Waiting
Login-Verarbeitung ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

Byttbar akustisk og optisk oppløsning Photoacoustic Microscopy for Published: June 26, 2017 doi: 10.3791/55810
Automatic Translation
1, 1, 1
1School of Chemical and Biomedical Engineering, Nanyang Technological University

Summary

Her er det vist en akustisk oppløsning (AR) og optisk oppløsning (OR) fotoakustisk mikroskopi (AR-OR-PAM) som er i stand til både høyoppløselig bildebehandling ved grunne dybder og lavoppløselig dyp vevsavbildning på samme prøve in vivo .

Abstract

Photoacoustic microscopy (PAM) er en raskt voksende invivo avbildningsmodalitet som kombinerer både optikk og ultralyd, og gir penetrering utover den optiske middelfrie banen (~ 1 mm i huden) med høy oppløsning. Ved å kombinere optisk absorpsjonskontrast med den høye romlige oppløsningen av ultralyd i en enkelt modalitet, kan denne teknikken trenge inn i dype vev. Fotoakustiske mikroskopisystemer kan enten ha en lav akustisk oppløsning og sonde dypt eller en høy optisk oppløsning og sonde grundig. Det er utfordrende å oppnå høy romlig oppløsning og stor dybdeinntrenging med et enkelt system. Dette arbeidet presenterer et AR-OR-PAM-system som er i stand til både høyoppløselig bildebehandling på grunne dyp og lavoppløselig dypvevsbilding av samme prøve in vivo . En lateral oppløsning på 4 μm med 1,4 mm billeddybde ved hjelp av optisk fokusering og en lateral oppløsning på 45 μm med 7,8 mm billeddybde ved bruk av akustisk fokusering var vellykketDemonstreres ved bruk av det kombinerte systemet. Her utføres i-vivo blodkar-vaskulaturbilde for å demonstrere biologisk avbildningskapasitet.

Introduction

Optiske bildemodeller med høy oppløsning, for eksempel optisk koherensomografi, konfokal mikroskopi og multikoponmikroskopi, har mange fordeler. Imidlertid reduseres den romlige oppløsningen betydelig ettersom bildedybden øker. Dette skyldes den diffuse naturen av lett transport i bløtvev 1 , 2 . Integrasjonen av optisk eksitasjon og ultralydsdeteksjon gir en løsning for å overvinne utfordringen ved optisk oppløsning med høy oppløsning i dype vev. Photoacoustic microscopy (PAM) er en slik modalitet som kan gi dypere bildebehandling enn andre optiske bildemodeller. Det har blitt vellykket anvendt til in vivo strukturelle, funksjonelle, molekylære og cellebilder 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 studier ved å kombinere den sterke optiske absorpsjonskontrasten med den høye romlige oppløsningen fra ultralyd.

I PAM bestråler en kort laserpuls vevet / prøven. Lysopptaket av kromoforer ( f.eks. Melanin, hemoglobin, vann etc. ) resulterer i en temperaturøkning, noe som igjen resulterer i produksjon av trykkbølger i form av akustiske bølger (fotoakustiske bølger). De genererte fotoakustiske bølgene kan detekteres av en bredbånds ultralydstransduser utenfor vevgrensen. Ved å bruke svakt optisk og tett akustisk fokusering, kan dypvevsbilding oppnås i akustisk oppløsning fotoakustisk mikroskopi (AR-PAM) 14 , 15 , 16 . I AR-PAM, en lateral oppløsning på 45 μm og en bildedybde opp til 3 mm har blitt påvist 15 . For å løse enkelte kapillærer (~ 5 μm) akustisk, er ultralydstransdusere som opererer ved> 400 MHz sentrale frekvenser påkrevd. Ved slike høye frekvenser er penetreringsdybden mindre enn 100 μm. Problemet med stram akustisk fokusering kan løses ved å bruke stramt optisk fokusering. Optisk oppløsning fotoakustisk mikroskopi (OR-PAM) er i stand til å løse enkelte kapillærer, eller til og med en enkelt celle 17 , og en lateral oppløsning på 0,5 μm er oppnådd 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 . Bruken av en fotonisk nanojet kan bidra til å oppnå en oppløsning utover den diffraksjonsbegrensede resolutioN 25 , 26 . I OR-PAM er penetrasjonsdybden begrenset på grunn av lysfokusering, og den kan opp til 1,2 mm i det biologiske vevet 23 . Derfor kan AR-PAM bildet dypere, men med en lavere oppløsning, og OR-PAM kan bilde med svært høy oppløsning, men med begrenset bildedybde. Imaginghastigheten til AR- og OR-PAM-systemet avhenger hovedsakelig av pulsrepetisjonen av laserkilden 27 .

