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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

Microscopia fotoacústica de resolução acústica e óptica comutável para Published: June 26, 2017 doi: 10.3791/55810
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

Aqui é demonstrado um sistema de resolução acústica (AR) e resolução óptica (OR) de microscopia fotoacústica (AR-OR-PAM) capaz de obter imagens de alta resolução em profundidade superficial e baixa resolução de imagens de tecido profundo na mesma amostra in vivo .

Abstract

A microscopia fotoacústica (PAM) é uma modalidade de imagem invivo de crescimento rápido que combina tanto a óptica como a ultra-sonografia, proporcionando penetração para além do caminho livre médio óptico (~ 1 mm na pele) com alta resolução. Ao combinar o contraste de absorção óptica com a alta resolução espacial do ultra-som em uma única modalidade, esta técnica pode penetrar nos tecidos profundos. Os sistemas de microscopia fotoacústica podem ter uma baixa resolução acústica e uma sonda profundamente ou uma alta resolução óptica e sondagem superficialmente. É desafiador alcançar alta resolução espacial e grande penetração de profundidade com um único sistema. Este trabalho apresenta um sistema AR-OR-PAM capaz de imagens de alta resolução em profundidades rasas e imagens de tecido profundo de baixa resolução da mesma amostra in vivo . Uma resolução lateral de 4 μm com profundidade de imagem de 1,4 mm usando focagem óptica e uma resolução lateral de 45 μm com profundidade de imagem de 7,8 mm usando focagem acústica foram bem sucedidasDemonstrou o uso do sistema combinado. Aqui, a imagem de vasculatura de sangue de animal pequeno in vivo é realizada para demonstrar sua capacidade de imagem biológica.

Introduction

As modalidades de imagem óptica de alta resolução, como a tomografia de coerência óptica, microscopia confocal e microscopia multiphoton, têm inúmeros benefícios. No entanto, a resolução espacial diminui significativamente à medida que a profundidade da imagem aumenta. Isto é devido à natureza difusa do transporte de luz nos tecidos moles 1 , 2 . A integração de excitação óptica e detecção de ultra-som fornece uma solução para superar o desafio da imagem ótica de alta resolução em tecidos profundos. A microscopia fotoacústica (PAM) é uma modalidade que pode proporcionar imagens mais profundas do que outras modalidades de imagem óptica. Foi aplicado com sucesso em imagens estruturais, funcionais, moleculares e celulares in vivo 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , combinando o forte contraste de absorção óptica com a alta resolução espacial do ultra-som.

No PAM, um pulso laser curto irradia o tecido / amostra. A absorção de luz por cromóforos ( por exemplo, melanina, hemoglobina, água, etc. ) resulta em um aumento de temperatura, o que, por sua vez, resulta na produção de ondas de pressão sob a forma de ondas acústicas (ondas fotoacústicas). As ondas fotoacústicas geradas podem ser detectadas por um transdutor ultra-sônico de banda larga fora do limite do tecido. Utilizando fraca focagem acústica óptica e apertada, a imagem em tecido profundo pode ser alcançada em microscopia fotoacústica de resolução acústica (AR-PAM) 14 , 15 , 16 . Em AR-PAM, uma resolução lateral de 45 μm e uma profundidade de imagem de até 3 mm foram demonstradas 15 . Para resolver capilares únicos (~ 5 μm) acústicamente, são necessários transdutores ultra-sônicos que operam em freqüências centrais de 400 MHz. Em tais freqüências altas, a profundidade de penetração é inferior a 100 μm. O problema causado pela focagem acústica apertada pode ser resolvido usando focagem ótica apertada. A microscopia fotoacústica de resolução óptica (OR-PAM) é capaz de resolver capilares únicos, ou mesmo uma única célula 17 , e uma resolução lateral de 0,5 μm foi alcançada 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . O uso de um nanojet fotônico pode ajudar a alcançar uma resolução além da resolução de difração limitadaN 25 , 26 . Em OR-PAM, a profundidade de penetração é limitada devido à focagem leve e pode representar uma imagem até ~ 1,2 mm dentro do tecido biológico 23 . Portanto, AR-PAM pode imagem mais profunda, mas com uma resolução menor, e OR-PAM pode imagem com uma resolução muito alta, mas com profundidade de imagem limitada. A velocidade de imagem do sistema AR e OR-PAM depende principalmente da taxa de repetição de pulso da fonte laser 27 .

