikroskopie (AR-PAM) 14 , 15 , 16 erreicht werden . In AR-PAM, eine laterale Auflösung von 45 μm und eine Abbildungstiefe bis zu 3 mm wurden gezeigt 15 . Um akustisch einzelne Kapillaren (~ 5 μm) aufzulösen, sind Ultraschallwandler erforderlich, die bei> 400 MHz Zentralfrequenzen arbeiten. Bei solchen hohen Frequenzen beträgt die Eindringtiefe weniger als 100 μm. Das durch enge akustische Fokussierung verursachte Problem kann durch eine enge optische Fokussierung gelöst werden. Die optische Auflösung der photoakustischen Mikroskopie (OR-PAM) ist in der Lage, einzelne Kapillaren oder sogar eine einzelne Zelle 17 aufzulösen und eine laterale Auflösung von 0,5 μm wurde erreicht 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Die Verwendung eines photonischen Nanojet kann dazu beitragen, eine Auflösung über die beugungsbegrenzte Resolutio hinaus zu erreichenN 25 , 26 . Bei OR-PAM ist die Eindringtiefe durch Lichtfokussierung begrenzt und kann bis zu ~ 1,2 mm im Inneren des biologischen Gewebes 23 abbilden. Daher kann AR-PAM tiefer abbilden, aber mit einer niedrigeren Auflösung und OR-PAM kann mit einer sehr hohen Auflösung abbilden, aber mit begrenzter Bildtiefe. Die Abbildungsgeschwindigkeit des AR- und OR-PAM-Systems hängt hauptsächlich von der Pulswiederholrate der Laserquelle 27 ab .
Die Kombination von AR-PAM und OR-PAM wird für Anwendungen, die sowohl eine hohe Auflösung als auch eine tiefere Bildgebung erfordern, von großem Nutzen sein. Es wurde wenig Anstrengung unternommen, um diese Systeme zusammen zu kombinieren. In der Regel werden zwei verschiedene bildgebende Scanner für die Bildgebung verwendet, was erfordert, dass die Probe zwischen beiden Systemen bewegt wird, wodurch es schwierig wird, eine in vivo- Bildgebung durchzuführen. Allerdings ermöglicht die Hybrid-Bildgebung mit AR und OR PAM die Abbildung mit skalierbaren Auflösungen aTiefen. Bei einem Ansatz wird ein optisches Faserbündel verwendet, um Licht sowohl für das AR als auch das ODER-PAM zu liefern. Bei diesem Ansatz werden zwei getrennte Laser (ein hochenergetischer Laser bei 570 nm für den AR und ein niederenergetischer Hochfrequenz-Laser mit 532 nm für das ODER) verwendet, wodurch das System unpraktisch und teuer ist. Die ODER-PAM-Laserwellenlänge ist fixiert, und viele Studien, wie z. B. bei der Sauerstoffsättigung, sind mit diesem kombinierten System nicht möglich. Vergleichende Untersuchungen zwischen AR und OR PAM sind auch wegen der Differenz der Laserwellenlängen zwischen AR und OR nicht möglich. Darüber hinaus verwendet AR-PAM eine helle Feldbeleuchtung; Daher beeinflussen starke photoakustische Signale von der Hautoberfläche die Bildqualität. Aus diesem Grund kann das System nicht für viele Bioimaging-Anwendungen eingesetzt werden. In einem anderen Ansatz, um AR und OR PAM durchzuführen, wird der optische und Ultraschallfokus verschoben, was den Lichtfokus und den Ultraschallfokus unausgelegt macht. Damit ist die Bildqualität nicht optimal 30 . In all diesen Fällen verwendete AR-PAM keine Dunkelfeldbeleuchtung. Die Verwendung von Dunkelfeldbeleuchtung kann die Erzeugung von starken photoakustischen Signalen von der Hautoberfläche reduzieren. Daher kann die Tiefgewebe-Bildgebung unter Verwendung einer ringförmigen Beleuchtung durchgeführt werden, da die Erfassungsempfindlichkeit von tiefen photoakustischen Signalen höher ist als bei der Hellfeldbeleuchtung.
Diese Arbeit berichtet über ein umschaltbares AR- und OR-PAM- (AR-OR-PAM) -Bildgebungssystem, das sowohl hochauflösende Bildverarbeitung als auch eine hochauflösende Tiefgewebe-Bildgebung der gleichen Probe mit dem gleichen Laser und Scanner für beide syst möglich istEms Die Leistung des AR-OR-PAM-Systems wurde durch die Bestimmung der räumlichen Auflösung und der Abbildungstiefe durch Phantom-Experimente charakterisiert. In vivo wurde die Blutgefäßbildgebung an einem Mausohr durchgeführt, um seine biologische Abbildungsfähigkeit zu demonstrieren.
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Protocol
Alle Tierversuche wurden nach den genehmigten Vorschriften und Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee der Nanyang Technological University, Singapur (Tierprotokoll Nr. ARF-SBS / NIE-A0263) durchgeführt.
1. AR-OR-PAM-System ( Abbildung 1 )
- Systemkonfiguration: AR-PAM
- Verwenden Sie ein nanosekundenabstimmbares Lasersystem bestehend aus einem diodengepumpten Festkörper-Nd-YAG-Laser (532 nm) und einem Farbstofflaser mit einem Abstimmbereich von 559-576 nm als optische Bestrahlungsquelle. Stellen Sie die Laserwellenlänge auf 570 nm mit einem externen Regler und der Wiederholrate des Lasers auf 1 kHz mit der Lasersoftware ein.