Kombinere AR-PAM og OR-PAM vil være til stor nytte for applikasjoner som krever både høy oppløsning og dypere bildebehandling. Det er gjort lite arbeid for å kombinere disse systemene sammen. Vanligvis brukes to forskjellige bildebehandlingsskannere til bildebehandling, noe som krever at prøven flyttes mellom begge systemene, noe som gjør det vanskelig å utføre in vivo- bildebehandling. Imidlertid gjør hybridbilding med både AR og OR PAM mulighet for avbildning med skalerbare resolusjoner aNd dybder. I en tilnærming brukes en optisk fiberbunt til å levere lys for både AR og OR PAM. I denne tilnærmingen benyttes to separate lasere (en høyenergilaser ved 570 nm for AR og en lav-energi, høyrepeteringshastighetslaser ved 532 nm for OR), noe som gjør systemet ubeleilig og kostbart 28 . OR-PAM laserbølgelengden er fast, og mange studier, som for eksempel på oksygenmetning, er ikke mulige ved bruk av dette kombinerte systemet. Sammenligningsstudier mellom AR og OR PAM er heller ikke mulige på grunn av forskjellen i laserbølgelengder mellom AR og OR. Dessuten bruker AR-PAM lysfeltbelysning; Derfor begrenser sterke bildeakustiske signaler fra hudflaten bildekvaliteten. Av denne grunn kan systemet ikke brukes til mange bioimaging applikasjoner. I en annen tilnærming til å utføre AR og OR PAM, blir det optiske og ultralydfokuset skiftet, noe som gjør lysfokus og ultralydfokus ujevnt. Bildekvaliteten er således ikke optimal 30 . I alle disse tilfellene brukte AR-PAM ikke mørkfeltbelysning. Bruken av mørkfeltbelysning kan redusere genereringen av sterke fotoakustiske signaler fra hudoverflaten. Derfor kan dypvevsbilding utføres ved hjelp av ringformet belysning, da deteksjonsfølsomheten til dype fotoakustiske signaler blir høyere sammenlignet med lysfeltbelysningen.

Dette arbeidet rapporterer et omstillbart AR og OR PAM (AR-OR-PAM) bildebehandlingssystem som er i stand til både høyoppløselig bildebehandling og lavoppløselig dypvevsbilding av samme prøve, med samme laser og skanner for begge systeneEMS. Utførelsen av AR-OR-PAM-systemet ble karakterisert ved å bestemme den romlige oppløsningen og bildedybden ved hjelp av fantomeksperimenter. In vivo ble blodvaskekarbeider utført på et musearm for å demonstrere sin biologiske avbildningskapasitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til godkjente forskrifter og retningslinjer fra Institutt for dyrepleie og bruk av Nanyang Technological University, Singapore (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263).

1. AR-OR-PAM-system ( figur 1 )

  1. Systemkonfigurasjon: AR-PAM
    1. Bruk et nanosekund avstivbart lasersystem bestående av en diodepumpet, solid-state Nd-YAG laser (532 nm) og en fargelaser med et innstillingsområde på 559-576 nm som den optiske bestrålingskilden. Still laserbølgelengden til 570 nm ved hjelp av en ekstern kontroller og repetisjonshastigheten til laseren til 1 kHz ved hjelp av lasersoftwaren.
    2. Plasser en stråle sampler i en 45 graders vinkel foran laseren for å omdirigere 5% av laserkraften til en fotodiode gjennom et variabelt nøytralt tetthetsfilter (NDF1; OD = 0-4.0).
    3. Viderebehandle laserstrålen etter stråleprøven på 90 ° medEt rettvinklet prisme (RAP1).
    4. Bruk en annen rettvinkelsprisme (RAP2) slik at strålen kan passere gjennom et variabelt nøytralt tetthetsfilter (NDF2; OD = 0-4.0) og på en multimodefiber (MMF), dirigere den gjennom en fiberkobler (FC) -a Kombinasjon av mål (numerisk blenderåpning (NA): 0,25) og en XY-oversetter.
    5. Fest fiberen på skannefasen ved hjelp av en XY-oversetter. Plasser en plano-konveks linse (L1) 25 mm fra fiberutgangen for å kollimere strålen ut av fiberen.
    6. Pass den kollimerte strålen gjennom et konisk objektiv med en apexvinkel på 130 ° for å generere en ringformet stråle. Fokuser den ringformede strålen sakte på motivet ved hjelp av en hjemmelaget optisk kondensator (OC) med konusvinkler på 70 ° og 110 ° og med et hull i midten.
    7. Plasser en 50 MHz ultralydstransduser (UST) med en akustisk linse (AL) i midten av den hjemmelagede kondensatoren.
  2. Systemkonfigurasjon: OR-PAM
    1. Bruk enNanosekund tunbart lasersystem bestående av en diodepumpet, solid-state Nd-YAG laser (532 nm) og en fargelaser med et innstillingsområde på 559 - 576 nm som den optiske bestrålingskilden. Still laserbølgelengden ved 570 nm ved hjelp av en ekstern kontroller og repetisjonshastigheten til laseren ved 5 kHz ved hjelp av lasersoftwaren.
    2. Roter det datastyrte rotasjonsstadiet (holder RAP1) med 90 ° for å avlede laserstrålen på en iris for omforming.
    3. Demp laserstrålen til å plassere et variabelt nøytralt tetthetsfilter (OD: 0-4.0) langs strålen og fokuser deretter strålen med en kondensorlins (CL). Pass det gjennom en pinhole (PH) 75 mm unna CL for romlig filtrering.
    4. Start den romlig filtrerte strålen på en enkeltmodusfibre (SMF) ved hjelp av en enkeltmodus fiberkobling (FC) bestående av et 0,1 NA-objektiv for å fokusere lysstrålen på SMF.
    5. Juster fiberkoblingen for å oppnå maksimal koblingseffektivitet.
    6. Fest fiberen på tHan skanner scenen ved hjelp av en slipplate (SP). Plasser en achromatisk linse (L2) 50 mm fra SM-fiberen for å kollimere laserstrålen.
    7. Viderekoble den kollimerte strålen med 90 ° ved hjelp av et kinematisk kontrollerbart elliptisk speil (M) for å fylle bakåbningen av en annen identisk achromatisk linse (L3). Plasser den achromatiske linse som brukes til å fokusere på et oversettelsesfeste (TM2) ved hjelp av et objektivrør (LT).
    8. Passer fokuseringsstrålen gjennom en hjemmelaget optoakustisk strålekombinator bestående av et rettvinklet prisme (RA) og et rhomboid prisme (RP), med et lag silisiumolje (SO) i mellom.
      MERK: Silisiumoljelaget fungerer som optisk gjennomsiktig og akustisk reflekterende film.
    9. Fest en akustisk linse (AL) for å gi akustisk fokusering (brennvidde: ~ 46 μm) nederst på rhomboidprismen.
    10. Plasser ultralydstransduseren med en 50 MHz senterfrekvens på toppen av rhomboid prisma; Bruk et epokallag for effektiv kobling.
    3. 2. Systembytte og justering