A combinação de AR-PAM e OR-PAM será de grande benefício para aplicativos que exigem uma imagem de alta resolução e imagem mais profunda. Pouco esforço foi feito para combinar esses sistemas juntos. Normalmente, dois scanners de imagem diferentes são usados ​​para imagens, o que requer que a amostra seja movida entre os dois sistemas, dificultando assim a realização de imagens in vivo . No entanto, a imagem híbrida com AR e OR PAM permite a imagem com resoluções escaláveis ​​aE profundidades. Em uma abordagem, um feixe de fibra óptica é usado para fornecer luz tanto para AR como para OR PAM. Nesta abordagem, são utilizados dois laser separados (um laser de alta energia a 570 nm para o AR e um laser de baixa energia e alta repetição a 532 nm para o OR), o que torna o sistema inconveniente e caro 28 . O comprimento de onda do laser OR-PAM é fixo, e muitos estudos, como a saturação de oxigênio, não são possíveis usando esse sistema combinado. Estudos comparativos entre AR e OR PAM também não são possíveis devido à diferença nos comprimentos de onda do laser entre o AR e o OR. Além disso, AR-PAM usa iluminação de campo brilhante; Portanto, sinais fortes fotoacústicos da superfície da pele limitam a qualidade da imagem. Por este motivo, o sistema não pode ser usado para muitas aplicações de bioimagem. Em outra abordagem para executar AR e OR PAM, o foco óptico e ultra-som é deslocado, o que torna o foco da luz e o foco ultra-sonográfico desalinhados. Assim, a qualidade da imagem não é otimizada 30 . Em todos estes casos, AR-PAM não usou iluminação de campo escuro. O uso da iluminação do campo escuro pode reduzir a geração de sinais fotoacústicos fortes da superfície da pele. Portanto, a imagem de tecido profundo pode ser realizada usando iluminação em forma de anel, pois a sensibilidade de detecção de sinais fotoacústicos profundos será maior que a de iluminação de campo brilhante.

Este trabalho relata um sistema de imagem AR e OR PAM (AR-OR-PAM) comutável, capaz tanto de imagem de alta resolução quanto de imagem de baixa resolução de tecido profundo da mesma amostra, usando o mesmo laser e scanner para ambos os sistemasEms. O desempenho do sistema AR-OR-PAM foi caracterizado pela determinação da resolução espacial e da profundidade da imagem usando experiências fantasmas. A imagem de vasculatura de sangue in vivo foi realizada em uma orelha de rato para demonstrar sua capacidade de imagem biológica.

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Protocol

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com os regulamentos e diretrizes aprovados do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Tecnológica de Nanyang, Cingapura (Número de Protocolo Animal ARF-SBS / NIE-A0263).

1. Sistema AR-OR-PAM ( Figura 1 )

  1. Configuração do sistema: AR-PAM
    1. Use um sistema a laser tunelável de nanosegundos consistindo de um laser de Nd-YAG com bombeamento diodo-bombeado (532 nm) e um laser de corante com uma faixa de tunability de 559-576 nm como fonte de irradiação óptica. Ajuste o comprimento de onda do laser para 570 nm usando um controlador externo e a taxa de repetição do laser para 1 kHz usando o software laser.
    2. Coloque uma amostra de feixe com um ângulo de 45 ° na frente do laser para desviar 5% da potência do laser para um fotodiodo através de um filtro de densidade neutro variável (NDF1; OD = 0-4.0).
    3. Desviar o raio laser após a amostragem do feixe a 90 ° usandoUm prisma de ângulo reto (RAP1).
    4. Use outro prisma de ângulo reto (RAP2) para permitir que o feixe passe através de um filtro de densidade neutro variável (NDF2; OD = 0-4.0) e em uma fibra multimodo (MMF), dirigindo-o através de um acoplador de fibra (FC) -a Combinação de objetivos (abertura numérica (NA): 0,25) e um tradutor XY.
    5. Corrija a fibra no estágio de digitalização usando um tradutor XY. Coloque uma lente plano-convexa (L1) a 25 mm da extremidade de saída da fibra para colimar o feixe para fora da fibra.
    6. Passe o feixe colimado através de uma lente cônica com um ângulo de vértice de 130 ° para gerar um feixe em forma de anel. Focalize fraco o feixe em forma de anel no sujeito usando um condensador óptico caseiro (OC) com ângulos de cone de 70 ° e 110 ° e com um furo no centro.
    7. Coloque um transdutor ultra-sônico de 50 MHz (UST) com uma lente acústica (AL) no centro do condensador caseiro.
  2. Configuração do sistema: OR-PAM
    1. Use umSistema a laser sintonizável de nanosegundos consistindo de um laser Nd-YAG de bombeamento diodo-bombeado (532 nm) e um laser de corante com uma faixa de tunability de 559 - 576 nm como fonte de irradiação óptica. Defina o comprimento de onda do laser a 570 nm usando um controlador externo e a taxa de repetição do laser a 5 kHz usando o software laser.
    2. Gire o estágio de rotação controlado pelo computador (segurando o RAP1) em 90 ° para desviar o raio laser para uma íris para remodelar.
    3. Atenuar o feixe de laser colocando um filtro de densidade neutro variável (OD: 0-4.0) ao longo do feixe e, em seguida, concentre o feixe com uma lente de condensador (CL). Passe por um pinhole (PH) a 75 mm do CL para filtragem espacial.
    4. Lance o feixe filtrado espacialmente em uma fibra de modo único (SMF) usando um acoplador de fibra de modo único (FC) consistindo de um objetivo de 0,1 NA para focar o feixe de luz no SMF.
    5. Ajuste o acoplador de fibra para obter a máxima eficiência de acoplamento.
    6. Corrija a fibra para fora em tEtapa de varredura usando uma placa deslizante (SP). Coloque uma lente acromática (L2) a 50 mm da fibra SM para colimar o raio laser.
    7. Desvie o raio colimado em 90 ° usando um espelho elíptico controlável cinemático (M) para preencher a abertura traseira de outra lente acromática idêntica (L3). Coloque a lente acromática usada para focar em um suporte de tradução (TM2) usando um tubo de lente (LT).
    8. Passe o feixe de focagem através de um combinador de feixe optoacústico caseiro consistindo em um prisma de ângulo reto (RA) e um prisma de romboide (RP), com uma camada de óleo de silício (SO) no meio.
      NOTA: A camada de óleo de silício atuará como filme transparente e transparente acústica.
    9. Anexe uma lente acústica (AL) para fornecer focagem acústica (diâmetro focal: ~ 46 μm) na parte inferior do prisma romboidais.
    10. Coloque o transdutor ultra-sônico com uma freqüência central de 50 MHz em cima do prisma romboidal; Use uma camada de epoxi para acoplamento efetivo.
    3. 2. Comutação e Alinhamento do Sistema