- Legen Sie einen Strahlprobennehmer in einen 45 ° -Winkel vor dem Laser, um 5% der Laserleistung auf eine Photodiode durch ein variables Neutral-Dichte-Filter (NDF1; OD = 0-4.0) abzulenken.
- Umlenkung des Laserstrahls nach dem Strahlprobennehmer bei 90 ° unter Verwendung vonEin rechtwinkliges Prisma (RAP1).
- Verwenden Sie ein anderes rechtwinkliges Prisma (RAP2), um dem Strahl zu ermöglichen, durch ein variables Neutral-Dichte-Filter (NDF2; OD = 0-4.0) und auf eine Multimode-Faser (MMF) zu gelangen, indem es es durch einen Faserkoppler (FC) -a leitet Kombination von Objektiven (numerische Apertur (NA): 0,25) und einem XY-Übersetzer.
- Fixieren Sie die Faser mit einem XY-Übersetzer auf die Scan-Stufe. Legen Sie eine plankonvexe Linse (L1) 25 mm vom Faserausgangsende weg, um den Strahl aus der Faser zu kollimieren.
- Führen Sie den kollimierten Strahl durch eine konische Linse mit einem Scheitelwinkel von 130 °, um einen ringförmigen Balken zu erzeugen. Der ringförmige Strahl wird mit einem hausgemachten optischen Kondensator (OC) mit Kegelwinkeln von 70 ° und 110 ° und mit einem Loch in der Mitte fokussiert.
- Legen Sie einen 50 MHz Ultraschallwandler (UST) mit einer akustischen Linse (AL) in der Mitte des hausgemachten Kondensators.
- Systemkonfiguration: OR-PAM
- Benutze einenNanosekunden-einstellbares Lasersystem bestehend aus einem diodengepumpten Festkörper-Nd-YAG-Laser (532 nm) und einem Farbstofflaser mit einem Abstimmbereich von 559 - 576 nm als optische Bestrahlungsquelle. Stellen Sie die Laserwellenlänge bei 570 nm mit einem externen Regler und der Wiederholrate des Lasers bei 5 kHz mit der Lasersoftware ein.
- Drehen Sie die computergesteuerte Rotationsstufe (Halten des RAP1) um 90 °, um den Laserstrahl auf eine Iris zum Umformen zu lenken.
- Dämpfen Sie den Laserstrahl, der einen variablen Neutral-Dichte-Filter (OD: 0-4.0) entlang des Strahls platziert und fokussiert dann den Strahl mit einer Kondensorlinse (CL). Führen Sie es durch ein Pinhole (PH) 75 mm weg von der CL für die räumliche Filterung.
- Starten Sie den räumlich gefilterten Strahl auf eine Einmodenfaser (SMF) mit einem Einmoden-Faserkoppler (FC), der aus einem 0,1 NA-Objektiv besteht, um den Lichtstrahl auf die SMF zu fokussieren.
- Stellen Sie den Faserkoppler ein, um eine maximale Kopplungseffizienz zu erreichen.
- Fixieren Sie die Faser auf tEr scannt mit einer Gleitplatte (SP). Legen Sie eine achromatische Linse (L2) 50 mm von der SM-Faser weg, um den Laserstrahl zu kollimieren.
- Umschalten des kollimierten Strahls um 90 ° mit einem kinematisch steuerbaren elliptischen Spiegel (M), um die hintere Blende einer anderen identischen achromatischen Linse (L3) zu füllen. Legen Sie die achromatische Linse für die Fokussierung auf eine Übersetzung mount (TM2) mit einem Objektiv Rohr (LT) verwendet.
- Führen Sie den Fokussierstrahl durch einen hausgemachten optoakustischen Strahlkombinierer, der aus einem rechtwinkligen Prisma (RA) und einem Rhomboidprisma (RP) besteht, mit einer Schicht aus Silikonöl (SO) dazwischen.
HINWEIS: Die Silikonölschicht wirkt als optisch transparente und akustisch reflektierende Folie. - Bringen Sie eine akustische Linse (AL) an, um eine akustische Fokussierung (Fokusdurchmesser: ~ 46 μm) am unteren Ende des Rhomboidprismas vorzusehen.
- Stellen Sie den Ultraschallwandler mit einer 50 MHz-Mittenfrequenz auf das Rhomboid-Prisma; Verwenden Sie eine Epoxidschicht für eine effektive Kupplung.
2. Systemumschaltung und Ausrichtung - Befestigen Sie die hausgemachte schaltbare Platte auf eine 3-Achsen-Motorstufe, die durch einen an den Computer angeschlossenen 3-Achsen-Regler gesteuert wird.
- Befestigen Sie das AR- und ODER-Käfig-System an der hausgemachten Platte mit Käfig-Montagebügeln, um ein einfaches Umschalten zwischen den AR- und ODER-Scan-Köpfen zu ermöglichen. Schieben Sie den Scan-Kopf auf den Bildbereich.
- Verwenden Sie die Z-Stufe, um den unteren Teil des AR-OR-PAM-Scannerkopfes in einen wassergefüllten Acrylbehälter (13 cm x 30 cm x 3 cm) für die akustische Kopplung zu tauchen.