    1. Fest (ved å skru fast) den hjemmelagde bryterplaten til et 3-akset motorisert trinn som styres av en 3-akset kontroller koblet til datamaskinen.
    2. Fest AR- og OR-bursystemet til hjemmelaget tallerken ved hjelp av monteringsbraketter for montering, slik at du enkelt kan bytte mellom AR- og OR-skannehodene. Skyv skannehodet på toppen av bildeområdet.
    3. Bruk Z-scenen til å senke bunnen av AR-OR-PAM-skanneren i en vannfylt akryltank (13 cm x 30 cm x 3 cm) for akustisk kopling.
    4. Åpne et bildevindu med en diameter på 7 cm på tankens bunnplate og tett den med en polyetylenmembran for optisk og akustisk overføring.
    5. Bruk en puls-ekkoforsterker og et oscilloskop for å justere ultralydsområdet i fokus.
      1. Sett forsterkningen i pulsekoforsterkeren til 24 db i overføring / mottaksmodus.
      2. Bruk synkroniseringssignalet frOm puls-ekkoforsterkeren som utløseren og oppdag det tilbakespredte signalet fra et glideskinne (satt inn fra bunnen av vanntanken) ved hjelp av et oscilloskop.
        MERK: Lysbildet skal ha svart tape fast på den.
      3. Flytt Z-aksen for å maksimere amplituden til puls-ekkosignalet (sett på oscilloskopet).
        MERK: Når glassplaten er i fokus, vil ekkoet ha sin maksimale amplitude.
    6. Slå på laseren og koble UST til to forsterkere, hver med 24 dB fast forsterkning, ved hjelp av BNC kabler.
      MERK: Utgangene til forsterkerne er koblet til datainnsamlingskortet (DAQ).
    7. Bruk signalet fra fotodioden (PD) plassert foran laseren som en utløser for datainnsamlingssystemet.
    8. I AR-PAM varierer avstanden mellom det koniske objektivet (con.L) og den optiske kondensatoren (OC) for å maksimere amplituden til det fotoakustiske signalet som genereres fra testobjektet (svart tape fast på en glideskinne).Kontroller at de optiske og akustiske fokusene er konfokale ved å bestemme maksimal bildeakustisk (PA) signalamplitude.
      1. Legg merke til forsinkelsen av de maksimale PA-signalene; Bruk dette senere for å sjekke fokuset i datainnsamlingsprogramvaren.
    9. Løsne skruen på skannehode og skift skannehode manuelt fra AR-PAM til OR-PAM. Deretter trekker du skruene.
    10. I OR-PAM varierer avstanden mellom den fokuserende achromatiske dubletten (inne i objektivrøret (LT)) og den optoakustiske kombinatoren for å maksimere PA-signalamplituden vist på oscilloskopet.
      1. Legg merke til forsinkelsen av de maksimale PA-signalene.
        MERK: Finetuning er nødvendig for å bestemme konfokalarrangementet.