    1. Fixar (apertando firmemente) a placa comutável caseira para um estágio motorizado de 3 eixos controlado por um controlador de 3 eixos conectado ao computador.
    2. Anexe o sistema de gaiolas AR e OR à placa caseira usando suportes de montagem de gaiola para permitir uma fácil troca entre as cabeças de varredura AR e OR. Deslize a cabeça de digitalização na parte superior da área de imagem.
    3. Use o andar Z para submergir a parte inferior da cabeça do scanner AR-OR-PAM em um tanque de acrílico cheio de água (13 cm x 30 cm x 3 cm) para acoplamento acústico.
    4. Abra uma janela de imagem com um diâmetro de 7 cm na placa inferior do tanque e selá-la com uma membrana de polietileno para transmissão óptica e acústica.
    5. Use um amplificador de eco de pulso e um osciloscópio para alinhar o transdutor de ultra-som em foco.
      1. Defina o ganho no amplificador de eco de pulso para 24 db no modo de transmissão / recepção.
      2. Use o sinal de sincronização frOm o amplificador de eco de pulso como o gatilho e detectar o sinal retrodifusado de um slide de vidro (inserido no fundo do tanque de água) usando um osciloscópio.
        NOTA: O slide deve ter uma fita preta presa a ele.
      3. Mova o eixo Z para maximizar a amplitude do sinal de eco de pulso (visto no osciloscópio).
        NOTA: Quando a placa de vidro está em foco, o eco terá sua amplitude máxima.
    6. Ligue o laser e conecte o UST a dois amplificadores, cada um com um ganho fixo de 24 dB, usando cabos BNC.
      NOTA: As saídas dos amplificadores estão conectadas ao cartão de aquisição de dados (DAQ).
    7. Use o sinal do fotodiodo (PD) colocado na frente do laser como um gatilho para o sistema de aquisição de dados.
    8. Em AR-PAM, variar a distância entre a lente cônica (con.L) eo condensador óptico (OC) para maximizar a amplitude do sinal fotoacústico gerado a partir do objeto de teste (fita preta presa em um slide de vidro).Certifique-se de que os focos ópticos e acústicos sejam confocais ao determinar a amplitude de sinal fotoacústica máxima (PA).
      1. Observe o atraso dos sinais máximos de PA; Use isso mais tarde para verificar o foco no software de aquisição de dados.
    9. Solte o parafuso da cabeça de varredura e troque manualmente a cabeça de digitalização de AR-PAM para OR-PAM. Em seguida, aperte os parafusos.
    10. Em OR-PAM, variar a distância entre o dupleto acromático de focagem (dentro do tubo da lente (LT)) e o combinador optoacústico para maximizar a amplitude do sinal PA mostrada no osciloscópio.
      1. Observe o atraso dos sinais máximos de PA.
        NOTA: Finetuning é necessário para determinar o arranjo confocal.