- Öffnen Sie ein Abbildungsfenster mit einem Durchmesser von 7 cm auf der Bodenplatte des Tanks und versiegeln Sie es mit einer Polyethylenmembran für optische und akustische Übertragung.
- Verwenden Sie einen Puls-Echo-Verstärker und ein Oszilloskop, um den Ultraschall-Messumformer im Fokus auszurichten.
- Stellen Sie die Verstärkung des Puls-Echo-Verstärkers auf 24 db im Sende- / Empfangsmodus ein.
- Verwenden Sie das Sync-Out-Signal frOm der Puls-Echo-Verstärker als Trigger und detektieren das rückgestreute Signal von einem Glasschieber (eingefügt aus dem Boden des Wassertanks) mit einem Oszilloskop.
HINWEIS: Die Folie sollte ein schwarzes Tape haben. - Bewegen Sie die Z-Achse, um die Amplitude des Puls-Echosignals zu maximieren (auf dem Oszilloskop gesehen).
HINWEIS: Wenn die Glasplatte im Fokus ist, hat das Echo seine maximale Amplitude.
- Schalten Sie den Laser ein und verbinden Sie den UST mit zwei Verstärkern, jeweils mit 24 dB fester Verstärkung, mit BNC-Kabeln.
HINWEIS: Die Ausgänge der Verstärker sind mit der Datenerfassungskarte (DAQ) verbunden. - Verwenden Sie das Signal aus der Photodiode (PD), das vor dem Laser als Auslöser für das Datenerfassungssystem angeordnet ist.
- Im AR-PAM variieren Sie den Abstand zwischen der konischen Linse (con.L) und dem optischen Kondensator (OC), um die Amplitude des aus dem Testobjekt erzeugten photoakustischen Signals zu maximieren (schwarzes Band, das auf einem Glasschieber geklebt ist).Stellen Sie sicher, dass die optischen und akustischen Fokus konfokal sind, indem Sie die maximale photoakustische (PA) Signalamplitude bestimmen.
- Beachten Sie die Verzögerung der maximalen PA-Signale; Verwenden Sie diese später, um den Fokus in der Datenerfassungssoftware zu überprüfen.
- Lösen Sie die Schraube des Abtastkopfes und schalten Sie den Abtastkopf manuell von AR-PAM auf OR-PAM. Dann die Schrauben festziehen.
- In OR-PAM variieren Sie den Abstand zwischen dem fokussierenden achromatischen Dublett (innerhalb der Linsenröhre (LT)) und dem optoakustischen Kombinator, um die auf dem Oszilloskop angezeigte PA-Signalamplitude zu maximieren.
- Beachten Sie die Verzögerung der maximalen PA-Signale.
HINWEIS: Für die Bestimmung der konfokalen Anordnung ist eine Feinabstimmung erforderlich.
- Beachten Sie die Verzögerung der maximalen PA-Signale.
- Seitliche Auflösung und Bildgebungstiefe Quantifizierung
- Verwenden Sie Gold-Nanopartikel mit einem Durchmesser von 100 nm, um die laterale Auflösung des AR an zu bestimmenD OR-System.
- Verdünnen Sie 0,1 ml Nanopartikellösung mit einer gleichen Menge Wasser. 0,1 ml verdünnte Lösung auf einen Deckel verteilen und mit der Polyethylenmembran unter dem Tank in Kontakt bringen.
- Vergewissern Sie sich, dass der AR-PAM und der OR-PAM vor dem Scannen in der Datenerfassungssoftware (siehe Tabelle der Materialien) fokussiert sind (Schritte 2.8 und 2.10).
HINWEIS: Durch Kenntnis der Mikrosekundenverzögerung der maximalen PA-Signale aus den Schritten 2.9 und 2.10, multipliziert mit der Abtastrate (250 MS / s), wird das Bild in der Datenerfassungssoftware fokussiert. Die Verzögerung, die bei der Datenerfassung ausgelassen werden muss, kann in der Software ermittelt werden, um nur die notwendigen Datenpunkte für die Nachbearbeitung zu speichern. - Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM und drücken Sie die "Scan" -Taste, um das Raster-Scannen zu starten.
- Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM in der Datenerfassungssoftware auf "4" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der "Geschwindigkeit"; Tab "1" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "0,5" mm im Register "Y-Scanbereich" und "0,5" mm im Register "X-Scanbereich". Setzen Sie die Schrittgröße in x-Richtung auf "4" μm in der Registerkarte "dx".
HINWEIS: Die Schrittweite in y-Richtung wird automatisch aus der Abtastgeschwindigkeitsgeschwindigkeit der Bühne und der Pulswiederholrate (in diesem Fall 4.000 μm / 1.000 Hz = 4 μm) ermittelt,
- Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM in der Datenerfassungssoftware auf "4" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der "Geschwindigkeit"; Tab "1" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "0,5" mm im Register "Y-Scanbereich" und "0,5" mm im Register "X-Scanbereich". Setzen Sie die Schrittgröße in x-Richtung auf "4" μm in der Registerkarte "dx".
- Setzen Sie die Scan-Parameter für den OR-PAM und drücken Sie die "Scan" -Taste, um die Raster-Scanning zu starten.
- Setzen Sie die Scan-Parameter in der Datenerfassungssoftware auf "2,5" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der Registerkarte "Geschwindigkeit", "5" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "0,5" mm im "Y-Scanbereich" Tab und "0,5" mm im Register "X-Scanbereich". Setzen Sie die Schrittgröße in der x-Richtung ein "0,5" μm in der Registerkarte "dx".