    3. Eksperimentelle trinn

    1. Lateral oppløsning og bilde dybdekvantifisering
      1. Bruk gull nanopartikler 100 nm i diameter for å bestemme sideløsningen av AR anD OR-systemet.
      2. Fortynn 0,1 ml nanopartikkeloppløsning med like mye vann. Fordel 0,1 mL fortynnet oppløsning på en deksel og plasser den i kontakt med polyetylenmembranen under tanken.
      3. Kontroller at AR-PAM og OR-PAM er i fokus i datainnsamlingsprogramvaren (se Materialebeskrivelsen) før skanning (trinn 2.8 og 2.10).
        MERK: Ved å kjenne mikrosekundforsinkelsen til de maksimale PA-signalene fra trinn 2.9 og 2.10, multiplisert med samplingshastigheten (250 MS / s), vil bildet være i fokus i datainnsamlingsprogramvaren. Forsinkelsen som må utelates under datainnsamling, kan bestemmes i programvaren for å lagre kun de nødvendige datapunktene for etterbehandling.
      4. Still inn skanneparametrene for AR-PAM og trykk på "scan" -knappen for å starte raster-skanning.
        1. Still inn skanneparametrene for AR-PAM i datainnsamlingsprogramvaren ved "4" mm / s skannehastighet i "hastigheten"; Kategorien "1" kHz i kategorien "Pulsrepetisjon", "0,5" mm i kategorien "Y-scan-område" og "0,5" mm i kategorien "X-scan-område". Still trinnstørrelsen i x-retningen på "4" μm i "dx" -fanen.
          MERK: Trinnstørrelsen i y-retningen bestemmes automatisk fra skanningshastighetshastigheten til scenen og pulsrepetisjonen (i dette tilfellet 4000 μm / 1000 Hz = 4 μm)
      5. Still inn skanneparametrene for OR-PAM og trykk på "scan" -knappen for å starte raster-skanning.
        1. Still inn skanneparametrene i datainnsamlingsprogramvaren ved "2.5" mm / s skannehastighet i "hastighet" -fanen, "5" kHz i "Pulsrepetisjonstast" -fanen, "0,5" mm i "Y-scan-området" Fanen og "0,5" mm i kategorien "X-scan-område". Still trinnstørrelsen i x-retningen en "0,5" μm i "dx" -fanen.
          MERK: STepestørrelsen i y-retningen bestemmes automatisk fra skannehastighetshastigheten til scenen og pulsrepetisjonen (i dette tilfellet 2.500 μm / 5000 Hz = 0,5 μm).
      6. Forsikre deg om at i løpet av skanneprosessen blir dataene kontinuerlig fanget og lagret på datamaskinen
        MERK: Data vil bli tatt kun i en bevegelsesretning av Y-scenen.
      7. Bruk de flere B-scan-dataene som er lagret i datamaskinen, for å hente maksimal amplitudeprojeksjon (MAP) -bilder ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare (se Materialebordet ).
      8. Bruk et enkelt nanopartikkelbilde (ut av flere bilder) fra skanningen for å bestemme sideløsningen ved å manuelt plotte en linje gjennom den sentrale delen av nanopartikkelbildet for å oppnå en punktspredningsfunksjon som ligner Gaussisk kurve. Se figur 2 .
      9. Tilpass punktspredningsfunksjonen oppnådd fra et enkelt nanopartikkelbilde ved hjelp av en GauSsian fit funksjon og måle full bredde ved halv maksimal (FWHM) ved hjelp av bildebehandling programvare (se Materialetabellen ). Bruk dette som sidestyring. Se figur 2 .
      10. Sett et stykke svart tape skråt på et stykke skiver kyllingvev som målobjekt for dybdeavbildning. Plasser vevet med båndet i vanntanken.
        MERK: Det svarte båndet sitter fast på en metallplate med en skarp spiss som bidrar til å feste båndet på vevet.
      11. Sett skanneparametrene for AR-PAM inn i datainnsamlingsprogramvaren, og trykk deretter på "scan" -knappen for å fange opp et enkelt B-skannebilde for å bestemme maksimal bildedybde.
        1. Still inn skanneparametrene ved "15" mm / s skannehastighet i kategorien "hastighet", "1" kHz i kategorien "Pulsrepetisjon", "5" cm i "Y-scan-området" -fanen og "0,1" "Mm i" X-scan-området "-fanen. Sett tHan stiger størrelse i x-retningen på "0.1" mm i "dx" -fanen.
      12. Still inn skanneparametrene for OR-PAM og trykk på "scan" -knappen for å ta opp et enkelt B-skannebilde for å bestemme maksimal bildeavbildning.
        1. Still inn skanneparametrene i datainnsamlingsprogramvaren som "15" mm / s skannehastighet i "hastighet" -fanen, "5" kHz i kategorien "pulsrepetisjon", "2" cm i "Y-scan-området" Tab og "0.1" mm i kategorien "X-scan range". Still trinnstørrelsen i x-retningen på "0.1" mm i "dx" -fanen.
          MERK: Siden X-scan-området og dx er de samme, blir bare en B-skanning fanget. De tidsbestemte PA-signalene multiplisert med lydhastigheten i bløtvev (1.540 m / s) vil gi et A-linjebilde. Flere A-linjer fanges under kontinuerlig bevegelse av Y-scenen for å produsere en B-scan.
    2. In vivo </ Em> avbildning av musens øreblodvaskulatur
      1. Bruk en kvinnelig mus med en kroppsvekt på 25 g og en alder av 4 uker.
      2. Bedøv dyret med en cocktail av ketamin (120 mg / kg) og xylazin (16 mg / kg) injisert intraperitonealt (dosering på 0,1 ml / 10 g).
      3. Fjern håret fra dyrøret ved å bruke hårfjerningskrem. Tørk området ren. Dekk øynene til dyret med en steril okulær salve for å unngå at spredt laserstråle faller på øynene.
      4. Plasser dyret på et stadium som også har en miniatyrplate for å plassere øret.
      5. Oppretthold anestesi med inhalert isofluran (0,75% i 1 liter / min oksygen) i bildeperioden.
      6. Klem et pulsoksymeter til musens ben eller hale og følg fysiologisk status. Tillat bildesystemet å være i kontakt med polyetylenmembranen ved hjelp av ultralyd gel.
      7. Still inn skanneparametrene for AR-PAM og trykk på "scan" -knappen for å starte raster scaning.
        1. Angi skanneparametrene for AR-PAM i datainnsamlingsprogramvaren ved "15" mm / s skannehastighet i "hastighet" -fanen, "1" kHz i "Pulsrepetisjonstast" -fanen, "10 mm" i " Y-scan-område "-fanen og" 6 "mm i kategorien" X-scan-område ". Still trinnstørrelsen i x-retningen som "30" μm i "dx" -fanen.
          MERK: Trinnstørrelsen i y-retningen bestemmes automatisk fra skanningshastighetshastigheten til scenen og pulsrepetisjonen (i dette tilfellet 15.000 μm / 1000 Hz = 15 μm).
      8. Etter at du har fullført AR-PAM-skanning, bytt posisjoneringshodeposisjonen fra AR-PAM til OR-PAM (som beskrevet i avsnitt 2).
      9. Still inn skanneparametrene for OR-PAM og trykk på "scan" -knappen for å starte raster-skanning.
        1. Still inn skanneparametrene for OR-PAM i datainnsamlingsprogramvaren ved "15" mm / s skannehastighet i "velocitY "Tab" 5 "kHz i kategorien" Pulsrepetisjon "," 10 "mm i" Y-scan-området "-kategorien og" 6 "mm i" X-scan-området "-fanen. Still inn strekstørrelsen I x-retningen som "6" μm i "dx" -fanen.
          MERK: Trinnstørrelsen i y-retningen bestemmes automatisk fra skanningshastighetshastigheten til scenen og pulsrepetisjonen (i dette tilfellet 15.000 μm / 5000 Hz = 2 μm).
      10. Bruk de flere B-scan-dataene som er lagret i datamaskinen, for å hente MAP-bildene ved hjelp av bildebehandlingsprogramvare.
      11. Vær oppmerksom på dyret under hele bildeperioden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Skjematisk for AR-OR-PAM-systemet er vist i figur 1 . I dette oppsettet ble alle komponenter integrert og montert i et optisk buropsett. Bruken av et bursystem gjør AR-OR-PAM-skannehodet kompakt og enkelt montert, justert og integrert i en enkelt skanningstrinn.