    3. Etapas experimentais

    1. Resolução lateral e quantificação de profundidade de imagem
      1. Use nanopartículas de ouro com 100 nm de diâmetro para determinar a resolução lateral da AR eD OU sistema.
      2. Diluir 0,1 mL de solução de nanopartículas com uma quantidade igual de água. Distribua 0,1 mL de solução diluída em uma folha de cobertura e coloque-a em contato com a membrana de polietileno embaixo do tanque.
      3. Certifique-se de que o AR-PAM e o OR-PAM estão focados no software de aquisição de dados (consulte a Tabela de Materiais) antes da digitalização (passos 2.8 e 2.10).
        NOTA: Ao conhecer o atraso de microssegundos dos sinais PA máximos das etapas 2.9 e 2.10, multiplicado pela taxa de amostragem (250 MS / s), a imagem estará focada no software de aquisição de dados. O atraso que deve ser omitido durante a aquisição de dados pode ser determinado no software de modo a salvar apenas os pontos de dados necessários para pós-processamento.
      4. Defina os parâmetros de varredura para o AR-PAM e pressione o botão "digitalizar" para iniciar a varredura raster.
        1. Defina os parâmetros de varredura para o AR-PAM no software de aquisição de dados em "4" mm / s velocidade de digitalização na "velocidade"; Guia "1" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "0,5" mm na guia "Y-scan range" e "0,5" mm na aba "X-scan range". Defina o tamanho do passo na direção x em "4" μm na guia "dx".
          NOTA: O tamanho do passo na direção y é determinado automaticamente a partir da velocidade da velocidade de varredura do estágio e da taxa de repetição do pulso (neste caso, 4.000 μm / 1.000 Hz = 4 μm)
      5. Defina os parâmetros de varredura para o OR-PAM e pressione o botão "digitalizar" para iniciar a varredura raster.
        1. Defina os parâmetros de varredura no software de aquisição de dados a uma velocidade de varredura de "2,5" mm / s na guia "velocidade", "5" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "0,5" mm na "faixa de varredura Y" Guia e "0,5" mm na guia "Varredura X-scan". Defina o tamanho do passo na direção x um "0,5" μm na aba "dx".
          NOTA: o sO tamanho do tep na direção y é determinado automaticamente a partir da velocidade da velocidade de varredura do estágio e da taxa de repetição do pulso (neste caso, 2.500 μm / 5.000 Hz = 0.5 μm).
      6. Certifique-se de que durante o processo de digitalização, os dados são continuamente capturados e armazenados no computador
        NOTA: Os dados serão capturados apenas em uma direção de movimento do estágio Y.
      7. Use os vários dados de B-scan armazenados no computador para recuperar as imagens de projeção de amplitude máxima (MAP) usando software de processamento de imagem (consulte a Tabela de Materiais ).
      8. Use uma única imagem de nanopartícula (de várias imagens) a partir da varredura para determinar a resolução lateral, traçando manualmente uma linha através da região central da imagem de nanopartículas para obter uma função de propagação de pontos, que se parece com a curva gaussiana. Veja a Figura 2 .
      9. Ajustar a função de propagação de pontos obtida a partir de uma única imagem de nanopartículas usando um GauSsian fit function e medir a largura total a meio máximo (FWHM) usando software de processamento de imagem (veja a Tabela de Materiais ). Use isso como a resolução lateral. Veja a Figura 2 .
      10. Insira um pedaço de fita preta obliquamente sobre um pedaço de tecido de frango fatiado como objeto alvo para imagens em profundidade. Coloque o tecido com a fita no tanque de água.
        NOTA: A fita preta está presa a uma placa de metal com uma ponta afiada, o que ajuda a prender a fita no tecido.
      11. Defina os parâmetros de varredura para o AR-PAM no software de aquisição de dados e, em seguida, pressione o botão "digitalizar" para capturar uma única imagem B-scan para determinar a profundidade máxima de imagem.
        1. Defina os parâmetros de varredura a uma velocidade de varredura de "15" mm / s na guia "velocidade", "1" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "5" cm na guia "Y-scan range" e "0.1 "Mm na guia" Varredura X-scan ". Set tEle pisa o tamanho na direção x em "0,1" mm na aba "dx".
      12. Defina os parâmetros de varredura para o OR-PAM e pressione o botão "digitalizar" para capturar uma única imagem de B-scan para determinar o departamento de imagens máximo.
        1. Defina os parâmetros de varredura no software de aquisição de dados como "15" mm / s velocidade de digitalização na guia "velocidade", "5" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "2" cm no "intervalo de varredura Y" Guia e "0,1" mm na guia "Varredura X-scan". Defina o tamanho da etapa na direção x em "0,1" mm na guia "dx".
          NOTA: uma vez que o alcance X-scan e dx são os mesmos, apenas uma B-scan será capturada. Os sinais de PA resolvidos no tempo multiplicados pela velocidade do som em tecidos macios (1.540 m / s) darão uma imagem da linha A. Várias linhas A são capturadas durante o movimento contínuo do estágio Y para produzir um B-scan.
    2. In vivo </ Em> imagem da vasculatura do sangue da orelha do mouse
      1. Use um mouse fêmea com peso corporal de 25 g e uma idade de 4 semanas.
      2. Anestesiar o animal usando um coquetel de cetamina (120 mg / kg) e xilazina (16 mg / kg) injetados intraperitonealmente (dose de 0,1 mL / 10 g).
      3. Retire o cabelo da orelha animal usando creme de depilação. Limpe a área limpa. Cubra o olho do animal com uma pomada ocular estéril para evitar que o raio laser disperso caia nos olhos.
      4. Posicione o animal em um palco que também tenha uma placa em miniatura para posicionar a orelha.
      5. Manter anestesia com isoflurano inalado (0,75% em 1 L / min de oxigênio) durante o período de imagem.
      6. Aperte um oxímetro de pulso na perna ou cauda do mouse e monitore o estado fisiológico. Permitir que a região de imagem esteja em contato com a membrana de polietileno usando um ultra-som.
      7. Defina os parâmetros de varredura para o AR-PAM e pressione o botão "digitalizar" para iniciar o scannIng.
        1. Defina os parâmetros de varredura do AR-PAM no software de aquisição de dados a uma velocidade de varredura de "15" mm / s na guia "velocidade", "1" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "10 mm" na seção " Guia "Varredura Y" e "6" mm na guia "Varredura X-scan". Defina o tamanho do passo na direção x como "30" μm na aba "dx".
          NOTA: O tamanho do passo na direção y é determinado automaticamente a partir da velocidade da velocidade de varredura do estágio e da taxa de repetição do pulso (neste caso, 15.000 μm / 1.000 Hz = 15 μm).
      8. Depois de terminar a varredura AR-PAM, mude a posição da cabeça de imagem de AR-PAM para OR-PAM (conforme descrito na seção 2).
      9. Defina os parâmetros de varredura para o OR-PAM e pressione o botão "digitalizar" para iniciar a varredura raster.
        1. Defina os parâmetros de varredura para o OR-PAM no software de aquisição de dados em "15" mm / s velocidade de varredura no "velocitE "guia", "5" kHz na guia "taxa de repetição de pulso", "10" mm na guia "Varredura Y" e "6" mm na guia "Varredura X-scan". Defina o tamanho da etapa Na direção x como "6" μm na aba "dx".
          NOTA: O tamanho do passo na direção y é determinado automaticamente a partir da velocidade da velocidade de varredura do estágio e da taxa de repetição do pulso (neste caso, 15.000 μm / 5.000 Hz = 2 μm).
      10. Use os vários dados de B-scan armazenados no computador para recuperar as imagens do MAP usando o software de processamento de imagem.
      11. Observe o animal durante todo o período de imagem.