HINWEIS: Die sDie Tep-Größe in y-Richtung wird automatisch aus der Abtastgeschwindigkeitsgeschwindigkeit der Stufe und der Pulswiederholrate (in diesem Fall 2.500 μm / 5.000 Hz = 0,5 μm) bestimmt.
- Setzen Sie die Scan-Parameter in der Datenerfassungssoftware auf "2,5" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der Registerkarte "Geschwindigkeit", "5" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "0,5" mm im "Y-Scanbereich" Tab und "0,5" mm im Register "X-Scanbereich". Setzen Sie die Schrittgröße in der x-Richtung ein "0,5" μm in der Registerkarte "dx".
- Stellen Sie sicher, dass während des Scanvorgangs die Daten kontinuierlich erfasst und auf dem Computer gespeichert werden
HINWEIS: Die Daten werden nur in einer Bewegungsrichtung der Y-Stufe erfasst. - Verwenden Sie die im Computer gespeicherten B-Scan-Daten, um die MAP-Bilder (Maximum Amplitude Projection) mit Hilfe der Bildverarbeitungssoftware abzurufen (siehe Tabelle der Materialien ).
- Verwenden Sie ein einzelnes Nanopartikelbild (aus mehreren Bildern) aus dem Scan, um die laterale Auflösung zu bestimmen, indem Sie eine Linie durch die zentrale Region des Nanopartikelbildes manuell plotten, um eine Punktspreizfunktion zu erhalten, die wie eine Gaußsche Kurve aussieht. Siehe Abbildung 2 .
- Passen Sie die Punkt-Spread-Funktion aus einem einzigen Nanopartikel Bild mit einem GauSsian passende Funktion und messen die volle Breite bei halbem Maximum (FWHM) mit Bildverarbeitungssoftware (siehe Tabelle der Materialien ). Verwenden Sie diese als seitliche Auflösung. Siehe Abbildung 2 .
- Legen Sie ein Stück schwarzes Band schräg auf ein Stück geschnittenes Hühnergewebe als Zielobjekt für die Tiefenabbildung ein. Legen Sie das Gewebe mit dem Band in den Wassertank.
HINWEIS: Das schwarze Band ist mit einer scharfen Spitze an einer Metallplatte befestigt, was hilft, das Band an das Gewebe zu befestigen. - Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM in die Datenerfassungssoftware und drücken Sie dann die "Scan" -Taste, um ein einzelnes B-Scan-Bild zu erfassen, um die maximale Bildtiefe zu bestimmen.
- Setzen Sie die Scan-Parameter auf "15" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der Registerkarte "Velocity", "1" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "5" cm im Register "Y-Scan Bereich" und "0,1 "Mm im Register" X-Scanbereich ". Set tEr schritt in der x-Richtung bei "0,1" mm in der Registerkarte "dx".
- Setzen Sie die Scan-Parameter für den OR-PAM und drücken Sie die "Scan" -Taste, um ein einzelnes B-Scan-Bild zu erfassen, um die maximale Bildaufnahme zu bestimmen.
- Setzen Sie die Scan-Parameter in der Datenerfassungssoftware als "15" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der Registerkarte "Geschwindigkeit", "5" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "2" cm im "Y-Scanbereich" Tab und "0,1" mm im Register "X-Scanbereich". Setzen Sie die Schrittgröße in x-Richtung auf "0,1" mm in der Registerkarte "dx".
HINWEIS: Da der X-Scanbereich und dx gleich sind, wird nur ein B-Scan erfasst. Die zeitaufgelösten PA-Signale multipliziert mit der Schallgeschwindigkeit in Weichgewebe (1.540 m / s) ergeben ein A-Linienbild. Mehrere A-Linien werden während der kontinuierlichen Bewegung der Y-Stufe erfasst, um einen B-Scan zu erzeugen.
- Setzen Sie die Scan-Parameter in der Datenerfassungssoftware als "15" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der Registerkarte "Geschwindigkeit", "5" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "2" cm im "Y-Scanbereich" Tab und "0,1" mm im Register "X-Scanbereich". Setzen Sie die Schrittgröße in x-Richtung auf "0,1" mm in der Registerkarte "dx".
- In vivo </ Em> Bildgebung der Maus Ohr Blutgefäße
- Verwenden Sie eine weibliche Maus mit einem Körpergewicht von 25 g und einem Alter von 4 Wochen.
- Das Tier mit einem Cocktail aus Ketamin (120 mg / kg) und Xylazin (16 mg / kg) intraperitoneal injiziert (Dosierung von 0,1 ml / 10 g) anästhesieren.
- Entfernen Sie die Haare aus dem Tier Ohr mit Haarentfernung Creme. Wischen Sie den Bereich sauber. Decken Sie das Auge des Tieres mit einer sterilen Augensalbe ab, um zu vermeiden, dass jeder gestreute Laserstrahl auf die Augen fällt.
- Positioniere das Tier auf eine Bühne, die auch eine Miniaturplatte hat, um das Ohr zu positionieren.
- Die Anästhesie mit inhaliertem Isofluran (0,75% in 1 l / min Sauerstoff) während der Bildgebung beibehalten.