Todimensjonal kontinuerlig raster-skanning av bildehodet ble brukt under bildeoppkjøpet. De tidsbestemte PA-signalene ble multiplisert med lydens hastighet (1.540 m / s) for å oppnå en A-linje. Flere A-linjer fanget under kontinuerlig bevegelse av Y-scenen ga den todimensjonale B-skanning. Flere B-skanninger av bildeområdet ble fanget og lagret i datamaskinen og ble brukt til å behandle og produsere MAP-bildeakustiske bilder.

For å bestemme oppløsningen til det byttbare systemet, Ble MAP-bildet av en enkelt nanopartikkel brukt 31 . Den fotoakustiske amplitude langs den sentrale sidestyringen av bildet ble plottet og montert på en Gaussisk funksjon. FWHM av den gaussiske passformen ble ansett som den laterale oppløsningen. Den målte laterale oppløsningen for AR-PAM var 45 μm, som vist i figur 2 a . På samme måte ble et enkelt nanopartikkelbilde oppnådd ved hjelp av OR-PAM montert langs den sentrale laterale retning for å bestemme oppløsningen av OR-PAM, som vist i figur 2b . Den målte laterale oppløsningen var 4 μm, bestemt fra FWHM. Innsnittet i figuren viser det tilsvarende MAP-bildet av gullnanopartiet. Teoretisk sett er den optiske diffraksjonsbegrensede laterale oppløsningen for AR-PAM 45 μm bestemt ved bruk av følgende ligning: 0,72 A / NA, hvor A er den sentrale akustiske bølgelengden og NA er den numeriskeBlenderåpning av ultralydstransduseren. Den teoretiske oppløsningen stemmer godt overens med eksperimentelle data. På samme måte er den teoretiske laterale oppløsningen for OR-PAM 2,6 μm, beregnet med følgende ligning: 0,51λ / NA, hvor λ er laserbølgelengden og NA er numerisk blenderåpning for målet. Den eksperimentelt målte laterale oppløsningen for OR-PAM var dårligere enn diffraksjonsgrensestimatet, som kan skyldes bølgefrontavvik. Siden både AR og OR bruker en lignende transduser og akustisk linse, vil den teoretiske aksiale oppløsningen være 30 μm i henhold til 0,88 c / Δf, hvor c er lydhastigheten i bløtvev og Δf er frekvensbåndbredden til ultralydsområdet . I tillegg vil sideløsningen variere langs aksialretningen for både OR-PAM 20 og AR-PAM 32 . De rapporterte sidebeslutninger her er på fokusplanet.

Figur 3a viser bildet av det svarte båndet på kyllingvevet. Et enkelt B-skanningsbilde ble tatt med både AR-PAM og OR-PAM. Figur 3b og Figur 3c viser det enkelte B-scan PA-bildet av henholdsvis AR-PAM og OR-PAM. Det fremgår av figur 3 b at AR-PAM-systemet tydelig kan bilde svart tape ned til ~ 7,8 mm under vevoverflaten. På samme måte, ved å bruke OR-PAM-systemet, var det mulig å tydelig bilde det svarte tapet ned til ~ 1,4 mm under vevoverflaten ( figur 3c ). Signal-til-støy-forholdet (SNR) ble også bestemt av bildene. SNR er definert som V / n , hvor <Em> V er topp-til-topp-PA-signalamplituden og n er standardavviket til bakgrunnsstøyen. SNR målt ved 4,6 mm og 7,8 mm bildedybder var henholdsvis 2,6 og 1,4. For OR-PAM var SNR ved en 1,4 mm billeddybde 1,4. For å demonstrere den biologiske avbildningskapasiteten til det byttbare AR-OR PAM-systemet ble in vivo blodvaskulering avbildet utført på et musearm. Et fotografi som viser den vaskulære anatomien til det levende musørøret som brukes til avbildning, er vist i figur 4a . Ved å bruke AR-PAM ble en 10 mm x 6 mm skannegruppe avbildet, med en trinnstørrelse på 15 μm i Y-retningen og 30 μm i X-retningen. Bildene tok 10 min å fullføre. For øyeblikket kjøper bildesystemet bare data i én retning; Oppkjøpetiden kan reduseres til nesten halvparten ved å modifisere programmet for å få en toveis dataoppkjøpsevne. Et kartbilde av AR-PAM er show i figur 4B. Nærbildet av interesseområdet er vist i figur 4c . Et lignende område skannet med OR-PAM, med en trinnstørrelse på 3 μm i Y-retningen og 6 μm i X-retningen, vises i figur 4 d . Bildene tok 46 minutter å fullføre. Nærbildet av interesseområdet er vist i figur 4 e . OR-PAM kan tydelig løse enkelte kapillærer, som AR-PAM ikke kan løse. AR-PAM kan løse fartøy tykkere enn 45 μm.