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Representative Results

O esquema do sistema AR-OR-PAM é mostrado na Figura 1 . Nesta configuração, todos os componentes foram integrados e montados em uma configuração de gaiola óptica. O uso de um sistema de gaiola torna a cabeça de varredura AR-OR-PAM compacta e facilmente montada, alinhada e integrada em uma única etapa de digitalização.

A varredura de quadriculação contínua bidimensional da cabeça de imagem foi usada durante a aquisição da imagem. Os sinais de resolução de tempo resolvidos foram multiplicados pela velocidade do som (1.540 m / s) para obter uma linha A. Várias linhas A capturadas durante o movimento contínuo do estágio Y produziram a B-scan bidimensional. Múltiplos exames B da área de imagem foram capturados e armazenados no computador e foram usados ​​para processar e produzir as imagens fotoacústicas MAP.

Para determinar a resolução do sistema comutável, A imagem MAP de uma nanopartícula única foi usada 31 . A amplitude fotoacústica ao longo da direção lateral central da imagem foi plotada e ajustada a uma função Gaussiana. A FWHM do ajuste gaussiano foi considerada a resolução lateral. A resolução lateral medida para AR-PAM foi de 45 μm, como mostrado na Figura 2 a . Da mesma forma, uma única imagem de nanopartícula adquirida usando OR-PAM foi montada ao longo da direção lateral central para determinar a resolução do OR-PAM, como mostrado na Figura 2 b . A resolução lateral medida foi de 4 μm, determinada a partir do FWHM. A inserção da figura mostra a imagem MAP correspondente da nanopartícula de ouro. Teoricamente, a resolução lateral limitada de difracção óptica para AR-PAM é de 45 μm, determinada usando a seguinte equação: 0,72λ / NA, onde λ é o comprimento de onda acústico central e NA é o numéricoAbertura do transdutor ultra-sônico. A resolução teórica concorda bem com os dados experimentais. Da mesma forma, a resolução lateral teórica para OR-PAM é de 2,6 μm, calculada com a seguinte equação: 0,51λ / NA, onde λ é o comprimento de onda do laser e NA é a abertura numérica do objetivo. A resolução lateral medida experimentalmente para OR-PAM foi mais pobre do que a estimativa do limite de difracção, o que pode ser devido a aberrações de frente de onda. Uma vez que tanto AR como OU usam um transdutor semelhante e uma lente acústica, a resolução axial teórica será de 30 μm de acordo com 0,88 c / Δf, onde c é a velocidade do som em tecidos macios e Δ f é a largura de banda de freqüência do transdutor ultra-sônico . Além disso, a resolução lateral variará ao longo da direção axial tanto para OR-PAM 20 como para AR-PAM 32 . As resoluções laterais relatadas aqui estão no plano focal.

