Umschaltbare akustische und optische Auflösung Photoakustische Mikroskopie für In vivo Kleintier-Blut-Vaskulatur-Bildgebung

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, ein umschaltbares photoakustisches Mikroskopiesystem mit akustischer und optischer Auflösung für die in vivo Blutgefäßbildgebung von Kleintieren zu demonstrieren. Die photoakustische Mikroskopie ist eine schnell wachsende In-vivo-Bildgebungsmodalität, die Optik und Ultraschall kombiniert und eine Abbildungstiefe über den Strahlengang hinaus mit hoher Auflösung bietet. Bei dieser vorliegenden Arbeit handelt es sich um ein umschaltbares photoakustisch-mikroskopisches System mit akustischer optischer Auflösung, das sowohl eine höher aufgelöste Bildgebung in geringer Tiefe als auch eine tiefer aufgelöste tiefe Gewebebildgebung derselben Probe in vivo ermöglicht.

Das Verfahren wird von Dr. Mohesh Moothanchery, einem Forschungsstipendiaten aus meinem Labor, und Arunima Sharma, einer Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Konstruieren Sie zunächst ein im Nanosekundenbereich abstimmbares Lasersystem aus einem diodengepumpten Festkörper-Nd:YAG-Laser und einem abstimmbaren Laser mit einem Bereich von 559 bis 576 Nanometern. Stellen Sie den dimmbaren Laser auf 570 nan ein.

Montieren Sie auf einem optischen Tisch einen Acryltank mit einem sieben Zentimeter großen Bildfenster aus Polyethylen im Boden des Tanks. Befestigen Sie einen Bildgebungstisch an einem optischen Stift unter dem Bildgebungsfenster. Montieren Sie über dem Tank einen optischen Käfig mit dem AR-OR-PAM-Bildgebungssystem auf einer Schaltplatte, die an einem computergesteuerten motorisierten Drei-Achsen-Translationstisch befestigt ist.

Um das System für AR-PAM zu konfigurieren, verwenden Sie ein rechtwinkliges Prisma, das auf einem motorisierten kontinuierlichen Rotationstisch montiert ist, um den Strahl durch einen Filter mit variabler Neutraldichte auf ein Multimode-Glasfaserkabel mit einem 25-NA-Faserkoppler zu leiten. Verbinden Sie den Faserausgang mit einer XY-Translationsstufe im Bildgebungssystem. Richten Sie den Strahl durch eine plankonvexe Linse 25 Millimeter vom Ausgang entfernt und dann durch eine konische Linse, um einen ringförmigen Strahl zu erzeugen.

Fokussieren Sie den ringförmigen Strahl auf einen optischen Kondensator um einen 50-Megahertz-Ultraschallwandler mit einer akustischen Linse, die am Wandlerausgang montiert ist. Um das System für OR-PAM zu konfigurieren, drehen Sie als Nächstes das erste rechtwinklige Prisma um 90 Grad, um den Laserstrahl durch eine Iris, einen Filter mit variabler Neutraldichte, eine Kondensorlinse und eine Lochblende in einem Abstand von 75 Millimetern zur Kondensorlinse zu leiten. Verwenden Sie einen Singlemode-Faserkoppler mit 1 NA und eine Singlemode-Faser, um den Strahl an den Z-Translationstisch im Bildgebungssystem zu senden.

Richten Sie den Strahl durch eine achromatische Dublett-Linse, die 50 Millimeter vom Faserausgang entfernt montiert ist. Lenken Sie den Strahl mit einem kinematischen, steuerbaren, elliptischen Spiegel auf eine zweite achromatische Dublettenlinse in einem Linsentubus um. Fokussieren Sie den Strahl auf ein rechtwinkliges Prisma, das durch eine Schicht Silikonöl von einem rhomboiden Prisma getrennt ist und eine akustische Linse und einen 50-Megahertz-Ultraschallwandler trägt, der den OR-PAM-Scankopf bildet.

Füllen Sie vor Beginn der Systemausrichtung die Acryltanks mit entgastem Wasser. Verwenden Sie dann den dreiachsigen motorisierten Tisch, um die Scanbaugruppe über den Tank zu bewegen. Senken Sie die Baugruppe ab, bis die akustischen Linsen beider Systeme untergetaucht sind.

Schalten Sie den Laser ein. Schließen Sie die Ultraschallwandler an zwei 25-Dezibel-Verstärker mit fester Verstärkung an. Positionieren Sie den AR-PAM-Scankopf über dem Bildfenster.