- Klemmen Sie ein Pulsoximeter an die Maus Bein oder Schwanz und überwachen den physiologischen Status. Lassen Sie den Bildgebungsbereich mit Ultraschallgel in Kontakt mit der Polyethylenmembran gelangen.
- Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM und drücken Sie die "Scan" -Taste, um den Raster-Scanner zu startenIng.
- Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM in der Datenerfassungssoftware auf "15" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der Registerkarte "Geschwindigkeit", "1" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "10 mm" im " Y-Scan-Bereich "und" 6 "mm im Register" X-Scan-Bereich ". Setzen Sie die Schrittgröße in x-Richtung als "30" μm in der Registerkarte "dx".
HINWEIS: Die Schrittgröße in y-Richtung wird automatisch aus der Abtastgeschwindigkeitsgeschwindigkeit der Bühne und der Pulswiederholrate (in diesem Fall 15.000 μm / 1.000 Hz = 15 μm) ermittelt.
- Setzen Sie die Scan-Parameter für den AR-PAM in der Datenerfassungssoftware auf "15" mm / s Scan-Geschwindigkeit in der Registerkarte "Geschwindigkeit", "1" kHz in der Registerkarte "Pulswiederholrate", "10 mm" im " Y-Scan-Bereich "und" 6 "mm im Register" X-Scan-Bereich ". Setzen Sie die Schrittgröße in x-Richtung als "30" μm in der Registerkarte "dx".
- Nach Beendigung des AR-PAM-Scans schalten Sie die Bildkopfposition von AR-PAM auf OR-PAM (wie in Abschnitt 2 beschrieben).
- Setzen Sie die Scan-Parameter für den OR-PAM und drücken Sie die "Scan" -Taste, um die Raster-Scanning zu starten.
- Setzen Sie die Scan-Parameter für den OR-PAM in der Datenerfassungssoftware auf "15" mm / s Scan-Geschwindigkeit im "Velocit"Y "," 5 "kHz in der Registerkarte" Pulswiederholrate "," 10 "mm im Register" Y-Scanbereich "und" 6 "mm im Register" X-Scanbereich " In x-Richtung als "6" μm in der Registerkarte "dx"
HINWEIS: Die Schrittweite in y-Richtung wird automatisch aus der Abtastgeschwindigkeitsgeschwindigkeit der Bühne und der Pulswiederholrate (in diesem Fall 15.000 μm / 5.000 Hz = 2 μm) ermittelt.
- Setzen Sie die Scan-Parameter für den OR-PAM in der Datenerfassungssoftware auf "15" mm / s Scan-Geschwindigkeit im "Velocit"Y "," 5 "kHz in der Registerkarte" Pulswiederholrate "," 10 "mm im Register" Y-Scanbereich "und" 6 "mm im Register" X-Scanbereich " In x-Richtung als "6" μm in der Registerkarte "dx"
- Verwenden Sie die im Computer gespeicherten B-Scan-Daten, um die MAP-Bilder mit der Bildverarbeitungssoftware abzurufen.
- Beobachten Sie das Tier während der gesamten Bildgebung.
3. Versuchsschritte
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Representative Results
Der Schaltplan des AR-OR-PAM-Systems ist in Abbildung 1 dargestellt . In diesem Setup wurden alle Komponenten integriert und in einem optischen Käfigaufbau zusammengebaut. Durch die Verwendung eines Käfigsystems wird der AR-OR-PAM-Abtastkopf kompakt und einfach zusammengebaut, ausgerichtet und auf eine einzige Scan-Stufe integriert.
Eine zweidimensionale kontinuierliche Rasterabtastung des Bildkopfes wurde während der Bilderfassung verwendet. Die zeitaufgelösten PA-Signale wurden mit der Schallgeschwindigkeit (1.540 m / s) multipliziert, um eine A-Linie zu erhalten. Mehrere A-Linien, die während der kontinuierlichen Bewegung der Y-Stufe aufgenommen wurden, erzeugten den zweidimensionalen B-Scan. Mehrere B-Scans des Imaging-Bereichs wurden erfasst und im Computer gespeichert und wurden verwendet, um die MAP-Fotoakustikbilder zu verarbeiten und zu produzieren.
Um die Auflösung des schaltbaren Systems zu bestimmenWurde das MAP-Bild eines einzelnen Nanopartikels verwendet 31 . Die photoakustische Amplitude entlang der zentralen Seitenrichtung des Bildes wurde aufgetragen und an eine Gaußsche Funktion angepasst. Die FWHM der Gaußschen Passung wurde als die laterale Auflösung betrachtet. Die gemessene laterale Auflösung für das AR-PAM betrug 45 μm, wie in 2a gezeigt. In ähnlicher Weise wurde ein einzelnes Nanopartikelbild, das unter Verwendung von OR-PAM aufgenommen wurde, entlang der zentralen lateralen Richtung angebracht, um die Auflösung des OR-PAM zu bestimmen, wie in 2b gezeigt. Die gemessene laterale Auflösung betrug 4 μm, bestimmt aus dem FWHM. Die Einfügung der Figur zeigt das entsprechende MAP-Bild des Gold-Nanopartikels. Theoretisch beträgt die optisch beugungsbegrenzte laterale Auflösung für AR-PAM 45 μm, bestimmt unter Verwendung der folgenden Gleichung: 0,72 λ / NA, wobei λ die zentrale akustische Wellenlänge und NA die numerische istBlende des Ultraschallwandlers. Die theoretische Auflösung stimmt gut mit den experimentellen Daten überein. Ähnlich beträgt die theoretische laterale Auflösung für OR-PAM 2,6 μm, berechnet mit der folgenden Gleichung: 0,51λ / NA, wobei λ die Laserwellenlänge und NA die numerische Apertur des Objektivs ist. Die experimentell gemessene laterale Auflösung für OR-PAM war schlechter als die Beugungsgrenzschätzung, die auf Wellenfrontaberrationen zurückzuführen sein könnte. Da sowohl AR als auch ODER einen ähnlichen Wandler und eine akustische Linse verwenden, beträgt die theoretische axiale Auflösung 30 μm nach 0,88 c / Δ f , wobei c die Schallgeschwindigkeit im Weichgewebe und Δ f die Frequenzbandbreite des Ultraschallwandlers ist . Zusätzlich variiert die laterale Auflösung in axialer Richtung sowohl für den OR-PAM 20 als auch den AR-PAM 32 . Die berichteten seitlichen Auflösungen liegen hier auf der Brennebene.