A Figura 3 a mostra a fotografia da fita preta no tecido de galinha. Uma única imagem B-scan foi capturada usando AR-PAM e OR-PAM. A Figura 3 b e a Figura 3 c mostram a imagem PA B-scan única de AR-PAM e OR-PAM, respectivamente. É evidente a partir da Figura 3b que o sistema AR-PAM pode ilustrar claramente a fita preta para ~ 7,8 mm abaixo da superfície do tecido. Da mesma forma, usando o sistema OR-PAM, foi possível imagem clara da fita preta para ~ 1,4 mm abaixo da superfície do tecido ( Figura 3 c ). A relação sinal-ruído (SNR) também foi determinada a partir das imagens. SNR é definido como V / n , onde <Em> V é a amplitude do sinal PA de pico a pico e n é o desvio padrão do ruído de fundo. O SNR medido em profundidades de imagem de 4,6 mm e 7,8 mm foi de 2,6 e 1,4, respectivamente. Para o OR-PAM, o SNR com uma profundidade de imagem de 1,4 mm foi 1,4. Para demonstrar a capacidade de imagem biológica do sistema AR-OR PAM comutável, a imagem de vasculatura de sangue in vivo foi realizada na orelha do mouse. Uma fotografia mostrando a anatomia vascular da orelha do mouse viva utilizada para a imagem é mostrada na Figura 4a . Usando AR-PAM, uma região de varredura de 10 mm x 6 mm foi visualizada, com um tamanho de passo de 15 μm na direção Y e 30 μm na direção X. A imagem demorou 10 min para completar. Atualmente, o sistema de imagem adquire dados apenas em uma direção; O tempo de aquisição pode ser reduzido para quase metade modificando o programa para ter uma capacidade bidirecional de aquisição de dados. Uma imagem MAP de AR-PAM é mostrada na Figura 4B. O close-up da região de interesse é mostrado na Figura 4 c . Uma área similar escaneada usando OR-PAM, com um tamanho de passo de 3 μm na direção Y e 6 μm na direção X, é mostrada na Figura 4 d . A imagem demorou 46 min para completar. O close-up da região de interesse é mostrado na Figura 4 e . OR-PAM pode resolver claramente capilares únicos, que AR-PAM não pode resolver. AR-PAM pode resolver vasos com mais de 45 μm.

Em resumo, um sistema AR-OR-PAM comutável que pode obter imagens de alta resolução utilizando focagem ótica apertada, bem como imagem em profundidade usando foco acústico, foi desenvolvido. O desempenho do sistema AR-OR-PAM comutável foi quantificado usando medidas de resolução lateral e profundidade de imagem. Stud in vivoTambém foram realizadas para mostrar a sua capacidade de imagem biológica. Este sistema de microscopia fotoacústica comutável pode fornecer alta resolução temporal e espacial, tornando o sistema importante para aplicações, incluindo imagens de angiogênese, resposta de drogas, etc. , onde imagens de capilares únicos e vasculaturas profundas são importantes. Outras modificações ou melhorias no sistema podem ser feitas substituindo a placa comutável caseira por um estágio motorizado móvel de 10 cm (eixo dos eixos). A resolução lateral do OR-PAM pode ainda ser melhorada corrigindo as aberrações da frente de onda. O fornecimento de uma energia de pulso mais alta ao AR-PAM também irá melhorar o SNR e as profundidades de imagem.