I sammendraget er det utviklet et omstillbart AR-OR-PAM-system som kan oppnå høyoppløselig bildebehandling med tett optisk fokusering, samt dypvevsbilding med akustisk fokusering. Utførelsen av det byttbare AR-OR-PAM-systemet ble kvantifisert ved bruk av lateral oppløsning og bildedimensjon. In vivo studIes ble også utført for å vise sin biologiske bildeevne. Dette byttbare fotoakustiske mikroskopisystemet kan gi høy tidsmessig og romlig oppløsning, noe som gjør systemet viktig for applikasjoner, inkludert avbildning av angiogenese, narkotika respons, etc. , hvor imaging enkeltkapillarier samt dype vasculaturer er viktig. Ytterligere modifikasjoner eller forbedringer av systemet kan gjøres ved å bytte ut den hjemmelagde bytteplaten med en 10 cm kjøring motorisert fase (y-akse). Den laterale oppløsningen til OR-PAM kan forbedres ytterligere ved å korrigere bølgefrontavvikene. Å levere en høyere pulsenergi til AR-PAM vil også forbedre SNR og bildedybder.

I tilfelle av OR-PAM, forutsatt at den optiske fokus er 150 μm under hudoverflaten for in vivo avbildning, var overflateplaststørrelsen 22,5 μm i diameter. Å levere en enkelt laserpuls på 90 nJ gir en maXimal puls energi på 20,4 mJ / cm 2 . For AR-PAM var laserfokuset 2 mm i diameter. Å levere en enkelt laserpuls på 50 μJ gir maksimal puls energi ved brennpunktet 1,6 mJ / cm 2 , godt innenfor ANSI-sikkerhetsgrensen på 20 mJ / cm 2 , 33 .

Figur 1
Figur 1 : Skjematisk av AR-OR-PAM Imaging System. ( A ) BS: stråle sampler, NDF: nøytralt tetthetsfilter, RAP - Høyre vinkelprisme, PD: fotodiode, CL: kondensorlins, PH: pinhole, FC: fiberkobling, UST: ultralydsgiver, MMF: multimodefiber, SMF: Single-mode fiber, DAQ: datainnsamlingskort, TS: oversettelsestrinn, Con.L: konisk linse, L1: konveks linse, L2 og L3: achromatisk linse, RA: vinkelpris prisme, RP: rhomboid prisme, OC: optisk Kondensator, M: mIrror, SP: glideskive, LT: objektivrør, TM: oversettelsesfeste, KMM: kinematisk speilfeste og AL: akustisk linse. ( B ) Foto av prototypen AR-OR-PAM-systemet. ( C ) Nærbilde av den optoakustiske strålekombinatoren. ( D ) Nærbilde av den optiske kondensatoren med en UST i midten. Gjengitt fra referanse 34 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 2
Figur 2 : Lateral oppløsningstest av AR-OR-PAM-systemet: Lateral oppløsning estimert ved avbildning av gull nanopartikler ~ 100 nm i diameter. Svart (*) prikker: fotoakustisk signal; Blå linje: Gaussisk-tilpasset kurve for ( a ) AR-PAM og ( b )OR-PAM. Innlegget viser det representative AR-PAM bildet i (a) og OR-PAM bildet i (b) av enkeltgull nanopartikkelen. Gjengitt fra referanse 34 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figur 3
Figur 3 : Imaging Depth Measurements: Single B-scan PA-bilde av et svart tape satt skråt på kyllingvevet. ( A ) Skjematisk diagram. ( B ) AR-PAM bilde. ( C ) OR-PAM bilde. Gjengitt fra referanse 34 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.


Figur 4 : Fotoakustisk bilde in vivo av et musearm: ( a ) Fotografi av musenes ørevaskulatur . (B) AR-PAM bilde. ( C ) Nærbilde av interesseområdet (ROI) i ( b ), som vist med en hvit strekket linje. ( D ) OR-PAM-bilde. ( E ) Region av interesse (ROI) i ( d ), som vist med en hvit prikket linje. ( F ) Nærbilde av ROI-hvite linjen i (e) som viser en enkelt kapillær. Gjengitt fra referanse 34 med tillatelse. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Som konklusjon er det utviklet et omstillbart AR- og OR-PAM-system som kan oppnå både høyoppløselig bildebehandling ved lavere billeddybder og billeddannelse med lavere oppløsning ved høyere billeddybder. Den laterale oppløsning og bildedybde av det omstillbare systemet ble bestemt. Fordelene ved dette byttbare PAM-systemet inkluderer: (1) bildeoppløsningen med høy oppløsning ved bruk av tett optisk fokusering; (2) dypvevsbildingen ved hjelp av akustisk fokusering; 3) mørkfeltbelysningen for AR-PAM, som forhindrer sterke PA-signaler fra å vises på hudoverflaten; 4) Evnen til å holde prøven på ett sted, uten å flytte det mellom forskjellige systemer; 5) muligheten til å unngå å bruke flere lasere og skanningstrinn; Og 6) minimal bruk av hjemmelagde komponenter. Dette er den første rapporterte kombinasjonen av OR-PAM og mørkfelt AR-PAM som gir høyoppløselige, grunnleggende bilder og lavoppløsningsdybdebilder av samme prøve uten å flytte prøven / object. Bruken av samme skannefase og laser gjør systemet effektivt og kostnadseffektivt. Det kombinerte systemet har en 4 μm lateral oppløsning med en 1,4 mm billeddybde, samt en 45 μm lateral oppløsning med en 7,8 mm billeddybde. Systemet er laget av et optisk bursystem med minimal hjemmelagde komponenter, noe som gjør det enklere å montere, justere og bytte mellom AR og OR PAM. Det kombinerte skannehode er kompakt og kan enkelt monteres på en enkelt skanning. Ved bruk av det kombinerte systemet ble in vivo imaging vellykket demonstrert.