Abbildung 3 a zeigt das Foto des schwarzen Bandes auf Hühnergewebe. Ein einzelnes B-Scan-Bild wurde sowohl mit AR-PAM als auch mit OR-PAM aufgenommen. Fig. 3b und Fig. 3c zeigen das einzelne B-Scan-PA-Bild von AR-PAM bzw. OR-PAM. Aus Abbildung 3 b ist ersichtlich, dass das AR-PAM-System das schwarze Band auf ~ 7,8 mm unterhalb der Gewebeoberfläche deutlich abbilden kann. Ähnlich war es mit dem OR-PAM-System möglich, das schwarze Band bis zu ~ 1,4 mm unterhalb der Gewebeoberfläche deutlich abzubilden ( Abbildung 3 c ). Aus den Bildern wurde auch das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) ermittelt. SNR ist definiert als V / n , wobei <Em> V ist die Peak-to-Peak-PA-Signalamplitude und n ist die Standardabweichung des Hintergrundrauschens. Das bei 4,6 mm und 7,8 mm Bildtiefen gemessene SNR betrug 2,6 bzw. 1,4. Für OR-PAM betrug das SNR bei einer Bildtiefe von 1,4 mm 1,4. Um die biologische Abbildungsfähigkeit des umschaltbaren AR-OR-PAM-Systems zu demonstrieren, wurde in vivo die Blutgefßbildgebung an einem Mausohr durchgeführt. Eine Fotografie, die die vaskuläre Anatomie des lebenden Mausohres zeigt, das für die Bildgebung verwendet wird, ist in Fig . 4a gezeigt. Unter Verwendung von AR-PAM wurde ein 10 mm x 6 mm Scanbereich mit einer Schrittweite von 15 μm in Y-Richtung und 30 μm in X-Richtung abgebildet. Die Bildgebung dauerte 10 Minuten. Derzeit erfasst das Abbildungssystem Daten nur in einer Richtung; Kann die Erfassungszeit auf fast die Hälfte reduziert werden, indem das Programm modifiziert wird, um eine bidirektionale Datenerfassungsfähigkeit zu haben. Ein MAP-Bild von AR-PAM ist in Abbildung 4 dargestelltB. Die Nahaufnahmen des interessierenden Bereichs sind in Abbildung 4 c dargestellt . Ein ähnlicher Bereich, der mit dem OR-PAM mit einer Schrittweite von 3 μm in Y-Richtung und 6 μm in X-Richtung abgetastet wurde, ist in Fig. 4d gezeigt . Die Bildgebung dauerte 46 Minuten. Die Nahaufnahmen des interessierenden Bereichs sind in Abbildung 4 e dargestellt . OR-PAM kann eindeutig einzelne Kapillaren lösen, die AR-PAM nicht lösen kann. AR-PAM kann Gefäße auflösen, die dicker als 45 μm sind.
Zusammenfassend wurde ein umschaltbares AR-OR-PAM-System entwickelt, das eine hochauflösende Bildgebung unter Verwendung einer engen optischen Fokussierung sowie eine Tiefgewebe-Bildgebung mit akustischer Fokussierung ermöglicht. Die Leistung des umschaltbaren AR-OR-PAM-Systems wurde unter Verwendung von lateralen Auflösungs- und Abbildungs-Tiefenmessungen quantifiziert. In vivo studWurden auch durchgeführt, um seine biologische Abbildungsfähigkeit zu zeigen. Dieses umschaltbare photoakustische Mikroskopiesystem kann eine hohe zeitliche und räumliche Auflösung bieten, wodurch das System für Anwendungen, einschließlich der Abbildung von Angiogenese, Drogenreaktion usw. , wichtig ist, wobei sowohl die Bildgebung der einzelnen Kapillaren als auch die tiefen Gefäße wichtig ist. Weitere Modifikationen oder Verbesserungen an dem System können durch Ersetzen der selbstgemachten schaltbaren Platte durch eine 10 cm laufende motorisierte Stufe (y-Achse) erfolgen. Die laterale Auflösung des OR-PAM kann durch Korrektur der Wellenfrontaberrationen weiter verbessert werden. Die Bereitstellung einer höheren Pulsenergie zum AR-PAM verbessert die SNR- und Bildtiefe.