No caso de OR-PAM, assumindo que o foco óptico é de 150 μm abaixo da superfície da pele para imagens in vivo , o tamanho do ponto da superfície era de 22,5 μm de diâmetro. Entregar um único pulso laser de 90 nJ dá uma maEnergia de pulso ximum de 20,4 mJ / cm 2 . Para o AR-PAM, o foco do laser foi de 2 mm de diâmetro. A liberação de um único pulso laser de 50 μJ proporciona uma energia de pulso máxima no ponto focal de 1,6 mJ / cm 2 , bem dentro do limite de segurança ANSI de 20 mJ / cm 2 , 33 .

figura 1
Figura 1 : Esquema do sistema de imagem AR-OR-PAM. (A) BS: amostrador de feixe, NDF: filtro de densidade neutra, RAP - prisma angular direito, PD: fotodiodo, CL: lente do condensador, PH: pinhole, FC: acoplador de fibra, UST: transdutor de ultra-som, MMF: fibra multimodo, SMF: Fibra de modo único, DAQ: cartão de aquisição de dados, TS: estágio de tradução, Con.L: lente cônica, L1: lente convexa, L2 e L3: lente acromática, RA: prisma de ângulo reto, RP: prisma romboidal, OC: óptico Condensador, M: mIrror, SP: placa de deslizamento, LT: tubo de lente, TM: montagem de tradução, KMM: montagem de espelho cinemático e AL: lente acústica. ( B ) Fotografia do protótipo do sistema AR-OR-PAM. ( C ) Close-up do combinador de feixe optoacústico. ( D ) Close-up do condensador óptico com um UST no centro. Reimpresso da referência 34 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 2
Figura 2 : Teste de resolução lateral do sistema AR-OR-PAM: resolução lateral estimada por imagens de nanopartículas de ouro ~ 100 nm de diâmetro. Pontos pretos (*): sinal fotoacústico; Linha azul: curva gaussiana para ( a ) AR-PAM e ( b )OR-PAM. A inserção mostra a imagem AR-PAM representativa na imagem (a) e OR-PAM em (b) da nanopartícula de ouro única. Reimpresso da referência 34 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

Figura 3
Figura 3 : Medições de profundidade de imagem: imagem de PA simples de B-scan de uma fita preta inserida obliquamente em tecido de frango. (A) Diagrama esquemático. ( B ) imagem AR-PAM. ( C ) imagem OR-PAM. Reimpresso da referência 34 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.


Figura 4 : Imagem fotoacústica in vivo de uma orelha de mouse: ( a ) Fotografia da vasculatura da orelha do mouse. (B) imagem AR-PAM. ( C ) Close-up da região de interesse (ROI) em ( b ), como mostrado por uma linha tracejada branca. ( D ) imagem OR-PAM. ( E ) Região de interesse (ROI) em ( d ), como mostrado por uma linha pontilhada branca. ( F ) Imagem inicial da linha branca ROI em (e) mostrando um único capilar. Reimpresso da referência 34 com permissão. Clique aqui para ver uma versão maior dessa figura.

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Discussion

Em conclusão, foi desenvolvido um sistema AR e OU PAM comutável que pode atingir imagens de alta resolução em profundidades de imagem mais baixas e imagens de baixa resolução em maiores profundidades de imagem. A resolução lateral e a profundidade de imagem do sistema comutável foram determinadas. As vantagens deste sistema PAM comutável incluem: (1) a imagem de alta resolução usando focagem óptica apertada; (2) a imagem profunda do tecido usando focagem acústica; 3) a iluminação do campo escuro para AR-PAM, que impede que os sinais de PA fortes apareçam na superfície da pele; 4) a capacidade de manter a amostra em um só lugar, sem movê-la entre os diferentes sistemas; 5) a possibilidade de evitar o uso de múltiplos lances e etapas de digitalização; E 6) o uso mínimo de componentes caseiros. Esta é a primeira combinação relatada de OR-PAM e AR-PAM de campo escuro que fornece imagens de alta resolução, de profundidade superficial e imagens de tecido profundo de baixa resolução da mesma amostra sem mover a amostra / obJect. O uso do mesmo estágio de digitalização e laser torna o sistema eficiente e econômico. O sistema combinado tem uma resolução lateral de 4 μm com uma profundidade de imagem de 1,4 mm, bem como uma resolução lateral de 45 μm com uma profundidade de imagem de 7,8 mm. O sistema é feito de um sistema de gaiola óptica com componentes caseiros mínimos, tornando mais fácil montar, alinhar e alternar entre AR e OR PAM. A cabeça de digitalização combinada é compacta e pode ser facilmente montada em uma única etapa de digitalização. Usando o sistema combinado, a imagem in vivo foi demonstrada com sucesso.