Legen Sie einen mit schwarzem Isolierband umwickelten Objektträger auf den Bildtisch und heben Sie den Tisch an, um den Objektträger in Kontakt mit dem Bildfenster zu bringen. Stellen Sie die konische Linse so ein, dass die vom Objektträger erzeugte photoakustische Signalamplitude ein Maximum erreicht, was darauf hinweist, dass die optischen und akustischen Linsen konfokal sind. Wechseln Sie dann manuell in das OR-PAM-System.

Stellen Sie die achromatische Dublett-Linse so ein, dass die optischen und akustischen Linsen konfokal sind, wie durch Maximieren der photoakustischen Signalamplitude des mit Klebeband bedeckten Objektträgers angezeigt. Um die laterale Auflösung jedes Systems zu bestimmen, wird zunächst 1 Milliliter einer verdünnten Lösung von 100 Nanometern Goldnanopartikeln in Wasser auf ein Deckglas gegeben. Legen Sie den Objektträger auf den Bildgebungstisch.

und heben Sie den Tisch an, bis die Nanopartikellösung das Bildgebungsfenster berührt. Schalten Sie den Laser und den Scankopf auf das AR-PAM-System um. Konfigurieren Sie die Gerätesoftware für einen AR-PAM-Scan und führen Sie einen einzelnen Rasterscan durch.

Wiederholen Sie diesen Vorgang für das OR-PAM-System. Entfernen Sie dann den Objektträger und reinigen Sie das Bildfenster mit einem Alkoholtupfer. Passen Sie die aus den aufgenommenen Bildern ermittelten Punktverteilungsfunktionen an eine Gaußsche Kurve an.

Die volle Breite bei halber Maximierung ist die laterale Auflösung für das entsprechende Scansystem. Um die maximale Bildgebungstiefe im Gewebe zu bestimmen, führen Sie zunächst eine scharfe, mit schwarzem Klebeband umwickelte Metallplatte in einem flachen Winkel in einen kleinen Abschnitt des Hühnergewebes ein. Legen Sie das Taschentuch in den Wassertank unter dem Scannerkopf.

Erhalten Sie ein einzelnes B-Bild-Bild für jedes System. Messen Sie die Tiefe unter der Gewebeoberfläche, in der das schwarze Klebeband nicht mehr deutlich erkennbar ist. Stellen Sie vor der Aufnahme sicher, dass sowohl das Bildgebungsfenster aus Polyethylen als auch die Bildgebungsstufe für Tiere sauber sind.

Besorgen Sie sich dann eine 25 Gramm schwere, vier Wochen alte weibliche Maus für das bildgebende Verfahren, nachdem Sie die Maus betäubt haben. Entfernen Sie Haare von der Ohroberfläche mit Enthaarungscreme. Tragen Sie eine sterile Augensalbe auf die Augen der Maus auf, um Trockenheit zu verhindern und gestreute Laserstrahlen zu blockieren.

Platzieren Sie die Maus auf einem Bildgebungstisch mit der Platte zur Positionierung des Ohrs zu mir abgebildet. Überwachen Sie den physiologischen Zustand der Maus mit einem Pulsoximeter, das an den Schwanz oder das Bein der Maus geklemmt wird. Tragen Sie Ultraschallgel auf das zu bebildernde Ohr auf.

Heben Sie den Bildgebungstisch langsam an, um das Ohr sanft mit dem Bildgebungsfenster aus Polyethylen in Kontakt zu bringen. Erfassen Sie AR-PAM- und OR-PAM-Rasterscans des Ohrs der Maus und überwachen Sie den physiologischen Status der Maus während der gesamten Zeit. Lassen Sie die Maus nach dem Imaging vollständig wiederherstellen.

Das Blutgefäßsystem einer Maus wurde hier in vivo mit einem schaltbaren AR-OR-PAM System abgebildet. Blutgefäße, die dicker als 45 Mikrometer sind, waren auf dem AR-PAM-Bild deutlich zu erkennen. Einzelne Kapillaren von etwa fünf Mikrometern Breite wurden mit Hilfe der OP-PAM-Bildgebung aufgelöst.

Das kombinierte AR-OR-PAM-System hat eine laterale Auflösung von etwa vier Mikrometern. Und im Punkt vier mm Bildgebung für den OP-PAM und eine laterale Auflösung von etwa 45 Mikrometern und 7,8 mm Bildgebung für den AR-PAM. Das umschaltbare kombinierte AR-OR-PAM-System ermöglicht die Bildgebung, ohne die Probe zwischen verschiedenen Bildgebungssystemen zu bewegen.

Das entwickelte System kann für die präklinische Bildgebung eingesetzt werden. Zu den wichtigsten präklinischen Anwendungen gehören die Bildgebung der Androgenese, der Mikroumgebung von Tumoren, der Mikrozirkulation, des Ansprechens auf Medikamente, der Gehirnfunktion, der Biomarker und der Genaktivitäten.