Im Fall von OR-PAM unter der Annahme, dass der optische Fokus 150 μm unterhalb der Hautoberfläche für die in vivo- Bildgebung liegt, beträgt die Oberflächenfleckgröße einen Durchmesser von 22,5 μm. Die Bereitstellung eines einzelnen Laserpulses von 90 nJ ergibt eine MaX maximale Pulsenergie von 20,4 mJ / cm 2 . Für AR-PAM lag der Laserfokus bei 2 mm Durchmesser. Die Bereitstellung eines einzelnen Laserpulses von 50 μJ ergibt eine maximale Pulsenergie im Brennpunkt von 1,6 mJ / cm 2 , gut innerhalb der ANSI-Sicherheitsgrenze von 20 mJ / cm 2 , 33 .
Abbildung 1 : Schematische Darstellung des AR-OR-PAM Imaging Systems. ( A ) BS: Strahlprobennehmer, NDF: Neutral-Dichte-Filter, RAP - Rechtwinkliges Prisma, PD: Photodiode, CL: Kondensorlinse, PH: Pinhole, FC: Faserkoppler, UST: Ultraschallwandler, MMF: Multimodefaser, SMF: Single-Mode-Faser, DAQ: Datenerfassungskarte, TS: Translationsstufe, Con.L: konische Linse, L1: konvexe Linse, L2 & L3: achromatisches Objektiv, RA: rechtwinkliges Prisma, RP: rhomboid Prisma, OC: optisch Kondensator, M: mIrre, SP: Gleitplatte, LT: Linsenröhre, TM: Translationshalterung, KMM: kinematische Spiegelhalterung und AL: Akustiklinse. ( B ) Foto des Prototyps AR-OR-PAM-System. ( C ) Nahaufnahmen des optoakustischen Strahlkombinators. ( D ) Nahaufnahme des optischen Kondensators mit einem UST in der Mitte. Abgedruckt aus Referenz 34 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2 : Seitliche Auflösung Test des AR-OR-PAM-Systems: Laterale Auflösung durch Bildgebung von Gold-Nanopartikeln mit einem Durchmesser von 100 nm. Schwarz (*) Punkte: photoakustisches Signal; Blaue Linie: Gauß-eingepasste Kurve für ( a ) AR-PAM und ( b )OR-PAM Die Einfügung zeigt das repräsentative AR-PAM-Bild in (a) und dem OR-PAM-Bild in (b) des einzelnen Gold-Nanopartikels. Abgedruckt aus Referenz 34 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3 : Abbildung Tiefe Messungen: Single B-Scan-PA-Bild eines schwarzen Bandes schräg auf Hühnergewebe eingefügt. ( A ) Schematische Darstellung ( B ) AR-PAM-Bild ( C ) OR-PAM-Bild Abgedruckt aus Referenz 34 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4 : In vivo Photoakustisches Bild eines Maus-Ohres: ( a ) Foto des Maus-Ohr-Gefäßsystems. (B) AR-PAM-Bild ( C ) Nahaufnahme des interessierenden Bereichs (ROI) in ( b ), wie durch eine weiße gestrichelte Linie dargestellt. ( D ) OR-PAM-Bild ( E ) Region von Interesse (ROI) in ( d ), wie durch eine weiße gepunktete Linie gezeigt. ( F ) Nahaufnahmenbild der ROI-Weißlinie in (e) mit einer einzigen Kapillare. Abgedruckt aus Referenz 34 mit Erlaubnis. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Abschließend wurde ein umschaltbares AR- und OR-PAM-System entwickelt, das sowohl eine hochauflösende Bildgebung bei niedrigeren Bildtiefen als auch eine niedrigere Auflösung bei höheren Bildtiefen erreichen kann. Die laterale Auflösung und die Bildgebungstiefe des schaltbaren Systems wurde bestimmt. Die Vorteile dieses schaltbaren PAM-Systems sind: (1) die hochauflösende Bildgebung mit enger optischer Fokussierung; (2) die Tiefgewebe-Bildgebung mittels akustischer Fokussierung; 3) die Dunkelfeldbeleuchtung für AR-PAM, die verhindert, dass starke PA-Signale auf der Hautoberfläche auftreten; 4) die Fähigkeit, die Probe an einem Ort zu halten, ohne sie zwischen verschiedenen Systemen zu bewegen; 5) die Möglichkeit, mehrfache Laser und Scan-Stufen zu vermeiden; Und 6) die minimale Verwendung von hausgemachten Komponenten. Dies ist die erste gemeldete Kombination von OR-PAM und Dunkelfeld-AR-PAM, die hochauflösende, flache Tiefenbilder und niedrigauflösende Tiefseilbilder der gleichen Probe liefert, ohne die Probe / Ob zu bewegenJect Die Verwendung der gleichen Scan-Bühne und Laser macht das System effizient und kostengünstig. Das kombinierte System hat eine 4 μm laterale Auflösung mit einer 1,4 mm Bildtiefe sowie eine 45 μm laterale Auflösung mit einer 7,8 mm Bildtiefe. Das System besteht aus einem optischen Käfig-System mit minimal hausgemachten Komponenten, so dass es einfacher zu montieren, auszurichten und zwischen AR und OR PAM umzuschalten. Der kombinierte Scan-Kopf ist kompakt und lässt sich problemlos auf einer einzigen Scan-Bühne montieren. Mit dem kombinierten System wurde die In-vivo- Bildgebung erfolgreich demonstriert.