Det utviklede systemet kan brukes til preklinisk avbildning. Viktige prekliniske anvendelser inkluderer bildebehandling av angiogenese, tumormikroenmiljøer, mikrocirkulasjon, narkotika respons, hjernefunksjoner, biomarkører og genaktiviteter. Begrensningene i systemet inkluderer skanningstiden. Det er behov for en lang skanningstid, men det kan reduseres ved å skaffe data i botH retninger. Samtidig bildeoppkjøp mellom OR-PAM og AR-PAM er ikke mulig for øyeblikket. For øyeblikket er det nødvendig å skifte manuelt mellom OR-PAM og AR-PAM, noe som kan unngås ved å bruke et oversettelsesstadium som har minst 10 cm Y-retningsbevegelse. Kritiske trinn i protokollen inkluderer konfokal bestemmelse av det optiske og akustiske fokuset; Oppnåelsen av en optisk spotstørrelse mindre enn 5 μm for OR-PAM, til bilde-enkeltkapillærer; Og utformingen av den optoakustiske strålekombinatoren for OR-PAM og den optiske kondensatoren for AR-PAM.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle dyreforsøk ble utført i henhold til godkjente retningslinjer og forskrifter fra Institutt for dyrepleie og bruk av Nanyang Technological University, Singapore (Animal Protocol Number ARF-SBS / NIE-A0263). Forfatterne har ingen relevante økonomiske interesser i manuskriptet og ingen andre potensielle interessekonflikter å avsløre.

Acknowledgments

Forfatterne vil gjerne anerkjenne den økonomiske støtten fra et Tier 2-tilskud finansiert av Utdanningsdepartementet i Singapore (ARC2 / 15: M4020238). Forfatterne vil også gjerne takke Mr. Chow Wai Hoong Bobby for hjelpen til maskinbutikken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Q-switched Nd:YAG laser Edgewave BX80-2-L Pump laser 
Credo-High Repetition Rate Dye Laser Spectra physics CREDO-DYE-N Dye laser
Precision Linear Stage Physik Instrumente PLS 85  XY raster scanning stage
Translation stage Physik Instrumente VT 80  Confocal determine
Mounted Silicon photodiode Thorlabs SM05PD1A Triggering/Pulse variation
Motorized continuous Rotational stage  Thorlabs CR1/M-Z7 Diverting laser beam
Mounted Continuously Variable ND Filter Thorlabs NDC-50C-4M Intensity variable
Fiber Patch Cable Thorlabs M29L01 Multimode fiber
Microscope objective Newport M-10X Objective 
XY translating mount Thorlabs CXY1 Translating mount
Plano convex lens Thorlabs LA1951 Collimating lens
Conical lens  Altechna APX-2-B254 Ring shape beam
Translation stage Thorlabs CT1 Translating stage
Optical condenser Home made
Ultrasonic transducer Olympus-NDT V214-BB-RM 50MHz transducer
Plano concave lens Thorlabs LC4573 Acoustic lens
Pulser/Receiver Olympus-NDT 5073PR Pulse echo amplifier 
Mounted standard iris Thorlabs ID12/M Beam shaping
Plano convex lens Thorlabs LA4327 Condenser lens
Mounted precision pinhole Thorlabs P50S Spatial filtering
Single mode fiber patch cable Thorlabs P1-460B-FC-1 Single mode fiber
Fiber coupler Newport F-91-C1 Single mode coupling
Achromatic doublet lens Edmund Optics 32-317 Achromatic doublet
Protected silver elliptical mirror Thorlabs PFE10-P01 Mirror
Right angle kinematic mirror mount Thorlabs KCB1 Mirror mount
Z-Axis Translation Mount Thorlabs SM1Z z translator
Lens tube Thorlabs SM05L10
UV Fused Silica Right-Angle Prism Thorlabs PS615 Right angle prism
Rhomboid prism Edmund Optics 47-214 Shear wave
Dimethylpolysiloxane Sigma Aldrich DMPS1M Silicon oil
Amplifier Mini Circuits ZFL-500LN Amplifier
16 bit high speed digitizer Spectrum M4i.4420 Data acquisition card
Oscilloscope Agilent Technologies DS06014A
Mice  InVivos Pte.Ltd ICR Animal model
Ultrasound gel  Progress/parker acquasonic gel PA-GEL-CLEA-5000 Acoustic coupling
Water tank Home made
Translation stage Homemade Switching AR-OR
Gold nanoparticles Sigma Aldrich 742031 Lateral resolution
Sterile ocular ointment Alcon Duratears Animal imaging
1951 USAF resolution test target Edmund Optics 38257 Confocal alignment
Data acquisition software National Instrument Labview Home made software using Labview
Image Processing software Mathworks Matlab Home made program using Matlab