O sistema desenvolvido pode ser usado para imagens pré-clínicas. As principais aplicações pré-clínicas incluem a imagem da angiogênese, microrganismos tumorais, microcirculação, resposta ao fármaco, funções cerebrais, biomarcadores e atividades genéticas. As limitações do sistema incluem o tempo de digitalização. Um tempo de digitalização longo é atualmente necessário, mas pode ser reduzido pela aquisição de dados em botH direções. A aquisição simultânea de imagens entre OR-PAM e AR-PAM não é possível no momento. Atualmente, a troca manual entre OR-PAM e AR-PAM é necessária, o que pode ser evitado usando um estágio de tradução que tenha pelo menos 10 cm de movimento direcional de Y. Os passos críticos no protocolo incluem a determinação confocal do foco óptico e acústico; A realização de um ponto óptico tamanhos inferiores a 5 μm para OR-PAM, para imagem de capilares únicos; E o design do combinador de feixe optoacústico para o OR-PAM e do condensador óptico para o AR-PAM.

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Disclosures

Todas as experiências com animais foram realizadas de acordo com as diretrizes e regulamentos aprovados do Comitê Institucional de Cuidados e Uso Animal da Universidade Tecnológica de Nanyang, Cingapura (Número de Protocolo Animal ARF-SBS / NIE-A0263). Os autores não têm interesses financeiros relevantes no manuscrito e nenhum outro potencial conflito de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Os autores gostariam de reconhecer o apoio financeiro de uma subvenção Nível 2 financiada pelo Ministério da Educação em Singapura (ARC2 / 15: M4020238). Os autores também agradecem ao Sr. Chow Wai Hoong Bobby pela ajuda da maquina.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q-switched Nd:YAG laser Edgewave BX80-2-L Pump laser 
Credo-High Repetition Rate Dye Laser Spectra physics CREDO-DYE-N Dye laser
Precision Linear Stage Physik Instrumente PLS 85  XY raster scanning stage
Translation stage Physik Instrumente VT 80  Confocal determine
Mounted Silicon photodiode Thorlabs SM05PD1A Triggering/Pulse variation
Motorized continuous Rotational stage  Thorlabs CR1/M-Z7 Diverting laser beam
Mounted Continuously Variable ND Filter Thorlabs NDC-50C-4M Intensity variable
Fiber Patch Cable Thorlabs M29L01 Multimode fiber
Microscope objective Newport M-10X Objective 
XY translating mount Thorlabs CXY1 Translating mount
Plano convex lens Thorlabs LA1951 Collimating lens
Conical lens  Altechna APX-2-B254 Ring shape beam
Translation stage Thorlabs CT1 Translating stage
Optical condenser Home made
Ultrasonic transducer Olympus-NDT V214-BB-RM 50MHz transducer
Plano concave lens Thorlabs LC4573 Acoustic lens
Pulser/Receiver Olympus-NDT 5073PR Pulse echo amplifier 
Mounted standard iris Thorlabs ID12/M Beam shaping
Plano convex lens Thorlabs LA4327 Condenser lens
Mounted precision pinhole Thorlabs P50S Spatial filtering
Single mode fiber patch cable Thorlabs P1-460B-FC-1 Single mode fiber
Fiber coupler Newport F-91-C1 Single mode coupling
Achromatic doublet lens Edmund Optics 32-317 Achromatic doublet
Protected silver elliptical mirror Thorlabs PFE10-P01 Mirror
Right angle kinematic mirror mount Thorlabs KCB1 Mirror mount
Z-Axis Translation Mount Thorlabs SM1Z z translator
Lens tube Thorlabs SM05L10
UV Fused Silica Right-Angle Prism Thorlabs PS615 Right angle prism
Rhomboid prism Edmund Optics 47-214 Shear wave
Dimethylpolysiloxane Sigma Aldrich DMPS1M Silicon oil
Amplifier Mini Circuits ZFL-500LN Amplifier
16 bit high speed digitizer Spectrum M4i.4420 Data acquisition card
Oscilloscope Agilent Technologies DS06014A
Mice  InVivos Pte.Ltd ICR Animal model
Ultrasound gel  Progress/parker acquasonic gel PA-GEL-CLEA-5000 Acoustic coupling
Water tank Home made
Translation stage Homemade Switching AR-OR
Gold nanoparticles Sigma Aldrich 742031 Lateral resolution
Sterile ocular ointment Alcon Duratears Animal imaging
1951 USAF resolution test target Edmund Optics 38257 Confocal alignment
Data acquisition software National Instrument Labview Home made software using Labview
Image Processing software Mathworks Matlab Home made program using Matlab

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References

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Bioengineering microscopia fotoacústica de resolução acústica microscopia fotoacústica de resolução óptica imagem fotoacústica fotoacústica, AR-PAM OR-PAM microscopia sistema de microscopia combinada
Microscopia fotoacústica de resolução acústica e óptica comutável para<em&gt; In Vivo</em&gt; Imagem de Vasculatura de Sangue de Pequeno Animal
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Moothanchery, M., Sharma, A.,… More

Moothanchery, M., Sharma, A., Pramanik, M. Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging. J. Vis. Exp. (124), e55810, doi:10.3791/55810 (2017).

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