Das entwickelte System kann für die präklinische Bildgebung eingesetzt werden. Zu den wichtigsten präklinischen Anwendungen gehören die Abbildung von Angiogenese, Tumormikroumgebungen, Mikrozirkulation, Wirkstoffreaktion, Hirnfunktionen, Biomarker und Genaktivitäten. Die Einschränkungen des Systems beinhalten die Abtastzeit. Eine lange Scan-Zeit ist derzeit erforderlich, aber es kann durch den Erwerb von Daten in Bot reduziert werdenH Richtungen. Eine gleichzeitige Bildaufnahme zwischen OR-PAM und AR-PAM ist derzeit nicht möglich. Derzeit ist eine manuelle Umschaltung zwischen OR-PAM und AR-PAM erforderlich, die durch eine Translationsstufe mit mindestens 10 cm Y-Richtungsbewegung vermieden werden kann. Kritische Schritte im Protokoll beinhalten die konfokale Bestimmung des optischen und akustischen Fokus; Die Erzielung eines optischen Punktgrößen von weniger als 5 μm für OR-PAM, um einzelne Kapillaren abzubilden; Und die Gestaltung des optoakustischen Strahlkombinierers für den OR-PAM und des optischen Kondensators für den AR-PAM.
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Disclosures
Alle Tierversuche wurden nach den genehmigten Richtlinien und Vorschriften des Institutional Animal Care and Use Committee der Nanyang Technological University, Singapur (Tierprotokoll Nr. ARF-SBS / NIE-A0263) durchgeführt. Die Autoren haben keine relevanten finanziellen Interessen im Manuskript und keine anderen potenziellen Interessenkonflikte zu offenbaren.
Acknowledgments
Die Autoren möchten die finanzielle Unterstützung aus einem von dem Bildungsministerium in Singapur geförderten Tier 2-Stipendium anerkennen (ARC2 / 15: M4020238). Die Autoren danken auch Herrn Chow Wai Hoong Bobby für den Maschinenladen helfen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Q-switched Nd:YAG laser | Edgewave | BX80-2-L | Pump laser |
| Credo-High Repetition Rate Dye Laser | Spectra physics | CREDO-DYE-N | Dye laser |
| Precision Linear Stage | Physik Instrumente | PLS 85 | XY raster scanning stage |
| Translation stage | Physik Instrumente | VT 80 | Confocal determine |
| Mounted Silicon photodiode | Thorlabs | SM05PD1A | Triggering/Pulse variation |
| Motorized continuous Rotational stage | Thorlabs | CR1/M-Z7 | Diverting laser beam |
| Mounted Continuously Variable ND Filter | Thorlabs | NDC-50C-4M | Intensity variable |
| Fiber Patch Cable | Thorlabs | M29L01 | Multimode fiber |
| Microscope objective | Newport | M-10X | Objective |
| XY translating mount | Thorlabs | CXY1 | Translating mount |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA1951 | Collimating lens |
| Conical lens | Altechna | APX-2-B254 | Ring shape beam |
| Translation stage | Thorlabs | CT1 | Translating stage |
| Optical condenser | Home made | ||
| Ultrasonic transducer | Olympus-NDT | V214-BB-RM | 50MHz transducer |
| Plano concave lens | Thorlabs | LC4573 | Acoustic lens |
| Pulser/Receiver | Olympus-NDT | 5073PR | Pulse echo amplifier |
| Mounted standard iris | Thorlabs | ID12/M | Beam shaping |
| Plano convex lens | Thorlabs | LA4327 | Condenser lens |
| Mounted precision pinhole | Thorlabs | P50S | Spatial filtering |
| Single mode fiber patch cable | Thorlabs | P1-460B-FC-1 | Single mode fiber |
| Fiber coupler | Newport | F-91-C1 | Single mode coupling |
| Achromatic doublet lens | Edmund Optics | 32-317 | Achromatic doublet |
| Protected silver elliptical mirror | Thorlabs | PFE10-P01 | Mirror |
| Right angle kinematic mirror mount | Thorlabs | KCB1 | Mirror mount |
| Z-Axis Translation Mount | Thorlabs | SM1Z | z translator |
| Lens tube | Thorlabs | SM05L10 | |
| UV Fused Silica Right-Angle Prism | Thorlabs | PS615 | Right angle prism |
| Rhomboid prism | Edmund Optics | 47-214 | Shear wave |
| Dimethylpolysiloxane | Sigma Aldrich | DMPS1M | Silicon oil |
| Amplifier | Mini Circuits | ZFL-500LN | Amplifier |
| 16 bit high speed digitizer | Spectrum | M4i.4420 | Data acquisition card |
| Oscilloscope | Agilent Technologies | DS06014A | |
| Mice | InVivos Pte.Ltd | ICR | Animal model |
| Ultrasound gel | Progress/parker acquasonic gel | PA-GEL-CLEA-5000 | Acoustic coupling |
| Water tank | Home made | ||
| Translation stage | Homemade | Switching AR-OR | |
| Gold nanoparticles | Sigma Aldrich | 742031 | Lateral resolution |
| Sterile ocular ointment | Alcon | Duratears | Animal imaging |
| 1951 USAF resolution test target | Edmund Optics | 38257 | Confocal alignment |
| Data acquisition software | National Instrument | Labview | Home made software using Labview |
| Image Processing software | Mathworks | Matlab | Home made program using Matlab |
References
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