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hu, S., Wang, L. V. Photoacoustic imaging and characterization of the microvasculature. J Biomed Opt. 15, 011101-01-011101-15 (2010).
  2. Ntziachristos, V. Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology. Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).
  3. Wang, L. V., Yao, J. A practical guide to photoacoustic tomography in the life sciences. Nat Methods. 13, 627-638 (2016).
  4. Zhou, Y., Yao, J., Wang, L. V. Tutorial on photoacoustic tomography. J Biomed Opt. 21 (6), 061007 (2016).
  5. Upputuri, P. K., Sivasubramanian, K., Mark, C. S. K., Pramanik, M. Recent Developments in Vascular Imaging Techniques in Tissue Engineering and Regenerative Medicine. BioMed Res Intl. 2015, (2015).
  6. Yao, J., Wang, L. V. Photoacoustic Brain Imaging: from Microscopic to Macroscopic Scales. Neurophotonics. 1 (1), 011003-1-011003-13 (2014).
  7. Wang, L. V., Hu, S. Photoacoustic Tomography: In Vivo Imaging from Organelles to Organs. Science. 335 (6075), 1458-1462 (2012).
  8. Beard, P. Biomedical photoacoustic imaging. Interface Focus. 1 (4), 602-631 (2011).
  9. Pan, D. Molecular photoacoustic imaging of angiogenesis with integrin-targeted gold nanobeacons. FASEB J. 25 (3), 875-882 (2011).
  10. Cai, X., Kim, C., Pramanik, M., Wang, L. V. Photoacoustic tomography of foreign bodies in soft biological tissue. J Biomed Opt. 16 (4), 046017 (2011).
  11. Pan, D. Near infrared photoacoustic detection of sentinel lymph nodes with gold nanobeacons. Biomaterials. 31 (14), 4088-4093 (2010).
  12. Wang, L. V. Multiscale photoacoustic microscopy and computed tomography. Nat. Photon. 3 (9), 503-509 (2009).
  13. Zhang, E. Z., Laufer, J. G., Pedley, R. B., Beard, P. C. In vivo high-resolution 3D photoacoustic imaging of superficial vascular anatomy. Phys. Med. Biol. 54 (4), 1035-1046 (2009).
  14. Park, S., Lee, C., Kim, J., Kim, C. Acoustic resolution photoacoustic microscopy. Biomed.l Eng. Lett. 4 (3), 213-222 (2014).
  15. Zhang, H. F., Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. Functional photoacoustic microscopy for high-resolution and noninvasive in vivo imaging. Nat. Biotechnol. 24 (7), 848-851 (2006).
  16. Maslov, K., Stoica, G., Wang, L. V. In vivo dark-field reflection-mode photoacoustic microscopy. Opt Lett. 30 (6), 625-627 (2005).
  17. Strohm, E. M., Moore, M. J., Kolios, M. C. Single Cell Photoacoustic Microscopy: A Review. IEEE J Sel Top Quantum Electron. 22 (3), 6801215 (2016).
  18. Kim, J. Y., Lee, C., Park, K., Lim, G., Kim, C. Fast optical-resolution photoacoustic microscopy using a 2-axis water-proofing MEMS scanner. Sci Rep. 5, 07932 (2015).
  19. Matthews, T. P., Zhang, C., Yao, D. K., Maslov, K., Wang, L. V. Label-free photoacoustic microscopy of peripheral nerves. J Biomed Opt. 19 (1), 016004 (2014).
  20. Hai, P., Yao, J., Maslov, K. I., Zhou, Y., Wang, L. V. Near-infrared optical-resolution photoacoustic microscopy. Opt Lett. 39 (17), 5192-5195 (2014).
  21. Danielli, A. Label-free photoacoustic nanoscopy. J Biomed Opt. 19 (8), 086006 (2014).
  22. Zhang, C. Reflection-mode submicron-resolution in vivo photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 17 (2), 020501 (2012).
  23. Hu, S., Maslov, K., Wang, L. V. Second-generation optical-resolution photoacoustic microscopy with improved sensitivity and speed. Opt Lett. 36 (7), 1134-1136 (2011).
  24. Maslov, K., Zhang, H. F., Hu, S., Wang, L. V. Optical-resolution photoacoustic microscopy for in vivo imaging of single capillaries. Opt Lett. 33 (9), 929-931 (2008).
  25. Upputuri, P. K., Krishnan, M., Pramanik, M. Microsphere enabled sub-diffraction limited optical resolution photoacoustic microscopy: a simulation study. J Biomed Opt. 22, 045001 (2017).
  26. Upputuri, P. K., Wen, Z. B., Wu, Z., Pramanik, M. Super-resolution photoacoustic microscopy using photonic nanojets: a simulation study. J Biomed Opt. 19 (11), 116003 (2014).
  27. Allen, T. J. Novel fibre lasers as excitation sources for photoacoustic tomography and microscopy et al. Proc SPIE. , 97080W (2016).
  28. Xing, W., Wang, L., Maslov, K., Wang, L. V. Integrated optical-and acoustic-resolution photoacoustic microscopy based on an optical fiber bundle. Opt Lett. 38 (1), 52-54 (2013).
  29. Estrada, H., Turner, J., Kneipp, M., Razansky, D. Real-time optoacoustic brain microscopy with hybrid optical and acoustic resolution. Laser Phys Lett. 11 (4), 045601 (2014).
  30. Jeon, S., Kim, J., Kim, C. In vivo switchable optica- and acoustic - resolution photoacoustic microscopy. Proc SPIE. , 970845 (2016).
  31. Song, W. Fully integrated reflection-mode photoacoustic, two-photon, and second harmonic generation microscopy in vivo. Sci Rep. 6, 32240 (2016).
  32. Park, J., et al. Delay-multiply-and-sum-based synthetic aperture focusing in Photoacoustic microscopy. J Biomed Opt. 21 (3), 036010-10 (2016).
  33. ANSI Standard Z136.1-2000. American National Standard for Safe Use of Lasers. , NY. (2000).
  34. Moothanchery, M., Pramanik, M. Performance Characterization of a Switchable Acoustic Resolution and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy System. Sensors. 17 (2), 357 (2017).

Tags

Bioengineering Akustisk oppløsning fotoakustisk mikroskopi optisk oppløsning fotoakustisk mikroskopi fotoakustisk avbildning fotoakustikk, AR-PAM OR-PAM mikroskopi kombinert mikroskopisystem
Byttbar akustisk og optisk oppløsning Photoacoustic Microscopy for<em&gt; In vivo</em&gt; Små dyr blodprodusering av blodkar
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Moothanchery, M., Sharma, A.,… More

Moothanchery, M., Sharma, A., Pramanik, M. Switchable Acoustic and Optical Resolution Photoacoustic Microscopy for In Vivo Small-animal Blood Vasculature Imaging. J. Vis. Exp. (124), e55810, doi:10.3791/55810 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter